Name: Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Scopri come controllare l'espressione genica reclutando il macchinario modificatore della cromatina in modo specifico e reversibile. Questa tecnica avanzata utilizza enzimi endogeni fisiologicamente rilevanti per studiare l'epigenetica.

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Gli autori vorrei ringraziare i membri dei laboratori Hathaway e Jin per le loro discussioni utili. Gli autori ringraziano anche Dan Crona e Ian MacDonald per loro lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Grant R01GM118653 da US National Institutes of Health (a N.A.H.); e di sovvenzioni R01GM122749, R01CA218600 e R01HD088626 da l'US National istituti di salute (per J.J.). Questo lavoro è stato supportato anche da un tier 3 e uno studente concedere da UNC Eshelman Istituto per l'innovazione (per N.A.H e A.M.C, rispettivamente). Finanziamenti aggiuntivi da un GM007092 di T-32 (al A.M.C) sostenuto questo lavoro. Dati di citometria a flusso è stati ottenuti presso la UNC flusso Cytometry Core Facility finanziata da una sovvenzione di supporto P30 CA016086 Cancer Center Core a UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.

1) coltura di linea delle cellule per la produzione di Lentivirus
<ol><li>Fresco, crescere basso-passaggio (meno di passaggio 30) cellule embrionali umane del rene (HEK) 293T in alto-glucosio Dulbecco s modified Eagle di base media medium (DMEM) completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 10 mM HEPES, 1x gli aminoacidi non essenziali (NEAA), penna / STREP, 2-mercaptoenthanol in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2. Dividere le celle ogni 3-5 p e prima che diventino > 95% confluenti.</li>
	<li>Passaggio di cellule HEK 293T con 18 x 106 a 15 cm piatto (uno piatto di 15 cm per ogni virus prodotto).<ol>
<li>Per un formato di 15 cm, aspirare i vecchi media, aggiungere 10 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x, aspirare il PBS e aggiungere 3 mL di tripsina 0.05%. Incubare le cellule in tripsina per 8 min a 37 ° C, a dondolo e toccando le cellule a metà strada attraverso l'incubazione. Nota: L'obiettivo di questa fase è quello di ottenere le cellule in sospensione unicellulare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando le cellule hanno raggiunto confluency di 60-80% il giorno seguente, eseguire una trasfezione di polyethylenimine (PEI) con 13,5 µ g di plasmide psPAX2, 4,5 µ g del plasmide pMD2.G, 18 µ g del vettore lentivirale compatibile consegna con il gene di interesse (cioè , FKBP-Gal4), 108 µ l di PEI e 1,8 mL di media di transfezione.<ol>
<li>Delicatamente mescolare il DNA, PEI e transfezione media in una provetta conica 15 mL, incubare il campione a temperatura ambiente per 15 minuti e aggiungere goccia a goccia la piastra di 15 cm. Nota: Si prega di utilizzare adeguate misure di sicurezza e seguire tutto istituzionale e procedure di sicurezza di laboratorio dopo questo passaggio, come tutti i reagenti conterrà un virus vivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo 16h di transfezione e incubazione in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO2, aspirare i media e delicatamente aggiungere media HEK 293 fresco (preriscaldato in bagnomaria a 37 ° C) per le piastre di 15 cm. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 per 48 h dopo il supporto di modifica. Il virus è quindi pronto per essere raccolta.</li>
</ol>2) infezione del Mouse cellule staminali embrionali (mESC) con Lentivirus
<ol><li>Basso-passaggio (meno di passaggio 35) di crescere, privo di alimentatore adattato CiA mESCs media base di alto-glucosio DMEM completate con 20% FBS ESC-grado, 10 mM HEPES, inibitore di leucemia di x NEAA, Pen/Strep, 2-mercaptoenthanol e 1: 500 1 fattore (LIF) in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2. Nota: Il LIF è ottenuta dal surnatante delle cellule che producono COS LIF, che sono raccolte in batch e congelato a-80 ° C.<ol>
<li>Crescere le cellule in piastre che sono state preincubate per 1-3 h con 0,1% di gelatina in 1X PBS e successivamente lavate con PBS 1X. Nutrire le cellule giornalmente e dividerli ogni 2-3 d, a seconda della loro densità. Nota: Morfologicamente, colonie di cellule staminali embrionali (ES) devono essere piccolo, rotondo e distinti gli uni dagli altri.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passaggio mESC in un formato di 12 pozzetti (100.000 cellule per pozzetto) 1D prima dell'infezione.<ol>
