Name: Laser-assistita lentivirali Gene consegna al Mouse fecondate le uova (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Scopri la consegna genica lentivirale assistita da laser nelle uova fecondate di topo. Questo metodo permette di creare modelli transgenici con tassi di espressione dell'85% e sviluppo embrionale del 47%.

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Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale del National Institute of Health (NIH), National Institute di Environmental Health Sciences (NIEHS). Siamo grati al Dr. Robert Petrovich e Dr. Jason Williams per una lettura critica del manoscritto e consigli utili. Inoltre vorremmo citare e ringraziare il Dr. Bernd Gloss, il nucleo di Knockout, la struttura di citometria a flusso, la microscopia a fluorescenza e Imaging Center e le strutture di ramo di medicina comparativa del NIEHS per i loro contributi tecnici. Vorremmo ringraziare Mr. David Goulding dal ramo di medicina comparativa e MS. Lois Wyrick di Imaging Center presso il NIEHS per averci fornito con fotografie e illustrazioni.

Tutte le procedure animale e trattamenti utilizzati nel presente protocollo erano in conformità con le linee guida di NIH/NIEHS cura degli animali e sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato (ACUC) presso il NIH/NIEHS, animale protocollo 2010-0004.
1. preparati
<ol><li>Preparare/acquisto ricombinante non propagante lentivirus che trasporta il gene di interesse. In questo studio, lentivirus SBI511 espressione della proteina fluorescente verde Copepoda (copGFP; abbreviato in GFP) da un allungamento promotore 1a fattore è stato usato per la trasduzione. Protocolli standard2 sono stati utilizzati per produrre e lentivirus titolo a titoli superiori a 1e8 transducing unità / mL (TU/mL). Nota: Prestare attenzione e tutto il materiale che sono stati a contatto con lentivirus di candeggina. Fare riferimento alle linee guida del vostro Istituto per sicurezza d'uso e la manipolazione di lentivirus.</li>
	<li>L'installazione di coppie riproduttrici di razza del topo desiderato il giorno prima della raccolta di embrioni. In questo esperimento, è stato utilizzato C57BL/6J ceppo di topi. Utilizzato per la raccolta di ovidotto e ovaie di topi femmina non sono stati trattati con ormoni per superovulazione.</li>
	<li>2 – 24 h prima della raccolta uova mouse fertilizzato, preparare diverse piastre di goccia24 (KSOM) di potassio Simplex ottimizzato Medium come segue: aggiungere una goccia di 50 μL di mezzo KSOM per mezzo di una piastra di coltura tissutale-trattati di 35 mm e coprire con 2 mL di Dimetilpolisiloxano (DMPS5X) e posto al 37 oC, 5% CO2, 5% O2 e 90% N2 per equilibrare. Nota: Usare piastre sterili monouso e gettare a seguito dell'esposizione a lentivirus.</li>
	<li>Preparare soluzione 1x dell'ialuronidasi nel terreno di M2 da soluzione madre (100 x, 30 mg/mL, conservare a-20 ° C). 100 x soluzione di riserva è stato preparato in acqua.</li>
	<li>24h post laser-assistita di trasduzione delle uova fecondata del mouse, impostare coppie tra vasectomia topi maschi e femmine per preparare i topi femminili pseudopregnant.</li>
</ol>2. isolamento del Mouse fecondate le uova
<ol><li>16 – 24 h post accoppiamento, selezionare topi femminili con spine vaginali indicative di accoppiamento riuscito e umanamente eutanasia25. I topi utilizzati in questo studio sono stati eutanasizzati di dislocazione cervicale sotto profonda inalazione di CO2 o isoflurano.</li>
	<li>Isolare le ovaie e ovidotti secondo protocolli standard25.</li>
	<li>Trasferire le ovaie e ovidotti ad un piatto di 35 mm contenente M2 media.</li>
	<li>Per ogni ovaia, strappare ampolla a pezzi per rilasciare le uova fecondate circondate da cellule del cumulo.</li>
	<li>Trasferire le uova fecondate e le cellule del cumulo a un 35 mm piatto contenente 1 ialuronidasi x nel mezzo di M2 e incubare a temperatura ambiente per 3 – 5 min.</li>
	<li>Dispensare fecondate le uova su e giù per rilasciare le cellule del cumulo.</li>
	<li>Trasferire uova fecondate in un piatto di 35 mm contenente M2 media e dispensare su e giù per lavare via l'ialuronidasi.</li>
	<li>Trasferire uova fecondate in un piatto di 35 mm contenente KSOM e dispensare su e giù per lavare via i rimanenti M2 media e ialuronidasi.</li>
	<li>Trasferire le uova fecondate per le piastre di goccia KSOM preparate dal passaggio 1.3. Nota: Mouse fecondato uova in KSOM devono essere mantenute in coltura tissutale incubatore a 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 e 90% N2 per equilibrare. Rimozione di piastre da incubatrice per più di 15 min si tradurrà in danno agli embrioni.</li>
