Reazione a catena della polimerasi digitale per la variazione genetica in un paziente di poliposi adenomatosa familiare sporadica utilizzando il formato di Chip-in-a-tubo

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei test genetici, come il rilevamento del mosaicismo e i test genetici basati sulla biopsia liquida. Il vantaggio principale di questa tecnica è il rilevamento ad alto rendimento della frazione allelica a bassa variante. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi dei tumori, perché rilevare mutazioni oncogene con un'elevata sensibilità può contribuire alla medicina di precisione.

Inizia questo esperimento aggiungendo 10 L di tampone campione di DNA alle provette di una striscia da 8 provette. Quindi aggiungere 1 microlitro di scala di DNA alla prima provetta della striscia di 8 provette e un microlitro di campione di DNA genomico a ciascuna delle provette rimanenti. Utilizzare l'attacco della micropiastra per miscelare il contenuto della striscia da 8 provette agitando per un minuto.

Posizionare la striscia, i puntali delle pipette e un dispositivo in gel in uno strumento per elettroforesi. Premere il pulsante di avvio per avviare la corsa. Al termine dell'esecuzione, controllare l'elettroferogramma sul display per verificare che il marcatore inferiore contenuto nel tampone del campione di DNA sia assegnato correttamente sull'elettroferogramma.

In caso contrario, assegnare manualmente il marcatore nella modalità elettroferogramma del software. Quindi, nella modalità regione del software, specificare la regione dimensionale del DNA genomico per calcolare automaticamente la concentrazione di DNA. Aggiungete primer, sonde e DNA genomico progettati in precedenza a una nuova striscia di 8 provette per ottenere un volume totale di 15 L.Pipette su e giù per miscelare.

Aggiungere la piattaforma di carico sui trucioli incorporati nella nuova striscia a 8 tubi, quindi posizionare la striscia di tubi nel caricatore automatico. Assicurarsi che ci sia un contatto tra i trucioli e la piattaforma di carico. Quindi, posiziona un cursore di caricamento nella piattaforma e usa un tappo per tenere il cursore fuori dal caricatore.

Pipettare 15 L della miscela PCR vicino alla punta del cursore, quindi premere il pulsante del caricatore per far funzionare il caricatore per un minuto. Rimuovere la striscia di tubo dal caricatore dopo la corsa e posizionarla nel potenziatore di tenuta. Spingere con cautela il coperchio scorrevole e il bordo del coperchio superiore.

Far funzionare il potenziatore di tenuta per circa due minuti. Se la sigillatura è incompleta, indicata da una pozza di liquido, ripetere la corsa per un altro minuto. Aggiungere 230 L di liquido sigillante ai tubi.

Posizionare la striscia di provette nel termociclatore ed eseguire la PCR come descritto nel protocollo. Se c'è una distribuzione non uniforme delle partizioni positive, regolare la temperatura o la durata della PCR. Per rilevare e analizzare l'intensità della fluorescenza dei prodotti PCR, posizionare la striscia della provetta sulla maschera di rilevamento e aggiungere 6 ml di acqua distillata.

Rimuovere eventuali bolle d'aria visibili utilizzando un puntale per pipetta. Caricare la maschera nel rilevatore. Nel software di rilevamento, selezionare Fluorescenza, Esperimento, quindi Campiona schede NTC, quindi fare clic sul pulsante ESEGUI per avviare l'esecuzione.

Al termine dell'esecuzione, confermare il grafico di posizione, l'istogramma e il grafico a dispersione 2D. Per raccogliere il prodotto PCR, rimuovere il liquido sigillante dalla provetta. Aggiungere 100 L di tampone TE e agitare energicamente per 30 secondi.

Centrifugare brevemente le provette in una centrifuga da tavolo e procedere come descritto nel protocollo di testo per completare la raccolta del prodotto PCR. I grafici di posizione creati dalla PCR digitale mostrano una fluorescenza HEX gialla sia nei campioni dei pazienti che in quelli del padre, indicando la presenza della variante T dell'allele APC, ma non nel controllo senza modello. Solo il DNA genomico dei pazienti contiene la variante C, come dimostrato da una fluorescenza verde di FAM.

Come confermato ulteriormente dai grafici a dispersione, sia il paziente che il padre sono positivi per HEX, o variante T, mentre solo il paziente mostra la presenza della variante C. La frazione allelica variante del paziente, o VAF, calcolata dal DPCR, era del 13,2%, simile al 12,7% raggiunto dal sequenziamento di nuova generazione. D'altra parte, i VAF dei genitori dei pazienti e dei donatori sani erano inferiori allo 0,1%L'elettroferesi dei prodotti DPCR raccolti e concentrati conferma che la dimensione del frammento previsto è di 123 coppie di basi nel DNA dei pazienti e dei genitori. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di mantenere pulito il banco, ad esempio, utilizzando un gruppo filtro ventola.