<li>Contare le celle con un emocitometro. Per le cellule coltivate in un formato di 10 cm, aspirare i vecchi media, aggiungere 5 mL di PBS 1X, aspirare il PBS e aggiungere 1 mL di tripsina 0,25%. Incubare le cellule in tripsina per 8 min a 37 ° C, a dondolo e toccando le cellule a metà strada attraverso l'incubazione. L'obiettivo di questa fase è quello di ottenere le cellule in sospensione unicellulare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>48 h dopo aver cambiato i media dal virale 293T15-cm imballaggio cellule dal passaggio 1.4, rimuovere e trasferire il surnatante in una provetta conica da 50 mL.</li>
	<li>Centrifugare il supernatante a 300 x g per 5 min a pellet detriti cellulari.</li>
	<li>Filtrare il surnatante attraverso una membrana da 0,45 µm. Nota: Assicurarsi di utilizzare membrane di acetato di cellulosa privo di tensioattivi (SFCA), come alcuni altri materiali possono mantenere virus e ridurre notevolmente i rendimenti.</li>
	<li>Concentrare il virus con ultracentrifugazione, utilizzando una centrifuga con rotore SW32 e girarla a 20.000 giri/min (~ 72.000 x g) per 2,5 ore a 4 ° C.</li>
	<li>Mentre il virus si concentra sotto ultracentrifugazione, trattare la mESCs CiA nella piastra 12-pozzetti con fresca media ES contenente 5 µ g/mL di polybrene.</li>
	<li>Una volta terminata la concentrazione di virus, attentamente aspirare il supernatante e sospendere il pellet di virus in 100 µ l di PBS 1X (evitare le bolle in eccesso).</li>
	<li>Aggiungere il virus e 1x PBS in una provetta da 1,5 mL microfuge. Vortice/agitare la provetta a 300 x g (o l'impostazione più bassa) di sospendere completamente il virus. Rotazione verso il basso il tubo in una centrifuga da mini-tavolo per 5-10 s rimuovere le bolle.</li>
	<li>Aggiungere 30 µ l del virus in ciascun pozzetto di una piastra 12-pozzetti. Agitare la piastra e poi Centrifugare la piastra a 1.000 x g per 20 min. Nota: La quantità di virus aggiunto può essere variata a seconda del titolo virale, che è inversamente correlato alla dimensione del costrutto di consegna.<ol>
<li>In alternativa, flash congelare il virus con azoto liquido e conservare a-80 ° C. Tuttavia, il virus di congelamento si abbassa il titolo virale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare la piastra 12-pozzetti indietro nell'incubatore 37 ° C e cambiare i media la mattina seguente (~ 16 h) più tardi con media ES fresco (come descritto al punto 2.1).</li>
	<li>Dopo 48 h di infezione, selezionare le celle che hanno integrato il plasmide virale aggiungendo l'antibiotico adatto (cioè, 1,5 µ g/mL di con puromicina, 10 µ g/mL di Dyfed, ecc.). Cambiano i media ogni giorno e lavare le cellule con PBS 1X se una maggioranza delle cellule è galleggianti/morti. Mantenere i supporti di selezione delle celle per 72-96 h in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2.</li>
</ol>3) trattamento e preparazione di s chimica modificatori epigenetici (CEM)
<ol><li>Sospendere il CEM in polvere in dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione stock di 1 mM e una concentrazione di lavoro di 100 µM.</li>
	<li>Dopo che le cellule hanno subito la selezione per 72-96 h, dividere il mESCs in un formato di 12-pozzetti con 100.000 cellule per pozzetto. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 per 24 h. in seguito, preparare una soluzione di media di 100 nM CEM con media ES. Utilizzare questo supporto per nutrire la mESC CiA con 1 mL/bene. Per servire come controllo, tenete bene delle celle senza qualsiasi CEMs aggiunto.<ol>
<li>Cambiare il supporto ad aspirazione vecchi media e aggiungendo 1 mL/ben di preparati contenenti CEM rimovibile o privo di CEM ES ogni 24 ore per la durata di un esperimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4) analisi dell'espressione di microscopia e citometria a flusso