	<li>Consentire uova fecondate di recuperare per 2 h nell'incubatrice prima di passare al passaggio successivo.</li>
</ol>3. perforazione del Mouse fecondato uova con Laser XYClone
<ol><li>Configurare e calibrare XYClone laser secondo la raccomandazione del costruttore. Altri laser, in genere utilizzato per la fecondazione in vitro , può essere sostituito con XYClone laser perforare le uova fecondate.<ol>
<li>Collegare il filo di casella controller laser all'apparato laser sul microscopio.</li>
		<li>Fissare la scatola del regolatore laser al computer che esegue il software laser tramite una porta USB. 3.1.3. Collegare il controller laser e accenderlo.</li>
		<li>Guardando attraverso l'oculare, perforare un campione (ad es. a secco-erase marcature su un vetrino).</li>
		<li>Utilizzare un piccolo cacciavite (incluso nel kit laser) per regolare la X e posizione Y del laser per abbinare il LED luce visibile attraverso l'oculare del microscopio e tarare il laser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare un piatto di goccia KSOM contenenti uova fecondata mouse sul tavolino del microscopio. Non tenere la piastra di fuori dell'incubatore per più di 15 min.</li>
	<li>Guardare attraverso l'oculare del microscopio e assicurarsi che zona pellucida dell'embrione è a fuoco e il laser luce LED è visibile.</li>
	<li>Spostare il tavolino del microscopio per indirizzare la zona con il laser e la luce del LED.</li>
	<li>Utilizzo del software PC impostato XYClone laser 250 μs.</li>
	<li>Regolare le dimensioni di luce LED per dimensioni desiderate (impostazione 5 in questo esperimento).</li>
	<li>Perforare la zona di ogni ovulo fecondato tre volte con il laser. La zona può essere trafitto o diluito. Utilizzando le impostazioni di cui sopra, il laser si produrrà un buco con un diametro di 10 μm (Figura 2). Nota: Laser che mira vicino al corpo di polar allontana le cellule embrionali.</li>
	<li>Consentire uova fecondate di recuperare per 2 h nell'incubatrice di coltura del tessuto prima di passare al passaggio successivo.</li>
</ol>4. trasduzione del Mouse fecondate le uova dopo perforazione Laser XYClone
<ol><li>Pipettare 2 μL di concentrato lentivirus (maggiore di titolo TU/mL 1e8) nella goccia KSOM 50 μL. Non pipettare su e giù. Le uova fecondate facilmente collegare il puntale. Basandoci sulla nostra esperienza, 1e5-5e5 unità trasduzione di lentivirus in un volume minore di 3 µ l è ottimale per la consegna del gene.</li>
	<li>Consentire uova fecondate di svilupparsi in blastocisti per 4 giorni nell'incubatrice. Nessuna necessità di cambiare il supporto.</li>
</ol>5. non-chirurgico trasferimento degli embrioni del Mouse trasdotte ai topi pseudo-incinto
<ol><li>Utilizzare il mouse pseudopregnant, 3,5 giorno dopo l'accoppiamento, preparata al punto 1.5.</li>
	<li>Usare il dispositivo Non-Surgical Embryo Transfer (SNE) per impiantare embrioni di topo in pseudopregnant topi.<ol>
<li>Utilizzando un microscopio chirurgico o dissezione, inserire uno speculum vaginale per visualizzare la cervice.</li>
		<li>Inserire il dispositivo di trasferimento di embrioni Non-Surgical (SNE) circa 5 mm la cervice e deposito embrioni in un volume di circa 2 µ l. Nota: Un dispositivo sterile SNE è utilizzato per ogni trasferimento e scartato dopo la procedura. Tutti i reattivi utilizzati nella manipolazione degli embrioni devono essere sterili.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire 10 – 15 blastocisti sano nel volume 2 di μL di KSOM ogni pseudopregnant topi.</li>
	<li>Continuare a monitorare e misurare il guadagno di peso nei topi pseudopregnant nei giorni successivi per determinare se lo SNE è stata completata.</li>
	<li>Recuperare i cuccioli permettendo i topi incinto a partorire naturalmente o effettuando un taglio cesareo 17 giorni dopo il trasferimento dell'embrione26. Un taglio cesareo è spesso necessario se pochissimi embrioni sono presenti e crescono troppo grande per nascita naturale.</li>
	<li>Raccogliere tessuto da cuccioli per la genotipizzazione determinare il tasso di transgenesi27.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La capacità di integrare nel loro genoma ospite il lentivirus li rende un vettore ideale per consegna stabile del gene. Vettori lentivirali possono trasportare fino a 8,5 paio di kilobase (kbp) di materiale genetico che può ospitare promotori cellula-specifico o inducibili, marcatori di selezione o moiety fluorescente. Materiale genomico incorporato può replicare come parte del loro genoma ospite e regolato per esprimere o disattivare a intervalli di tempo desiderato. Questi vettori consentono un controllo spatiotemporal...

