Name: Metodi per valutare il ruolo di c-Fos e Dusp1 nella dipendenza dellOncogene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Scopri metodi per validare c-Fos e Dusp1 come bersagli terapeutici nella leucemia utilizzando modelli murini umanizzati e tecniche genetiche. Questo protocollo è applicabile a diversi tumori guidati da chinasi.

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Gli autori sono grati a G. Q. Daley per fornire le cellule BaF3 e WEHI e Reya T. per la MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP costruisce. Gli autori sono grati a Carroll M. per la fornitura dei campioni da crisi di scoppio CML. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni a M.A. da NCI (1RO1CA155091), la leucemia Research Foundation e Fondazione V e da NHLBI (R21HL114074-01).

<ol><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr%2Fabl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247, 824-830 (1990).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).</li>
<li>Mahon, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discontinuation+of+imatinib+in+patients+with+chronic+myeloid+leukaemia+who+have+maintained+complete+molecular+remission+for+at+least+2+years%3A+the+prospective%2C+multicentre+Stop+Imatinib+%28STIM%29+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial.</a> Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).</li>
<li>O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+limits+of+targeted+therapy+in+chronic+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia.</a> Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).</li>
<li>Rousselot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imatinib+mesylate+discontinuation+in+patients+with+chronic+myelogenous+leukemia+in+complete+molecular+remission+for+more+than+2+years%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years.</a> Blood. 109, 58-60 (2007).</li>
<li>Krause, D. S., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+kinases+as+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tyrosine kinases as targets for cancer therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).</li>
<li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+balance+between+life+and+death%3A+targeted+cancer+therapy+and+%22oncogenic+shock%22%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock".</a> Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).</li>
<li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+addiction%3A+setting+the+stage+for+molecularly+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy.</a> Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).</li>
<li>Weinstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer.+Addiction+to+oncogenes--the+Achilles+heal+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer.</a> Science. 297, 63-64 (2002).</li>
<li>Corbin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chronic+myeloid+leukemia+stem+cells+are+insensitive+to+imatinib+despite+inhibition+of+BCR-ABL+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).</li>
<li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487, 500-504 (2012).</li>
<li>Wilson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+potential+for+growth-factor-driven+resistance+to+anticancer+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors.</a> Nature. 487, 505-509 (2012).</li>
<li>Kesarwani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+c-FOS+and+DUSP1+abrogates+intrinsic+resistance+to+tyrosine-kinase+inhibitor+therapy+in+BCR-ABL-induced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-fos+regulates+neuronal+excitability+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">c-fos regulates neuronal excitability and survival.</a> Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).</li>
<li>Dorfman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+erp%2Fmkp-1+gene+does+not+affect+mouse+development%3A+normal+MAP+kinase+activity+in+ERP%2FMKP-1-deficient+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts.</a> Oncogene. 13, 925-931 (1996).</li>
<li>Padhye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorocurcumins+as+cyclooxygenase-2+inhibitor%3A+molecular+docking%2C+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice.</a> Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).</li>
<li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeting+of+quiescent+chronic+myelogenous+leukemia+stem+cells+by+histone+deacetylase+inhibitors+in+combination+with+imatinib+mesylate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate.</a> Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).</li>
<li>Koschmieder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+chronic+phase+of+myeloid+leukemia+with+expansion+of+hematopoietic+stem+cells+in+a+transgenic+model+of+BCR-ABL+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis.</a> Blood. 105, 324-334 (2005).</li>
<li>Abraham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+of+p53+and+c-MYC+selectively+eliminates+leukaemic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells.</a> Nature. 534, 341-346 (2016).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+p53+by+SIRT1+inhibition+enhances+elimination+of+CML+leukemia+stem+cells+in+combination+with+imatinib%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib.</a> Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).</li>
<li>Qiagen-miRNAeasy kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources">https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources</a> (2018).</li>
<li>DNA-free DNA removal kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s</a> (2018).</li>
<li>SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051</a> (2018).</li>
<li>Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html">https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html</a> (2018).</li>
<li>Abarrategi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+human+bone+marrow+niche+in+mice%3A+From+host+bone+marrow+engraftment+to+bioengineering+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches.</a> Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).</li>
<li>Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+screening+and+validation+of+resistant+mutations+against+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Per la maggior parte delle cellule tumorali, la risposta terapeutica a TKI è mediata da un blocco di tirosina-chinasi-oncoproteina segnali a cui il tumore è assuefatto. Tuttavia, relativamente poco è conosciuto circa come una minoranza delle cellule tumorali, contribuendo alla MRD escape l'oncogene dipendenza e terapia4. Studi recenti hanno rivelato che la segnalazione di fattore di crescita media farmacoresistenza in leucemia e tumori solidi dell'organo. Ciò suggerisce che vari meccanismi molecol...