<ol><li>Dopo 48 ore di trattamento CEM, immagine le cellule senza trattamento di CEM e le cellule trattate con 100 nM CEM utilizzando un microscopio a fluorescenza. Prendere immagini rappresentative utilizzando la fase o il campo chiaro per registrare la morfologia mESC 20 ingrandimenti; le cellule dovrebbero formano colonie rotonde, con poche cellule differenziate. Sotto il canale di fluorescenza di FITC, immagine entrambe le condizioni delle cellule.</li>
	<li>Isolare il controllo e le cellule trattate con CEM per citometria a flusso aspirando i media, lavare le cellule con 1 mL di 1X PBS, aspirando il PBS, e aggiungendo 0,25 mL di 0,25% tripsina con EDTA per 8-10 min.</li>
	<li>Confermare che le cellule non sono più in grandi ciuffi guardando nel microscopio. Utilizzare un ingrandimento X 20. Se le cellule non sembrano essere in una sospensione unicellulare, pipettare delicatamente su e giù con una pipetta P1000 per tripsinizzano completamente le cellule.</li>
	<li>Placare la tripsina con 1 mL di terreno fresco e risospendere le cellule ad alta velocità con una pipetta sierologica (o utilizzando una pipetta P1000 e punta) fino a quando le cellule sono in sospensione unicellulare.</li>
	<li>Rotazione verso il basso le cellule a 300 x g per 5 min, aspirare il surnatante. Lavate con PBS 1X e Ricentrifugare le cellule. Aspirare il supernatante di PBS.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 200 mL di tampone di FACS (acido etilendiamminotetracetico 1 mM [ed], 1x PBS e 0,2% di sieroalbumina bovina [BSA]).<ol>
<li>Il volume totale del buffer FACS sarà dipendono da quante cellule sono presenti, ma la concentrazione deve essere 1.000-3.000 cellule / µ l. contare il numero di cellule in 3 campioni e media la concentrazione delle cellule. Se necessario, aggiungere più buffer di FACS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire citometria a flusso su celle > 50.000 con le cellule sospese, mantenere le cellule su ghiaccio quando essi non vengono analizzate. Utilizzare un filtro di 530/40 (FITC, AF488, GFP, ecc.) per registrare i cambiamenti nell'espressione. Determinare la tensione fluorescente appropriata utilizzando un campione di cellule non trattate di controllo e impostare la tensione di avere il picco fluorescente essere nel bel mezzo dello spettro di intensità registrata. Eseguire i campioni ad una velocità di guaina di circa 5.000 cellule/s.</li>
	<li>Esportare i dati e analizzare i file di FCS su un programma di citometria a flusso (cioè, FlowJo) di gating prima su forward scatter vs side scatter per cellule vive e poi su Avanti scatter altezza vs zona per camiciole. Quindi, visualizzare i dati del canale GFP su un istogramma per determinare l'espressione relativa di GFP nel mirato e controllare popolazioni.</li>
</ol>5) analisi della cromatina di Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) seguita da qPCR
<ol><li>Dividere il mESCs in un piatto di 10 cm con 3 milioni di cellule e 10 mL di media ES (una piastra di 10 cm per ogni sperimentale o controllare la condizione). Il giorno seguente, aggiungere 10 mL di supporti contenenti CEM o privo di CEM. Dopo 48 ore di trattamento CEM, aspirare i vecchi media. Lavare ed aspirare le cellule con 5 mL di 1X PBS. Successivamente, dissociare le cellule con tripsina 0,25% e placare la tripsina con 10 mL di media ES. Contare e isolare un campione di 10 milioni di cellule per condizione.</li>
	<li>Rotazione verso il basso tutti gli esempi di cella 10 milioni a 300 x g per 5 min.</li>
	<li>Ogni risospendere in 10 mL di 1X PBS e Ricentrifugare le cellule a 300 x g per 5 min.</li>
	<li>Ogni risospendere in 10 mL di buffer di CiA Fix (50 mM a pH 8, pH di 1 mM EDTA 8, 0,5 mM glicole etilenico-bis [ß-amminoetil etere]-N, N, N', N'-tetraacetico acido [EGTA] pH 8 e 100mm cloruro di sodio [NaCl]). Aggiungere 1 mL di soluzione di formaldeide 11% e capovolgere immediatamente i campioni 5 x - 10 x. Incubare il campione a temperatura ambiente per 10 min.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL di glicina di 2,5 M. Invertire i campioni immediatamente e incubare il campione in ghiaccio per 5 min.</li>