Questo metodo fornisce istruzioni dettagliate per permeabilizing la zona pellucida di uova fecondata mouse per rendere le cellule embrionali accessibile per la consegna del gene di lentivirus. Lentivirus sono progettati dalla natura per la consegna efficiente del gene in cellule di mammifero. Essi infettano le cellule di divisione e divisione e integrare il genoma lentivirale nella loro ospite cromosomi1. La gamma delle cellule dell'ospite lentivirali prontamente viene espanso dal pseudotipizzazione il lentivirus ricombinanti con la glicoproteina del virus di stomatite vescicolare (VSV-G), dovuto il vasto trofismo della proteina VSV-G2. A seguito di trasduzione, geni lentivirali sono stabilmente integrati ed espresso come parte del loro cromosomi ospite creando uno strumento ideale per la generazione di animali transgenici. Se consegnato alle prime cellule embrionali di fase, il genoma lentivirale è replicato ed espresso nell'intero organismo. Trasduzione lentivirale ha portato alla produzione di ratto, topi, quaglie, pollo e maiale3,4,5,6,7 , tra le altre specie di transgenica. Il tipico metodo di consegna del gene lentivirali, tuttavia, richiede attrezzature specializzate e tecnici specializzati di superare la barriera di zona pellucida che incapsula gli embrioni in fase precoce. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di descrivere come permeabilize la zona usando un laser per facilitare la consegna del gene lentivirali.
Le uova dei mammiferi sono circondate dalla zona pellucida che indurisce dopo fertilizzazione per proteggere le uova fecondate contro gamete e per limitare le interazioni ambientali8,9. La zona costituisce una barriera che allontana le cellule embrionali lentivirus fino a quando gli embrioni sono nati come una blastocisti. Coltivati del topo fecondate le uova si schiudono dopo 4 giorni e devono essere impiantati in topi pseudopregnant prima schiusa per lo sviluppo normale in cuccioli. Pertanto, per la trasduzione, lentivirus vengono microiniettati prima della schiusa dalla zona in cavità perivitellino, lo spazio tra la zona e le cellule embrionali.
La zona pellucida viene spesso rimosso per fecondazione in vitro di ovuli umani per aumentare il tasso di fertilizzazione10. Tuttavia, rimozione chimica di mouse zona pellucida negativamente colpisce lo sviluppo dell'embrione di topo ed è nociva per le cellule embrionali11,12. Altri metodi per la consegna del gene di uova fecondata mouse superare la barriera di zona pellucida di microiniezione diretta del DNA nella cellula nucleo13. Microiniezione pronuclei è un mezzo efficace di fornire geni agli embrioni. Tuttavia, poiché ogni embrione è tenuto in posizione singolarmente per la microiniezione, la pratica può essere laborioso e che richiede tempo per un utente inesperto.
Altri metodi quali l'elettroporazione e photoporation sono utili per transitori e a breve termine consegna del gene di topo fecondato uova14,15,16. Questi metodi sono ampiamente utilizzati per la consegna di ricombinasi e componenti CRISPR-Cas9. Tuttavia, elettroporazione e photoporation consegna dei geni non utilizzabile in modo efficiente per creare transgenica. Gli spermatozoi che vengono raccolti da epididimo forato del mouse possono anche essere microlavorati lentivirus e utilizzati per la fecondazione in vitro per la produzione di animali transgenici17,18,19, 20.
In questo protocollo, la consegna del gene lentivirali di embrioni di topo è facilitata da permeabilizing la zona utilizzando un laser. Il laser XYClone è stato sviluppato come sussidio per la coltivazione di cellule staminali embrionali22e in vitro fertilizzazione21 . Si tratta di un piccolo apparecchio che è semplice da configurare e facile da usare. Una volta installata su un microscopio, occupa lo spazio di una lente obiettiva e il software in dotazione permette di puntamento laser mentre guardando attraverso gli oculari del microscopio (Vedi protocollo: sezione 3). Una volta che la zona è perforata dal laser XYClone, lentivirus può essere introdotto nel terreno di coltura per gene consegna23. Lentivirus multiple potrebbero essere utilizzati per inviare simultaneamente diversi geni per costituzione cromosomica.
Questo protocollo descriverà come isolare e cultura mouse fecondato uova, viene illustrato l'utilizzo del laser per perforazione della zona pellucida e dimostra la trasduzione di cellule embrionali di topo da lentivirus.