Attività della chinasi della tirosina costitutiva dell'oncogene di fusione BCR-ABL1 provoca CML, che fornisce una spiegazione razionale per indirizzare l'attività della chinasi di piccole molecole inibitrici. Il successo di TKI nel trattamento di pazienti affetti da LMC ha rivoluzionato il concetto di terapia mirata1,2. Successivamente, la terapia anti-chinasi come medicina di precisione è stata sviluppata per parecchie altre malignità, compreso i tumori solidi. Finora, più di trenta gli inibitori della chinasi sono stati approvati dalla FDA stato Uniti per il trattamento di vari tumori maligni. Mentre TKI trattamento è molto efficace nel sopprimere la malattia, non è curativo. Inoltre, una piccola popolazione di cellule tumorali persiste durante il trattamento: il MRD3,4,5. Anche i pazienti che hanno mostrato la remissione completa sono lasciati con MRD, che alla fine risultati nella ricaduta se non continuamente repressa. Di conseguenza, l'eliminazione delle cellule MRD è necessario per raggiungere una risposta durevole o curativa. CML rappresenta un paradigma prezioso per definire il concetto di medicina di precisione, meccanismi di oncogenesi, la terapeutica razionale destinazione-diretto, progressione di malattia e resistenza ai farmaci. Tuttavia, ancora oggi, il meccanismo di guida morte TKI-indotta delle cellule in cellule di cancro non è pienamente compreso, né perché sono intrinsecamente resistenti a TKI4,6celle MRD (costituite da cellule staminali leucemiche [LSCs]). Tuttavia, il fenomeno della "dipendenza dell'oncogene" chinasi mutante oncoproteina è implicato nell'efficacia TKI dove l'inibizione acuta dell'oncogene mirati da TKI provoca uno shock oncogeno che conduce a una risposta massiccia proapoptotic o quiescenza in cella contesto-dipendente6,7,8,9. Tuttavia, la base meccanicistica della dipendenza dell'oncogene è carente. Studi recenti hanno implicato che fattore di crescita di segnalazione abroga la dipendenza dell'oncogene e di conseguenza conferisce resistenza al TKI terapia10,11,12. Di conseguenza, per comprendere il meccanismo di dipendenza dell'oncogene, abbiamo effettuato delineamento di espressione intero genoma da BCR-ABL1 addicted e cellule nonaddicted (sviluppate con fattori di crescita), che ha rivelato che il c-Fos e Dusp1 sono mediatori critici di oncogene dipendenza13. La delezione genetica di c-Fos e Dusp1 è letale per BCR-ABL1-espressione sintetiche cellule e i topi utilizzati nell'esperimento non hanno sviluppato la leucemia. Inoltre, l'inibizione di c-Fos e DUSP1 di piccole molecole inibitrici curata LMC BCR-ABL1-indotta in topi. I risultati mostrano che i livelli di espressione di c-Fos e Dusp1 definiscono la soglia apoptotica in cellule tumorali, tale che i livelli più bassi conferiscono sensibilità ai farmaci, mentre livelli più elevati causano resistenza alla terapia13.