	<li>Centrifugare il campione a 1.200 x g per 5 min a 4 ° C. Aspirare il supernatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 10 mL di CiA risciacquo 1 (50 mM HEPES pH 8, 140 mM NaCl, pH di 1 mM EDTA 8, glicerolo al 10%, 0,5% Nonidet P-40 [NP40] e lo 0,25% Triton X100). Incubare il campione sul ghiaccio per 10 min e centrifugare a 1.200 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 10 mL di CiA risciacquo 2 (10 mM tris [idrossimetilico] amminometano [Tris] a pH 8, pH di 1 mM EDTA 8, 0,5 mM EGTA pH 8 e 200 mM NaCl). Centrifugare il campione a 1.200 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Aggiungere delicatamente 5 mL di CiA tosatura buffer (0.1% SDS, 1 mM EDTA e Tris 10 mM pH 8) lungo i lati del tubo conico per lavare qualsiasi sale senza interrompere il pellet. Centrifugare il campione a 1.200 x g per 3 min a 4 ° C. Ripetere la fase di lavaggio.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 90 µ l di tampone tosatura CiA e inibitori della proteasi fresca (uso una miscela di leupeptina, chymostatin e pepstatina A sciolto insieme a 10mg/mL ogni in DMSO per rendere un 1.000 x soluzione madre, rendendo una concentrazione finale di 10 µ g/mL). Aggiungere 10 µ l di sonicazione di miglioramento nanogocce mantenendo tutto il ghiaccio13,14.</li>
	<li>Trasferire 100 µ l della soluzione in una provetta di vetro e tappo del tubo.</li>
	<li>Sottoporre ad ultrasuoni i campioni per 3,5 min (determinato basato sulla linea cellulare e numero di celle). Per evitare il surriscaldamento dei campioni, è possibile trattare i campioni in tempi di ciclo 2-min-massimo se il tempo di sonicazione totale supera 2 min. Nota: L'ultrasonicatore concentrato usato qui funzioni ad alta frequenza (500 kHz). Eseguire la macchina ad una potenza acustica di 55 w. La durata di sonicazione deve essere predeterminata da ogni laboratorio individuale.</li>
	<li>Trasferire ciascun campione di cromatina lisati mediante un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL. Girare i tubi a 8.000 x g per 2 min a 4 ° C.</li>
	<li>Per analizzare l'efficienza di taglio e per quantificare la quantità relativa di cromatina, seguire il protocollo del produttore di ChIP kit. Nota: Determinare la concentrazione di DNA allo spettrofotometro (ad es., utilizzando uno strumento di nanodrop DNA), ed eseguire ~ 200 ng di DNA su gel di agarosio 1% per verificare che la cromatina è sonicata per circa 200-500 di basi (bp) in dimensioni.</li>
	<li>Per eseguire immunoprecipitazione e isolare la cromatina, seguire il protocollo del produttore di ChIP kit. Nota: Per l'immunoprecipitazione di campioni con concentrazioni di DNA, caldo il tampone di eluizione a 37 ° C ed eluire i campioni 2 x con 30 µ l di tampone di eluizione (filatura per 1 min ogni volta).</li>
	<li>Per eseguire qPCR, caricare i reagenti in una piastra 384 pozzetti. Aggiungere 5 µ l di mix master della tintura di cianina asimmetrico: 2x, 2,5 µM di ogni primer, acqua e 0,1 - 10 ng di DNA per ogni reazione.<ol>
<li>Disegno primer per amplificare 50-100 bp ampliconi e valori CT sono normalizzati a un gene house-keeping, particelle di intracisternal A-tipo (IAP). Nota: Per ulteriori metodi di qPCR, Vedi il protocollo del produttore di kit. Il set di primer utilizzati per indirizzare il locus di Oct4 è stato: CACATGAAGCAGCACGACTT (F); (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC. Il set utilizzato per destinazione IAP di primer di controllo era: ATTTCGCCTAGGACGTGTCA (F); (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC.</li>
		<li>Basato sugli iniettori e il prodotto desiderato, eseguire la qPCR con 40 cicli di una ricottura temperatura di 60 ° C per 1 min. Nota: I dati risultanti è stati quantificati usando i triangolo Ct confronti tra i campioni, con CiA:Oct4 normalizzato sopra IAP. I risultati dell'analisi finale vengono visualizzati come medie dei campioni sperimentali triplice copia, con l'errore rappresentato come la deviazione standard dalla media.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, abbiamo descritto il sistema CEM recentemente sviluppato applicato per regolare l'espressione genica e ambiente di cromatina a un gene specifico in modo dose-dipendente. Forniamo un metodo accurato per studiare le dinamiche coinvolte nella regolazione dell'espressione genica attraverso il reclutamento selettivo di proteine regolatrici della cromatina endogeno specifico. Si tratta di una tecnologia altamente modulare che può essere applicata per studiare come le diverse proteine - e cromatina-modificando complessi fu...