<table><tbody><tr>Sistema <td>plasmidico CD510B-1</td><td>Biosciences</td><td>CD510B-1</td><td>utilizzato per confezionare il lentivirus che esprime EF1a-copGFP</td></tr><tr><td>Dimetilpolisilossano</td><td>Sigma</td><td>DMPS5X</td><td>coltura di embrioni</td></tr><tr><td>ialuronidasi</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td>utilizzato per rimuovere le cellule del cumulo</td></tr><tr><td>XYClone Laser</td><td>Hamilton Thorne Biosciences</td><td>perforazione di</td><td></td> uova</tr> <tr><td>fecondate di topoDispositivo per il trasferimento di embrioni non chirurgico (NSET)</td><td>ParaTechs</td><td>60010</td><td>NSET di embrioni</td></tr><tr><td>KSOM medium</td><td>Millipore</td><td>MR-020P-5F</td><td>che coltiva embrioni</td></tr><tr><td>Composizione di KSOM:</td><td></td><td></td><td>mg/100mL</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>555</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>18.5</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td>4.75</td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td></td><td></td><td>4.95</td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td></td><td></td><td>25</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td></td><td></td><td>210</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td></td><td></td><td>3.6</td></tr><tr><td>Na-piruvato</td><td></td><td></td><td>2,2</td></tr><tr><td>DL-acido lattico, sale</td><td></td><td></td> sodico <td>0,174 ml</td></tr><tr><td>10 mM EDTA</td><td></td><td></td><td>100&micro; L</td></tr><tr><td>Streptomicina</td><td></td><td></td><td>5</td></tr><tr><td>Penicillina</td><td></td><td></td><td>6,3</td></tr><tr><td>0,5% rosso</td><td></td><td></td> fenolo <td>0,1 ml</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td></td><td></td><td>14,6</td></tr><tr><td>MEM Aminoacidi</td><td></td><td></td> essenziali <td>1 ml</td></tr><tr><td>MEM AA non essenziale</td><td></td><td></td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td><forte>M2 medio</forte></td><td>Millipore</td><td>MR-015-D</td><td>che coltiva embrioni</td></tr><tr><td><forte>Composizione di M2:</forte></td><td></td><td></td><td><forte>mg/100mL</forte></td></tr><tr><td>Cloruro</td><td></td><td></td> di calcio <td>25,1</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio (anidro)</td><td></td><td></td><td>16,5</td></tr><tr><td>Cloruro</td><td></td><td></td> di potassio <td>35,6</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td></td><td></td><td>16,2</td></tr><tr><td>Bicarbonato</td><td></td><td></td> di sodio <td>35</td></tr><tr><td>Cloruro di</td><td></td><td></td> sodio <td>553,2</td></tr><tr><td>Albumina Frazione</td><td></td><td></td> bovina <td>400</td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>Na-HEPES</td><td></td><td></td><td>54,3</td></tr><tr><td>Rosso fenolo</td><td></td><td></td><td>1,1</td></tr><tr><td>Acido</td><td></td><td></td> piruvico <td>3.6</td></tr><tr><td>DL-acido lattico</td><td></td><td></td><td>295</td></tr></tbody></table>