Per identificare i geni che guida la dipendenza dell'oncogene, abbiamo effettuato diversi esperimenti in presenza di fattore di crescita e un TKI (imatinib) utilizzo del mouse - e cellule di derivazione paziente CML (K562) del profilo di espressione di intero genoma. Questi dati sono stati analizzati in parallelo con CML paziente set di dati ottenuti da CD34+ cellule staminali ematopoietiche prima e dopo il trattamento con imatinib. Questa analisi ha rivelato tre geni (un fattore di trascrizione [c-Fos], specificità dual fosfatasi 1 [Dusp1] e una proteina di legame al RNA [Zfp36]) che comunemente sono sovraregolati in cellule TKI-resistenti. Per convalidare l'importanza di questi geni che conferiscono resistenza ai farmaci, abbiamo effettuato la dettagliata analisi in vitro e in vivo . I livelli di espressione di questi geni sono stati confermati mediante qPCR in tempo reale (RT-qPCR) e western blotting in cellule resistenti alla droga. Ulteriormente, la sovraespressione di cDNA e atterramento di shRNA forcine di c-Fos, Dusp1, e Zfp36 ha rivelato che elevati c-Fos e Dusp1 espressioni sono sufficienti e necessarie per conferire resistenza TKI. Di conseguenza, abbiamo effettuato una convalida in vivo utilizzando modelli murini con c-Fos e Dusp1 solo. Per la validazione genetica di c-Fos e Dusp1, abbiamo creato ROSACreERT-inducible c-Fosfl/fl topi (knockout condizionale)14 e li ha attraversato con Dusp1- / - (dritto knockout)15 per rendere ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1- / - topi transgenici doppio. Cellule derivate da midollo osseo c-Kit+ (da c-Fosfl/fl-, Dusp1- / -- e c-Fosfl/flDusp1- / -) che esprimono BCR-ABL1 sono stati analizzati in vitro in un saggio di formazione di colonie unit (CFU) e in vivo da trapianto di midollo osseo in topi irradiati letalmente, per testare il requisito di c-Fos e Dusp1 da soli o insieme a sviluppo di leucemia. Allo stesso modo, le inibizioni chimiche di c-Fos di DFC (difluorinated curcumina)16 e Dusp1 di BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 sono stati testati in vitro e in vivo usando BCR-ABL1-esprimendo, osso cellule derivate dal midollo c-Kit+ dal mouse wild type (WT). Per confermare la richiesta di c-Fos e Dusp1 in cellule staminali leucemiche, abbiamo utilizzato un modello murino CML dove BCR-ABL1 specificamente è stata indotta in sue cellule staminali di doxiciclina (esprime Tet-transactivator sotto cellule staminali murine leucemia (SCL) gene 3' enhancer regolamento)18,19. Abbiamo usato il midollo osseo Lin–cellule c-Kit di Sca++ (TSS) da questi topi in un'analisi di trapianto in vivo. Inoltre, abbiamo stabilito i livelli di phopsho-p38 e l'espressione di IL-6 come biomarcatori di farmacodinamica per Dusp1 e l'inibizione di c-Fos, rispettivamente, in vivo. Infine, di estendere lo studio per rilevanza umana, CD34 paziente-derivati+ cellule (equivalente alle cellule c-Kit+ da topi) sono stati sottoposti a lungo termine saggi in vitro d'inizio coltura cellulare (LTCIC) e un modello di topo umanizzato in vivo di CML20,21. I topi immunodeficienti sono stati trapiantati con cellule di CML CD34 +, seguite da trattamento farmacologico e l'analisi di sopravvivenza delle cellule leucemiche umane.
In questo progetto, sviluppiamo metodi per l'identificazione del target e convalide utilizzando strumenti sia genetici e chimici, utilizzando diversi modelli preclinici. Questi metodi possono essere applicati con successo per convalidare altri obiettivi lo sviluppo di modalità di chimica per lo sviluppo terapeutico.