Cromatina è costituito da DNA avvolto intorno alle proteine istoniche istonico che formano la particella nucleosome core. Regolamento di compattazione della cromatina è un meccanismo essenziale per il corretto DNA riparazione, replica e l'espressione1,2,3. Un modo in cui le cellule controllano il livello di compattazione è attraverso l'aggiunta o la rimozione di varie modifiche di coda post-traduzionali degli istoni. Due tali modifiche includono l'acetilazione di lisina (1), che è più comunemente associato con l'attivazione del gene, e (2) lisina metilazione, che può essere associata con l'attivazione del gene o repressione, a seconda del contesto dell'amminoacido. L'aggiunta di segni di acetilazione e metilazione è catalizzata da utilizzando istone acetiltransferasi (Hat) e istone metiltransferasi (HMTs), rispettivamente, mentre la rimozione del marchio avviene istone deacetilasi (HDACs) e istone JmjC (HDMs ), rispettivamente di4,5. Anche se l'esistenza di queste proteine è stato conosciuto per decenni, molti meccanismi di macchinari come modificante la cromatina opere per regolare correttamente l'espressione genica rimangono da definire. Poiché i processi di regolazione della cromatina sono dysregulated in molte malattie umane, nuove comprensioni meccanicistiche potrebbero portare a future applicazioni terapeutiche.
La cromatina in vivo assay (CiA) è una tecnica recentemente descritta che utilizza un induttore chimico di prossimità (CIP) per controllare l'assunzione di macchinari modificante la cromatina a un locus specifico6. Questa tecnologia è stata usata per studiare una lista sempre di dinamica della cromatina, tra cui istone-modificando le proteine, remodelers della cromatina e trascrizione fattori6,7,8,9. CIP-basato della cromatina tethering delle proteine espresse esogenicamente è stato esteso anche passato CiA per modulare loci genetici non modificato da utilizzare con una disattivato cluster regolarmente intervallate breve palindromi ripete CRISPR-collegata della proteina (dCas9) 10 , 11. nel sistema di CiA, mESCs sono stati modificati per esprimere un gene reporter GFP presso il locus Oct4 , una zona altamente espresso e rigorosamente regolamentato del genoma mESC. In precedenza, questo sistema è stato applicato per descrivere il reclutamento dose-dipendente e reversibile della proteina di eterocromatina esogenicamente espresso 1 (HP1), un enzima che lega H3K9me3 e propaga repressivi marchi (ad esempio, H3K9me3) e DNA metilazione6. Per realizzare questo tipo di strategia di reclutamento, la mESCs sono infettati con un plasmide che esprime una proteina di FK506-legante (FKBP) collegata a un Gal4, che è un ancoraggio della DNA-proteina che si lega a una matrice di Gal4-associazione a Monte del reporter GFP. Le cellule inoltre sono infettate con un dominio FKBP-rapamicina-legante (FRB) collegato al HP1. Quando il mESCs sono esposti a concentrazioni nanomolari bassa del CIP, rapamicina, FRB sia FKBP, sono riuniti presso il luogo di destinazione. Nei giorni del trattamento rapamicina, espressione del gene dell'obiettivo è represso, come evidenziato da citometria a flusso e microscopia di fluorescenza e acetilazione dell'istone è diminuita, mostrato da ChIP e del bisolfuro. Mentre lo sviluppo e la convalida di questo approccio sono stati significativi progressi nel campo della ricerca della cromatina e regolamento, uno svantaggio è necessaria espressione esogena di modificante la cromatina macchinari.