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Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentivirus sono efficienti vettori per la consegna del gene in cellule di mammifero. A seguito di trasduzione, il genoma lentivirale stabile è incorporato nel cromosoma ospite ed è passato sopra alla progenie. Pertanto, essi sono vettori ideale per la creazione di linee cellulari stabilizzate, in vivo consegna degli indicatori e trasduzione di uova di singola cellula fecondata per creare animali transgenici. Tuttavia, mouse fecondato uova ed embrioni in fase precoce sono protetti dalla zona pellucida, una matrice di glicoproteina che forma una barriera contro la consegna del gene lentivirali. Lentivirus sono troppo grandi per penetrare la zona e sono in genere consegnati dal microinjection di particelle virali in cavità perivitellino, lo spazio tra la zona e le cellule embrionali. Il requisito per i tecnologi altamente qualificati e attrezzature specializzate è ridotto al minimo l'uso di lentivirus per consegna del gene di embrioni di topo. Questo articolo descrive un protocollo per permeabilizing le uova fecondata del mouse di perforare la zona con un laser. Perforazione laser non comporta alcun danno agli embrioni e permette lentivirus ottenere l'accesso alle cellule embrionali per consegna del gene. Trasdotte embrioni possono svilupparsi in blastocisti in vitro e se impiantati nei topi pseudopregnant, svilupparsi in cuccioli transgenici. Il laser utilizzato in questo protocollo è efficace e facile da usare. Geni consegnati da lentivirus stabile incorporano nelle cellule embrionali di topo e sono germinale trasmissibile. Si tratta di un metodo alternativo per la creazione di topi transgenici che non richiede nessun micromanipolazione e microiniezione di uova fecondate.

Sviluppo di uova mouse isolato/trasdotte fertilizzato può essere verificato sotto il microscopio ogni giorno (Figura 1). Gli embrioni sani si sviluppano in blastocisti entro 3-4 giorni. In questo protocollo, 60 – 70% degli embrioni non trattati sviluppano in blastocisti23. Su 114 embrioni trasdotte traforato al laser, 54 sviluppato in blastocisti (tasso del 47%) e 46 blastocisti espresso GFP (46/54 = 85%)23....

Mouse di uova fecondate ed embrioni in fase precoce sono protetti dalla zona pellucida, una matrice di glicoproteina che forma una barriera contro la consegna del gene. Questo articolo descrive un protocollo per la zona di perforazione con un laser per trasdurre cellule embrionali con vettori lentivirali e creare topi transgenici.