<table><tbody><tr><td>Materiali biologici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-016-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Frammento di fibronectina umana ricombinante con retroNectina</td><td>Takara</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434 (metilcellulosa per CFU di topo)</td><td>Cellule staminali</td><td>3434</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult H4434 Classic (metilcellulosa per CFU umana)</td><td>Cellule staminali</td><td>4434</td><td></td></tr><tr><td>4-idrossitamoxifene</td><td>Sigma</td><td>H6278</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante Murino SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-275</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante Murino Flt3-Ligando</td><td>Prospec</td><td>CYT-340</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante Urina IL-6</td><td>Prospec</td><td>CYT-350</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante Urina IL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>DFC</td><td>LKT Laboratories Inc.</td><td>D3420</td><td></td></tr><tr><td>BCI</td><td>Chemzon Scientific</td><td>NZ-06-195</td><td></td></tr><tr><td>Imatinib</td><td>LC Laboratorio</td><td>I-5508</td><td></td></tr><tr><td>Curcumina</td><td>Sigma</td><td>458-37-7</td><td></td></tr><tr><td>NDGA</td><td>Sigma</td><td>500-38-9</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Cellgro (corning)</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta biologico</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 1x</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Cellgro (corning)</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-005-CL</td><td>5 mg/mL stock in acqua</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Gibco (life technologies)</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Protamina solfato</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>5 mg/mL stock in acqua</td></tr><tr><td>Soluzione di Trypan Blue (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Roche</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; Filtro a dischi acro M</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m nylon cell stariner</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>FICOL (Histopaque 1083) (polisaccarosio)</td><td>Simga</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail Inibitore della Proteasi</td><td>Roche</td><td>CO-RO</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail Inibitore della Fosfatasi 2</td><td>Sigma</td><td>P5762</td><td></td></tr><tr><td>Membrana di nitrocullulosio</td><td>Bio-Rad</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Substrato di durata estesa (substrato di chemiluminescenza)</td><td>Thermo Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>CD5</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience</td><td>13-0112-75</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (B220)</td><td>BD biosciences</td><td>553092</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0453-85</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0454-83</td><td></td></tr><tr><td>hCD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Biotin-FITC</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-857&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-7-4</td><td>eBioscience</td><td>MA5-16539</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter-119</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-75</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>558612</tr><tr><td>CD117 APC&nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>553356</tr><tr><td>BD Pharm Lyse</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555899</tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm (Soluzione fissante e permeabilizzante)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554714</tr><tr><td>BD Perm/Lavaggio&nbsp; (permeabilizzazione e soluzione di lavaggio per flusso fosfogenico)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554723</tr><tr><td>fosfo p38</td><td>Tecnologie di segnalazione cellulare</td><td>4511S</td><td></td></tr><tr><td>totale p38</td><td>Tecnologie di segnalazione cellulare</td><td>9212</td><td></td></tr><tr><td>Controllo IgG del topo</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554121</tr><tr><td>Alexa Flour 488 coniugato&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Invitrogen</td><td>K278001</td><td></td></tr><tr><td>2x HBS</td><td>Invitrogen</td><td>K278002</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Provette per capillari sanguigni</td><td>Fisher</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per prelievo di sangue</td><td>Giene Bio-One</td><td>450480</td><td></td></tr><tr><td>Siero di vitello neonato</td><td>Atlanta biologico</td><td>S11295</td><td></td></tr><tr><td>Eritropoieina</td><td>Amgen</td><td>5513-267-10</td><td></td></tr><tr><td>umano SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-255</td><td></td></tr><tr><td>Umano IL-3</td><td>Prospec</td><td>CYT-210</td><td></td></tr><tr><td>G-SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-220</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Prospec</td><td>CYT-221</td><td></td></tr><tr><td>MyeloCult (terreni per il test LTCIC)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5100</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone Sodium Hemisuccinate</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7904</td><td></td></tr><tr><td>MEM alpha</td><td>Gibco</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc Lo-Dose u-100 siringa da insulina 28 G1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Mortor pestello</td><td>Coor tek&nbsp;</td><td>60316 e 60317</td><td></td></tr><tr><td>Isoflorane (Isothesia TM)</td><td>Butler Schien</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>100 mg/mL stock in acqua</td></tr><tr><td>Bacto agar (agar)</td><td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Brodo formidabile</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina chow TestDiet.com</td><td></td><td>52662</td><td>RMH1500 modificato, autoclavabile 5LK8&nbsp; con 0,0625% di doxiciclina&nbsp;</td></tr><tr><td>Tamoxifene</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Iodonitrotetrazolio cloruro&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I10406</td><td></td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Kit per sangue e tessuti</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green (taq polimerasi con colorante Green loadign</td>)<td>Promega</td><td>M1722</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit&nbsp; (Kit di isolamento dell'RNA)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td></td></tr><tr><td>Kit Dnase senza DNA (trattamento con DNAsi per RT PCR)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III First Strand Synthesis (trascrittasi inversa per la sintesi di cDNA)</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green (miscela di taq polimerasi con colorante intercalante verde per qPCR)</td><td>Kit</td><td></td> Bio-Rad 1725270 <td></td></tr><tr><td>CD117 MicroBead</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-224</td><td></td></tr> Incubatore <tr><td>umano a lungo termine per l'avvio di colture cellulari</td><td>Stemp Cell Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAPCO series 8000 WJ CO2 incubatore</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pivot bucket rotor cetrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10 contatore di cellule automatizzato</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-1000 Termociclatore</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Real Plex 2</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Imaging System (sistema di imaging per gel e western blots)</td><td>Bio-RAD</td><td>17001401</td><td></td></tr><tr><td>Hemavet (contatore di boold)</td><td>Drew-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II (analizzatore FACS)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fortessa I (analizzatore FACS)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaII (Smistatore FACS)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Irradiator</td><td>&nbsp;J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA</td><td>Mark I Modello 68A</td><td>sorgente Cs 137</td></tr><tr><td>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scl-tTA&nbsp;</td><td>Dott.ssa Claudia Huettner' s laboratorio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BoyJ&nbsp;</td><td>impianto di carote di topo presso CCHMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6&nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NSGS</td><td>impianto di carotaggio del topo presso CCHMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-&nbsp;</td><td>Prodotto in casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2/c-Fosfl/fl</td><td>Prodotto in casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaF3</td><td>Regalo da George Daley, Harvard Medical School, Boston</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WEHI</td><td>Regalo da George Daley, Harvard Medical School, Boston</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CML-CD34+ e cellule</td> <td>CD34+ normaliOspedale universitario, Università di Cincinnati</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metodi per valutare il ruolo di c-fos e dusp1 nella dipendenza dell'oncogene