Per rendere la tecnologia basata sul reclutamento degli enzimi fisiologicamente rilevanti solo endogeni ed effettuare un sistema più modulare, abbiamo progettato e caratterizzato nuove molecole bifunzionali, definiti CEMs (Figura 1)12. Uno dei componenti del CEMs comprende FK506 che, simile alla rapamicina, lega strettamente e specificamente a FKBP. Così, il CEMs ancora saranno reclutati al locus Oct4 in mESCs La CiA. L'altra componente del CEMs è una molecola che lega endogeno modificante la cromatina macchinari. In uno studio pilota, abbiamo testato CEMs che contengono inibitori HDAC. Mentre il concetto di usare un inibitore di reclutare HDACs sembra contro-intuitivo, l'inibitore è comunque in grado di reclutare attività di HDAC al gene di interesse. Questa operazione viene eseguita (1) reindirizzando le HDAC al locus, rilasciando l'enzima e aumentando la densità di ONU-inibito HDACs nella zona e inibizione di HDAC (2) mantenere a livello del locus, ma complessi repressivi che si legano a HDACs inibito, di reclutamento o (3) una combinazione di entrambi. In uno studio precedente, abbiamo mostrato che il CEMs erano in grado di reprimere con successo il reporter GFP in maniera dose - e tempo-dipendente, così come in un modo che era rapidamente reversibile (cioè, entro 24 ore)12. Abbiamo caratterizzato la capacità della tecnologia CEM presentata qui per controllare l'espressione genica mediante microscopia a fluorescenza, citometria a flusso e la capacità di controllare l'ambiente di cromatina utilizzando ChIP-qPCR6. Qui, descriviamo un metodo per l'utilizzo e che caratterizzano il CEMs, che faciliterà l'adattamento di questo sistema di rispondere a ulteriori domande legate alla biologia della cromatina.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013CV</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (per coltura tissutale)</td><td>Corning</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>BME (2-Mercaptoetanolo)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlantic Biologicals</td><td>S11550</td><td>Lotti individuali testati per la qualità</td></tr><tr><td>delle provette</td> <td>CovarisThermoScientific</td><td>C4008-632R</td><td></td></tr><tr><td>Covaris caps</td><td>ThermoScientific</td><td>C4008-2A</td><td></td></tr><tr><td>PEI (polietilenimmina)</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Mezzi di trasfezione (Opti-mem)</td><td>Gibco</td> 31985070 Virus provette da centrifuga Beckman <td>Coulter</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Membrana filtrante Virus</td><td>Corning</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC134220</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>con</td></tr><tr><td>EDTA 0,05 % Tripsina</td><td>Gibco</td><td>25400-054</td><td>con EDTA</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidina</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix (colorante cianina asimmetrico)</td><td>Roche</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo H3K27ac</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td></td></tr> <tr><td>(kit ChIP) Kit ad alta sensibilità ChIP-IT</td><td>Motivo attivo</td><td>53040</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Covaris</td><td>E110</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Optima</td><td>XPN-80</td><td></td></tr><tr><td>SW-32 rotore per centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>14U4354</td><td></td></tr><tr><td>Secchi per centrifuga SW-32 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>130.2</td><td></td></tr><tr><td>LentiX 293 Rene embrionale umano</td><td>Clontech</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP9700</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Roche</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>MP Biomedicals</td><td>807426</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Fisher</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>TE tampone</td><td>Fisher</td><td>BP2474-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (per ChIP)</td><td>Fisher</td><td>BP310-100</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso, Attune NxT</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24858</td><td></td></tr><tr><td>FKBP-Gal4 plasmide</td><td>Addgene</td><td>44245</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 plasmide</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G plasmide</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Nanodroplets</td><td>MegaShear</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DNA Nanodrop Thermo</td><td>Fisher</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>Inibitori della proteasi (leupeptina)</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>Inibitori della proteasi (chimostatina)</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>230790</td><td></td></tr><tr><td>Inibitori della proteasi (pepstatina)</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>516481</td><td></td></tr><tr><td>CiA:Oct4 mESC</td><td>Il gentile dono di G. Crabtree</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lif-1C-alfa - produzione di cellule Cos</td><td>Il gentile dono di J. Wysocka</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regolamento di compattazione della cromatina è un importante processo che regola l'espressione genica negli eucarioti superiori. Anche se la compattazione della cromatina e regolazione dell'espressione genica sono interrotti comunemente in molte malattie, un metodo di luogo-specific, endogeno e reversibile per studiare e controllare questi meccanismi d'azione è stata carente. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato e caratterizzato molecole bifunzionali diregolamenti. Un componente della molecola bifunzionale associa a un ancoraggio della DNA-proteina in modo che che saranno assunti per un locus allele-specifico. L'altro componente si impegna endogeno macchinario cellulare modificante la cromatina, reclutamento di queste proteine ad un gene di interesse. Queste piccole molecole, chiamate modificatori epigenetici chimici (CEMs), sono in grado di controllare l'espressione genica e l'ambiente della cromatina in maniera dose-dipendente e reversibile. Qui, dettagliamo un approccio CEM e la sua applicazione per fare diminuire l'espressione genica e l'acetilazione dell'istone coda presso un reporter della proteina fluorescente verde (GFP) situato al luogo del Oct4 in cellule staminali embrionali di topo (mESCs). Ci caratterizzano il piombo CEM (CEM23) utilizzo di microscopia fluorescente, citometria a flusso e immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), seguita da una reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). Mentre il potere di questo sistema è dimostrato a livello del locus Oct4 , concettualmente, la tecnologia CEM è modulare e può essere applicata in altri tipi cellulari e in altri loci genomici.

