Name: 种系线虫与胸苷模拟教育的细胞周期分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 学习使用EdU标记技术对秀丽隐杆线虫种系进行细胞周期分析，该方法无需转基因且兼容免疫荧光染色。此技术可研究S期细胞动态，适用于衰老与营养相关生物学问题。

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我们感谢大肠杆菌（E. coli）菌种中心提供MG1693菌株；Wormbase数据库；由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40OD010440）资助的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis）遗传学中心提供实验菌株；Zach Pincus在统计学方面的建议；Aiping Feng提供的试剂；Luke Schneider、Andrea Scharf、Sandeep Kumar和John Brenner在实验培训、建议、支持以及有益讨论方面的帮助；以及Kornfeld实验室和Schedl实验室对本稿件提出的反馈意见。本研究部分得到美国国立卫生研究院[National Institutes of Health，项目编号R01 AG02656106A1（资助KK）、R01 GM100756（资助TS）]以及美国国家科学基金会研究生奖学金[National Science Foundation predoctoral fellowship，项目编号DGE-1143954和DGE-1745038（资助ZK）]的支持。美国国立卫生研究院和美国国家科学基金会均未参与本研究的设计、数据收集、分析与解释，也未参与稿件撰写。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

制备EdU标记的细菌（步骤1）对于本实验方案至关重要，也是故障排查的首要环节。野生型年轻成虫雌雄同体在4小时EdU脉冲标记中可获得非常可靠的标记效果，因此可作为每一批新制备EdU标记细菌的有效对照。此外，完整进入肠道的EdU标记细菌（在老年线虫或某些咽部/研磨器功能缺陷突变体中）可通过点击化学反应进行标记，并在肠道中呈现为明亮的椭圆形点状结构。另一种标记雌雄同体的方法是采用高浓度（1 mM）EdU进行“浸泡”处理3。该方法在标记期间会使线虫处于饥饿状态，但在排查固定和点击化学反应问题时，可作为一种无需制备EdU标记细菌的有效替代方案。如果EdU“浸泡”实验成功而EdU喂养实验失败，则应重新制备新鲜的EdU标记细菌。为了在达到足够细菌密度的同时实现较高的EdU掺入量，可能需要调整EdU和胸腺嘧啶的浓度。
该技术在标记S期方面的主要局限在于需要向动物喂食带有EdU标记的细菌。由于基因型或发育阶段原因无法进食的动物，可能无法通过此技术进行标记。然而，核苷类似物目前仍是识别秀丽隐杆线虫（C. elegans）生殖系中处于S期...