Laser-assistita lentivirali Gene consegna al Mouse fecondate le uova

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Questo è un metodo alternativo e facile da usare per fornire geni di interesse alle uova di topo fecondate tramite perforazione laser della zona pellucida e consegna del gene lentivirale. La perforazione assistita da laser della procedura del donatore di topi può essere applicabile anche alle uova fecondate di altre specie per facilitare l'ingresso di altri tipi di virus o reagenti di trasfezione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che non richiede competenze specializzate per la micromanipolazione e la micro iniezione delle uova di topo fecondate.A dimostrare la procedura di isolamento delle uova di topo fecondato sarà Page Myers, una ricercatrice della filiale di Medicina Comparata del NIEHS. Da 16 a 24 ore dopo l'accoppiamento, isolare le ovaie e gli ovadotti da topi femmine con spine vaginali, secondo protocolli standard. Quando tutti i tessuti sono stati raccolti, strappare l'ampolla di ogni ovaia e rilasciare le uova fecondate, circondate da cellule cumulate, e trasferire le uova in cellule cumulate in un piatto di 35 millimetri contenente una x ialuronidasi in mezzo M2 fresco, per un'incubazione da tre a cinque minuti a temperatura ambiente.Pipettare le uova alcune volte per rilasciare le cellule cumule e trasferire le uova in un nuovo piatto da 35 millimetri contenente mezzo M2, con pipettazione per lavare via l'enzima. Successivamente, trasferire le uova lavate in un piatto da 35 millimetri contenente mezzo ottimizzato simplex di potassio, o KSOM, e pipetta per lavare via il mezzo M2 rimanente e l'ialuronidasi. Quindi, trasferire le uova in piastre trattate con coltura tissutale di 35 millimetri sementi con 50 microlitri di KSOM e due millilitri di dimetilpolisiloxano per un equilibrazione di due ore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e ossigeno e 90% azoto.Mentre le uova sono nell'incubatrice, impostare e calibrare il laser XYClone, secondo le raccomandazioni del produttore. Quando le uova sono pronte, posizionare la prima piastra di caduta sullo stadio del microscopio laser e mettere a fuoco manualmente la zona pellucida. Dopo aver confermato che la luce led laser è visibile attraverso l'obiettivo, spostare lo stadio del microscopio per colpire la zona con il laser a LED e utilizzare il software del computer per impostare il laser XYClone su 250 microsecondi.Regolare le dimensioni della luce a LED in base alle dimensioni appropriate e perforare la zona pellucida di ogni uovo tre volte con il laser per produrre tre fori da 10 micrometri. È fondamentale eseguire rapidamente la perforazione, ma con attenzione, poiché le uova fecondate non possono tenere al di fuori dell'incubatrice per più di 15 minuti. Quindi, restituire le uova perforate all'incubatrice per altre due ore.Al termine della seconda incubazione, trattare la goccia KSOM da 50 microlitri con due microlitri di lentivirus concentrato senza miscelazione. E riportare le uova nell'incubatrice per quattro giorni. Quando le uova si sono sviluppate in blastocisti, utilizzare un dispositivo di trasferimento dell'embrione non chirurgico, per depositare circa 10-15 embrioni in circa due microlitri di KSOM.17 giorni dopo il trasferimento dell'embrione, consentire al topo incinta di partorire naturalmente o raccogliere i neonati per sezione cesarea se necessario. Quindi, raccogliere il tessuto dai cuccioli per il genotipizzazione, per determinare il tasso di transgenesi. Lo sviluppo isolato e trasdotto di uova fecondate con topo può essere controllato al microscopio ogni giorno.Dal 60 al 70% degli embrioni sani e non trattati si trasformano in blastocsti entro tre o quattro giorni. Mentre circa il 47% degli embrioni trasdotti perforati al laser si sviluppa in blastocsti, l'85% dei quali esprime il gene trasdotto di interesse. Puntare il laser a assottigliare la zona, invece di creare un foro, permette agli embrioni in via di sviluppo di beneficiare di una zona pellucida intatta e incapsulante pur rimanendo permissiva alla trasduzione lentivirale.La trasduzione con un lentivirus ricombinante, che esprime il copepode GFP da un fattore di allungamento 1A promoter induce molteplici integrazioni lentivirali e un'alta espressione di GFP sotto una lampada a LED blu. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che, mentre la capacità dei lentivirus di integrarsi nel genoma ospite li rende un potente strumento per il parto genico stabile, ma l'integrazione casuale può anche introdurre mutazioni inserizionali. Questa tecnica potrebbe consentire ai ricercatori nel campo della genetica di sviluppare rapidamente modelli animali transgenici per lo studio delle malattie per la produzione di proteine in vivo o per studi genici funzionali.Seguendo questa procedura, altri metodi come l'immunoistochimica possono essere eseguiti su campioni di tessuto isolati da cuccioli trasdotti per rispondere a domande aggiuntive sulla posizione e l'estensione dell'espressione genica in vari tessuti di interesse. Non dimenticare che lavorare con i lentivirus può essere estremamente pericoloso. Pertanto, si prega di seguire le linee guida istituzionali per lavorare con i lentivirus.Indossare indumenti protettivi personali e decontaminare tutti i rifiuti prima dello smaltimento.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Questa tecnica chirurgica illustra l'iniezione di vettori di terapia genica e cellule staminali nello spazio sottoretinico dell'occhio mouse.

Iniezione sottoretinico di vettori di terapia genica e cellule staminali nel Eye mouse

Fonte: Lutz, D., et al. Valutazione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturale dopo la trasduzione in utero del cervello di topo in via di sviluppo e del midollo spinale. J. Vis. Exp. (2019).Questo video dimostra la trasduzione virale tramite iniezione in utero in embrioni di topo. Una topolina incinta viene preparata per l'intervento chirurgico e viene praticata un'incisione sulla linea mediana per esporre le corna uterine. Una miscela di un virus contenente il gene desiderato e un...