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

La dimostrazione di inibitori della tirosina chinasi (TKI) nel trattamento della leucemia mieloide cronica (CML) ha segnato una nuova era nella terapeutica del cancro. Tuttavia, una piccola popolazione di cellule non risponde al trattamento TKI, con conseguente malattia minima residua (MRD); anche il più potente TKI non riescono a sradicare queste cellule. Queste cellule MRD servono come un serbatoio di sviluppare una resistenza alla terapia. Non è noto perché TKI trattamento è inefficace contro le cellule MRD. Segnalazione di fattore di crescita è implicato nel sostenere la sopravvivenza delle cellule MRD durante il trattamento TKI, ma una comprensione meccanicistica è carente. Studi recenti hanno dimostrato che un elevato c-Fos e Dusp1 espressione come risultato di convergenti oncogeno e segnalazione in cellule di MRD di fattore di crescita mediano resistenza TKI. L'inibizione genetica e chimica di c-Fos e Dusp1 rende squisitamente sensibile a TKI CML e cure CML in entrambi i modelli genetici e umanizzato del mouse. Abbiamo identificato questi geni bersaglio usando i microarrays multiple da TKI-sensibile e - cellule resistenti. Qui, mettiamo a disposizione metodi per la convalida di destinazione utilizzando modelli murini in vitro e in vivo. Questi metodi possono essere applicati facilmente a qualsiasi destinazione per validazione genetica e sviluppo terapeutico.

Dipendenza dell'oncogene è stato implicato nell'efficacia terapeutica di TKI. Tuttavia, i meccanismi che guidano la dipendenza dell'oncogene non sono capiti. Abbiamo effettuato l'analisi dell'espressione genica imparziale multipli per identificare la componente genetica coinvolta nell'orchestrare la dipendenza. Queste analisi hanno rivelato il upregulation di tre geni, c-Fos, Dusp1 e Zfp36, in cellule tumorali che non sono dipendenti da oncogeno di segnalazione per la sopravvivenza e, qui...

Qui, descriviamo i protocolli per la validazione genetica e chimica di c-Fos e Dusp1 come un obiettivo della droga nella leucemia utilizzando modelli in vitro e in vivo genetica e umanizzato del topo. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi destinazione per validazione genetica e sviluppo terapeutico.

Metodi per valutare il ruolo di c-Fos e Dusp1 nella dipendenza dell'Oncogene

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi terapeutici del cancro, come l'identificazione di geni chiave coinvolti nella dipendenza da idrogeno. Il principale vantaggio di questa tecnica è che utilizza la dipendenza da oncogene che è comune a molti tumori guidati dalla chinasi, quindi è applicabile a più tipi di tumore. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla leucemia, può anche essere applicato ad altri sistemi, come tumori solidi come il cancro ai polmoni, tumori cerebrali e tumori pancreatici.Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa della mancanza di esperienza in biologia molecolare e fisiologia cellulare. Per iniziare, raccogli le ossa delle gambe da un topo eutanasiato. Pulire i tessuti dalle ossa con un bisturi.Quindi mettere le ossa in PBS freddo sul ghiaccio e schiacciare le ossa con un pestello. Successivamente, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro a celle da 70 micrometri in un tubo del tappo a vite da 50 millilitri con una pipetta da 10 millilitri. Lavare la malta e il pestello più volte con PBS freddo e aggiungere la sospensione cellulare al tubo da 50 millilitri.Successivamente

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Questo video descrive il protocollo per la convalida genetica trasferendo geni bersaglio utilizzando retrovirus in linee cellulari di leucemia mieloide cronica. I retrovirus agiscono come mediatori per trasferire materiale genetico nella cellula leucemica attraverso il processo chiamato trasduzione, che consente l'espressione a lungo termine del gene bersaglio. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi cellula bersaglio per la convalida genetica e lo sviluppo terapeutico.