Abbiamo recentemente sviluppato CEMs ed abbiamo dimostrato che questa tecnologia può essere applicata per regolare l'espressione genica e l'ambiente della cromatina in un locus di reporter in modo dose-dipendente e reversibile. In Figura 1, un modello del piombo CEM, CEM23, si vede. Macchinari HDAC sono reclutato per il locus reporter dall'inibitore HDAC che, in questo caso, è il reporter GFP inserito a livello del locus Oct4 .
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Regolamento dell'ambiente della cromatina è un processo essenziale necessario per l'espressione genica corretto. Qui, descriviamo un metodo per il controllo dell'espressione genica attraverso il reclutamento di modificante la cromatina macchinari in modo gene-specifico e reversibile.

Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica come i meccanismi di regolazione genica e le relazioni di causa ed effetto tra diversi elementi regolatori della cromatina. Il principale vantaggio di questa tecnica è che per la prima volta è possibile modulee un loci di cromatina con enzimi endogeni fisiologicamente rilevanti. Generalmente gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché la cultura ESL del mouse è intrinsecamente difficile per coloro che non sono stati addestrati nella tecnica.Un'ulteriore dimostrazione di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi di infezione virale cellulare sono difficili da imparare. Il ricercatore deve temporeggiare due linee separate di coltura cellulare ed è necessario monitorare attentamente la sicurezza durante queste fasi. Per iniziare il protocollo, passare 18 milioni di cellule HEK 293T per piastra di 50 centimetri.Aspirare il vecchio supporto e aggiungere 10 millilitri di una salina tamponata con fosfato X, o PBS. Aspirare il PBS e aggiungere tre millilitri dello 0,05% di trippsina. Incubare le cellule in tripsiderina per otto minuti a 37 gradi Celsius.Dondolare e toccare le cellule a metà dell'incubazione. Il giorno seguente, quando le cellule hanno raggiunto la confluenza dal 60 all'80%, eseguire una trasfezione di polietilenimina, o PEI. Successivamente, mescolare delicatamente il DNA, il PEI e i mezzi di trasfezione in un tubo conico da 15 millilitri.Incubare il campione a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere la soluzione dropwise alla piastra di 15 centimetri. Quindi, incubare il campione per 16 ore in un incubatore di 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.Il giorno successivo, aspirare il supporto e sostituirlo delicatamente con supporti HEK freschi e prebellici alle piastre da 15 centimetri. Dopo lo scambio di media, incubare le cellule in un incubatore Celsius di 37 gradi con 5% di anidride carbonica per 48 ore. Conta le cellule con un emocitometro.Passaggio precedentemente preparato mESC in un formato a piastra di 12 po porsi con 100.000 cellule per pozzo un giorno prima dell'infezione. Per le celle coltivate in un formato di 10 centimetri, aspirare il vecchio supporto, aggiungere cinque millilitri di un X PBS, aspirare il PBS e aggiungere un millilitro dello 0,25% di tripside. Incubare le cellule in tripsiderina per otto minuti a 37 gradi Celsius e dondolare e toccare le cellule a metà dell'incubazione.48 ore dopo lo scambio di supporti, rimuovere e trasferire il supernatante delle celle HEK 293T in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare il supernatante a 300 volte G per cinque minuti per pellettare i detriti cellulari. Quindi, filtrare il supernatante attraverso una membrana da 0,45 micron.Concentrare il virus tramite ultracentrifugo con un rotore SW32 e ruotare il campione a 72.000 volte G per due ore e mezza a quattro gradi Celsius. Mentre il virus si concentra sotto ultracentrifugazione, trattare i CIA mESC nella piastra di 12 pozzi con gambo embrionale fresco o mezzi ES contenenti cinque microgrammi per millilitro di Polibrene. Al termine della concentrazione del virus, aspirare accuratamente il supernatante e sospendere attentamente il pellet del virus in 100 microlitri di un X PBS per evitare bolle in eccesso.Aggiungere il virus e un X PBS a un tubo di microfugo da 1,5 millilitri. Vortice il tubo all'impostazione più bassa per sospendere completamente il virus. Girare il tubo in una mini centrifuga da tavolo per cinque-10 secondi per rimuovere le bolle.Aggiungere 30 microlitri del