Trasduzione virale in utero in un topo

Questo video descrive l'iniezione pronucleare di vettori lentivirali nello spazio perivitellino di un embrione di topo fecondato. Il lentivirus contiene il transgene, che viene incorporato nel genoma dell'embrione fecondato, dando infine origine a topi transgenici.

Iniezione di perivitellina basata su vettori lentivirali: un metodo per trasdurre il gene di interesse in ovociti fecondati di topo unicellulare

In questo video, dimostriamo la permeazione assistita da laser dello strato protettivo della zona pellucida in uova fecondate di topo per facilitare la consegna del gene lentivirale. Il lentivirus consente la generazione di animali transgenici con un gene di interesse stabilmente integrato nel loro genoma.

Consegna genica lentivirale assistita da laser: una tecnica per permeabilizzare gli ovuli fecondati di topo per facilitare la consegna del gene lentivirale

Questo protocollo mostra come eseguire la microiniezione citoplasmatica negli zigoti degli animali da allevamento. Questa tecnica può essere utilizzata per fornire qualsiasi soluzione nell'embrione unicellulare, come gli strumenti di editing del genoma per generare animali knockout.

Laser-assistita citoplasmatica microiniezione nel bestiame zigoti

Studi convenzionali di perdita di funzione di geni mediante animali knockout sono stati spesso lunghe e costose. Basato su elettroporazione mutagenesi somatica CRISPR-mediata è un potente strumento per capire il gene funziona in vivo. Qui, segnaliamo un metodo per analizzare i fenotipi di knockout in cellule di proliferazione del cervelletto.

CRISPR-mediata di perdita di funzione di analisi in granuli cerebellari cellule utilizzando nell'Utero basati su elettroporazione trasferimento del Gene

Qui, presentiamo un protocollo per promuovere l'integrazione del transgene e produzione di topi transgenici fondatore con alta efficacia mediante una semplice iniezione di un vettore lentivirale nello spazio perivitellino di un ovocita fecondato.

Produzione di topi transgenici mediata lentivirali: un metodo semplice ed altamente efficiente per uno studio diretto dei fondatori

Descriviamo un protocollo per l'esecuzione di un trapianto in utero (IUT) attraverso vie endovenosa e intra-amniotic di iniezione nel modello murino. Questo protocollo consente di introdurre cellule, vettori virali e altre sostanze nell'unico ambiente fetale immunitario-tollerante.

Endovenosa e Intra-amniotic nell'Utero trapianto nel modello murino

Questo articolo ha lo scopo di fornire la metodologia per la transgenesi lentivirale negli embrioni di ratto utilizzando iniezioni multiple di una sospensione di un virus nello spazio perivitelina dello zigote. I ratti femmina che vengono accoppiati con un ceppo maschile fertile con un diverso colore di pelliccia dominante viene utilizzato per generare madri adottive pseudoincinte.

Generazione di ratti transgenici con un approccio al vettore lentivirale

Qui descriviamo una metodologia di screening CRISPR/Cas9 in vivo rapida e diretta utilizzando iniezioni lentivirali embrionali guidate da ultrasuoni in utero per valutare contemporaneamente le funzioni di diversi geni nella pelle e nella cavità orale dei topi immunocompetenti.

Screening CRISPR/Cas9 in vivo per valutare contemporaneamente la funzione genica nella pelle del topo e nella cavità orale

Qui presentiamo un protocollo per lo sviluppo di modelli murini geneticamente modificati utilizzando cellule staminali embrionali, in particolare per il knock-in del DNA di grandi dimensioni (KI). Questo protocollo è ottimizzato utilizzando l'editing del genoma CRISPR / Cas9, con conseguente miglioramento significativo dell'efficienza KI rispetto al tradizionale metodo di targeting linearizzato del DNA mediato dalla ricombinazione omologa.

Targeting genico altamente efficiente mediato da CRISPR/Cas9 in cellule staminali embrionali per lo sviluppo di modelli murini manipolati da geni

Scopri la consegna genica lentivirale assistita da laser nelle uova fecondate di topo. Questo metodo permette di creare modelli transgenici con tassi di espressione dell'85% e sviluppo embrionale del 47%.

Laser-assistita lentivirali Gene consegna al Mouse fecondate le uova

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