Trasduzione retrovirale-mediata: un metodo per introdurre il gene bersaglio nelle cellule tumorali

Questo protocollo dimostra come generare tumori clonali fluorescente segnato, geneticamente definite nei dischi immaginali antennali (EAD) occhio Drosophila /. Esso descrive come sezionare la EAD e il cervello dalla terza larve instar e come elaborarli per visualizzare e quantificare i cambiamenti di espressione genica e l'invasività del tumore.

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

Identificare nuovi bersagli farmacologici che passano dai test preclinici agli studi sull'uomo è una priorità scientifica. A tal fine, qui descriviamo un approccio di genomica funzionale per esaminare l'impatto della deplezione genica sugli sferoidi delle linee cellulari tumorali, che modellano in modo più appropriato i tumori umani in vivo.

Utilizzando Genomica Funzionale screening per identificare gli obiettivi farmaco potenzialmente romanzo in Cancer Cell Culture Spheroid

Una libreria CRISPR/sgRNA è stata applicata a interrogare i geni di proteina-codificazione. Tuttavia, la fattibilità di una libreria di sgRNA per scoprire la funzione di un confine CTCF nella regolazione genica rimane inesplorata. Qui, descriviamo una raccolta di specifiche sgRNA loci HOX per delucidare la funzione dei confini CTCF in loci HOX .

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca Screening identificazione critico CTCF confini

I domini intrinsecamente disordinati sono importanti per la funzione del fattore di trascrizione di fusione oncogenica. Per indirizzare terapeuticamente queste proteine, è necessaria una comprensione più dettagliata dei meccanismi di regolazione impiegati da questi domini. Qui, usiamo la trascrittomica per mappare importanti caratteristiche strutturali del dominio EWS intrinsecamente disordinato nel sarcoma di Ewing.

Mappatura delle relazioni struttura-funzione dei fattori di trascrizione oncogenica disordinati utilizzando l'analisi trascrittomica

Questo studio descrive un protocollo per esplorare gli effetti dell'alterazione del pH sull'espressione dell'oncogene attraverso l'analisi RNA-seq di una linea cellulare duttale pancreatica.

Analisi dell'espressione di oncogeni con alterazioni del pH in una linea cellulare duttale pancreatica

Il test della cometa è un metodo efficace per rilevare danni al DNA compreso singolo e doppio filamento di DNA si rompe. Descriviamo la cometa alcalino e neutro saggi per misurare il danno del DNA in cellule di cancro per valutare l'effetto terapeutico della chemioterapia.

Valutazione In Vitro del DNA danni utilizzando test della cometa

Qui, presentiamo un'elettroforesi bidimensionale (2DE) accoppiata alla spettrometria di massa (MS) per separare e identificare adenoma pituitario umano tessuto proteoma, che presenta un modello 2DE buona e riproducibili. Molte proteine sono osservati in ogni spot 2DE analizzando nel complesso cancro proteoma con l'uso di MS ad alta sensibilità.

Elettroforesi bidimensionale accoppiata con spettrometria di massa per un'analisi del proteoma di tessuto umano Adenoma pituitario

Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un protocollo pratico per valutare la disfunzione mitocondriale è associata con affaticamento nei pazienti oncologici. Questo innovativo protocollo è ottimizzato per uso clinico che coinvolge phlebotomy solo standard e procedure di laboratorio di base.

Valutare il ruolo della funzione mitocondriale in affaticamento legato al cancro

I processi che governano l'invasione della vescica cancro rappresentano opportunità di biomarcatore e sviluppo terapeutico. Qui vi presentiamo un modello di invasione del cancro della vescica che incorpora 3-d cultura di sferoidi di tumore, time-lapse imaging e microscopia confocale. Questa tecnica è utile per definire le caratteristiche del processo invasivo e per lo screening di agenti terapeutici.

Sistema di coltura cellulare 3D per studiare l'invasione e la valutazione terapeutica nel cancro della vescica

Scopri metodi per validare c-Fos e Dusp1 come bersagli terapeutici nella leucemia utilizzando modelli murini umanizzati e tecniche genetiche. Questo protocollo è applicabile a diversi tumori guidati da chinasi.

Metodi per valutare il ruolo di c-Fos e Dusp1 nella dipendenza dell'Oncogene

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