virus ad ogni pozzo di una piastra da 12 porri. Ruotare la piastra e quindi centrifugare i campioni a 1000 volte G per 20 minuti. Posizionare la piastra di 12 pozzi nell'incubatore di 37 gradi Celsius durante la notte.La mattina seguente, scambiare i media con nuovi mezzi ES e consentire l'infezione per 48 ore. Dopo 48 ore di infezione, selezionare per le cellule che hanno integrato il plasmide virale aggiungendo l'antibiotico appropriato. Cambia i media ogni giorno.Conservare il supporto di selezione sulle celle per 72-96 ore in un incubatore di 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5%. Continuare con modificatore epigenetico chimico, o CEM, preparazione e trattamento sospendendo il CEM in polvere e il solfossido di dimetile, o DMSO, a una concentrazione di magazzino di un millimolare e una concentrazione di lavoro di 100 micromolare. Dopo che le celle sono state sottoposte a selezione per 72-96 ore, dividere le mESC in un formato a 12 pozzi con 100.000 celle per pozzo.Incubare le cellule in un incubatore celsius di 37 gradi con 5% di anidride carbonica per 24 ore. Dopo l'incubazione, preparare una soluzione media di CEM nanomolare 100 con mezzi ES. Usa i supporti per alimentare il CIA mESC con un pozzo millilitro.Mantenere un pozzo di celle senza alcun CEM aggiunto per fungere da controllo. Successivamente, cambiare i supporti aspirando i vecchi supporti e aggiungendo un millilitro per pozzo CEM appena preparato contenente o supporti ES senza CEM ogni 24 ore per tutta la durata dell'esperimento. Dopo 48 ore di trattamento CEM, immagini le cellule senza trattamento CEM nelle cellule trattate con CEM nanomolare 100 utilizzando un microscopio a fluorescenza.Scatta immagini rappresentative usando la fase o il campo luminoso per registrare la morfologia mESC con un ingrandimento da 10 a 40 volte. Le cellule avrebbero dovuto formare attorno a colonie con alcune cellule differenziate. Sotto il canale di fluorescenza FITC, immagini entrambe le condizioni cellulari.Successivamente, isolare le cellule di controllo e trattate con CEM per la citometria del flusso aspirando il mezzo, lavando le celle con un millilitro di un X PBS, aspirando il PBS e aggiungendo 0,25 millilitri dello 0,25% di tripside con EDTA per otto-10 minuti. Verificare che le cellule non siano più raggruppate in grandi grumi attraverso il microscopio utilizzando l'ingrandimento 20 volte superiore. Se le celle non sembrano essere in una singola sospensione cellulare, pipettarle delicatamente su e giù con una pipetta P1000 per tripinare completamente le cellule.Dissetare la tripina con un millilitro di mezzi freschi e rimorsiva le cellule ad alta velocità con una pipetta sierologica fino a quando le cellule non sono in una singola sospensione cellulare. Quindi, far girare le cellule a 300 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante, lavare le cellule con un X PBS e centrifugare le cellule.Aspirare il supernatante PBS e rimescolare il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone FACS. Eseguire la citometria a flusso su circa 50.000 cellule con le cellule sospese ed eseguire i campioni a una velocità di sheath di circa 5.000 cellule al secondo. Infine, esportare i dati per ulteriori analisi.Le immagini di fase del sistema CEM presso il locus Oct4 e il CIA mESC sono immagini dopo 48 ore di trattamento con 100 nanomolari di CEM23 o con cellule non trattate indicano una specifica repressione della GFP. Le immagini fluorescenti mostrano un'espressione GFP brillante nelle celle di controllo e un'espressione GFP ridotta in mESC trattata con CEM23. La citometria del flusso ha costantemente rivelato una diminuzione superiore al 30% dell'espressione della GFP negli mESC della CIA trattati con 100 nanomolari di CEM23 per 48 ore.L'immunoprecipitazione della cromatina, o CHIP, ha rivelato che 48 ore di trattamento con 100 nanomolari di CEM23 hanno diminuito il livello di H3K27ac al locus bersaglio rispetto alle cellule di controllo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di stare attenti con le cellule staminali embrionali del topo. Se si differenziano durante il protocollo, i risultati verranno annullati.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia sintetica per esplorare i meccanismi in vivo nel genoma dei mammiferi.

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