在动物发育过程中，需要经过数百次、数千次、数百万次、数十亿次甚至数万亿次的细胞分裂才能形成成体生物。细胞周期是一系列细胞事件的总称，包括G1期（间隙期）、S期（合成期）、G2期（间隙期）和M期（有丝分裂期），定义了每次细胞分裂所执行的事件序列。细胞周期是动态的，最理想的是在实时观察下进行研究，但这在技术上可能较为困难。本实验方案中介绍的技术能够使研究者通过静态图像来测量细胞周期各时相及其时间进程。
使用核苷类似物（如5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）或5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU））标记是研究成年秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，简称 C. elegans）雌雄同体生殖系细胞周期动态中鉴定S期的金标准1,2,3,4,5。EdU和BrdU几乎可在任何遗传背景下使用，因其不依赖于任何遗传构建体。BrdU的可视化需要强烈的化学处理以暴露抗原，便于抗BrdU抗体染色，但该过程常与通过其他抗体共染色来评估其他细胞标志物的方法不兼容。相比之下，EdU的可视化通过温和条件下的点击化学反应实现，因此可与抗体共染色兼容6,7。
该标记的特异性十分明确，因为只有在S期，细胞核才会将胸苷类似物（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）掺入DNA中。可视化过程在固定组织中进行。EdU标记本身不可见，直到含有叠氮基团的染料或荧光染料通过铜催化的点击化学反应与EdU中的炔基发生共价结合8。通过短时间脉冲标记，EdU标记可立即提供处于S期的细胞核信息。此外，通过脉冲-追踪或连续标记，EdU还可提供动态信息；例如，在脉冲-追踪实验中，随着细胞每次分裂，标记会被稀释，或随着非分裂细胞的发育进程而持续传递。
C. elegans 雌雄同体的生殖系是研究信号通路、干细胞、减数分裂和细胞周期的有力模型系统。成体生殖系呈极性排列，类似于流水线结构：在远端存在干细胞，随后细胞进入并推进减数分裂前期，同时在更近端区域与配子发生的不同阶段相协调（图1）。在近端，卵细胞成熟后被排卵并受精，并在子宫内启动胚胎发育9,10,11。靠近远端顶端细胞、长度约为20个细胞直径的区域，包含进行有丝分裂循环的生殖系干细胞、前体细胞以及减数分裂S期细胞，但不包括处于减数分裂前期的细胞，该区域被称为前体细胞区2,4,9,12。在远端生殖系中，细胞膜并未完全分隔各个细胞核，但前体细胞区的细胞在很大程度上独立进行有丝分裂周期。年轻成体雌雄同体的生殖系前体细胞区细胞的中位有丝分裂周期时长约6.5小时；G1期极短或缺失，且未观察到细胞静止状态1,2,13。生殖系干细胞的分化主要通过直接分化实现，因此不存在过渡性扩增分裂4。在粗线期的分化过程中，大约每5个细胞核中有4个不会形成卵细胞，而是通过凋亡途径作为滋养细胞，将其胞质内容物贡献给正在发育的卵细胞12,14,15。
除了使用核苷类似物标记S期细胞外，还可以通过抗体染色来鉴定处于有丝分裂和减数分裂的细胞。处于有丝分裂期的细胞核对磷酸化组蛋白H3（Ser10）抗体（简称pH3）呈免疫阳性反应7,16。处于减数分裂期的细胞核对HIM-3抗体（一种减数分裂染色体轴蛋白）呈免疫阳性反应17。前体区的细胞核可通过缺乏HIM-3、存在核质中的REC-818，或存在WAPL-119来识别。WAPL-1的信号强度在体细胞性腺中最高，在前体区较高，在减数分裂早期前期较低19。通过略微调整实验方案，可进行多种细胞周期参数的测量：I）鉴定S期细胞核并计算S期指数；II）鉴定M期细胞核并计算M期指数；III）确定细胞核处于有丝分裂还是减数分裂的S期；IV）测量G2期持续时间；V）测量G2+M+G1期的持续时间&#160;；VI）测量减数分裂起始速率；VII）估算减数分裂进程速率。
仅通过少数几种湿实验即可获得多个细胞周期的测量数据。以下方案描述了通过喂养进行30分钟脉冲标记的方法 秀丽隐杆线虫 成年雌雄同体线虫以EdU标记的细菌喂养，并通过抗pH3抗体染色标记M期细胞，同时利用抗WAPL-1抗体染色标记前体区细胞。仅持续时间的变化&#160;EdU孵育（步骤2.5）、所用抗体类型（步骤5）以及分析方法（步骤8.3）是进行额外测量所必需的。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli MG1693&lt;/em&gt;</td><td>大肠杆菌遗传资源中心</td><td>6411</td><td>在标准未添加成分的LB培养基中生长良好</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli OP50&lt;/em&gt;</td><td>秀丽隐杆线虫遗传资源中心</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 成像试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>5-乙炔基-2&amp;prime;-脱氧尿苷</td><td>西格玛</td><td>900584-50MG</td><td>或使用试剂盒中提供的EdU</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>西格玛</td><td>D9434-500G</td><td>D-(+)-右旋糖</td></tr><tr><td>硫胺素（维生素B1）</td><td>西格玛</td><td>T4625-5G</td><td>试剂级</td></tr><tr><td>胸苷</td><td>西格玛</td><td>T1895-1G</td><td>生物试剂</td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>西格玛</td><td>M1880-1KG</td><td>MgSO4，试剂级</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠，无水</td><td>菲舍尔</td><td>BP332-500G</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>西格玛</td><td>P5379-500G</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>西格玛</td><td>A4514-500G</td><td>NH4Cl，试剂级+</td></tr><tr><td>细菌学琼脂</td><td>US Biological</td><td>C13071058</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>西格玛</td><td>C3881-500G</td><td>CaCl</td></tr><tr><td>LB肉汤（Miller配方）</td><td>西格玛</td><td>L3522-1KG</td><td>使用浓度为25 g/L</td></tr><tr><td>左旋咪唑</td><td>西格玛</td><td>L9756-5G</td><td>0.241 g/10 ml</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Calbiochem Omnipur</td><td>6506</td><td>自制PBS效果同样良好</td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>西格玛</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>16% 电镜级多聚甲醛安瓿瓶</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710</td><td>10 ml 安瓿瓶</td></tr><tr><td>100% 甲醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A454-1L</td><td>高品质甲醇对某些抗体获得良好形态至关重要</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>吉布科</td><td>16210-072</td><td>批号 1671330</td></tr><tr><td>兔抗WAPL-1抗体</td><td>Novus 生物公司</td><td>49300002</td><td>批号 G3048-179A02，使用稀释比例为1:2000</td></tr><tr><td>小鼠抗pH3单克隆抗体（克隆3H10）</td><td>密理博</td><td>05-806</td><td>批号#2680533，使用稀释比例为1:500</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG-Alexa Fluor 594标记二抗</td><td>英杰公司</td><td>A11012</td><td>批号 1256147，使用稀释比例为1:400</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG-Alexa Fluor 647标记二抗</td><td>英杰公司</td><td>A21236</td><td>批号 1511347，使用稀释比例为1:400</td></tr><tr><td>含4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）的Vectashield抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>也可使用不含DAPI的封片剂，随后单独进行DAPI孵育</td></tr><tr><td>指甲油</td><td>Wet n Wild</td><td>DTC450B</td><td>任何透明指甲油均可使用</td></tr><tr><td>S培养基</td><td>多种来源</td><td></td><td>参见wormbook.org上的实验方案</td></tr><tr><td>M9缓冲液</td><td>多种来源</td><td></td><td>参见wormbook.org上的实验方案</td></tr><tr><td>M9琼脂</td><td>多种来源</td><td></td><td>配方与M9缓冲液相同，但添加1.7%琼脂</td></tr><tr><td>线虫生长培养基</td><td>多种来源</td><td></td><td>参见wormbook.org上的实验方案</td></tr><tr><td>解剖用表面皿</td><td>Carolina Biological</td><td>42300</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm实验室封口膜</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM-996</td><td>4英寸宽实验室封口膜</td></tr><tr><td>培养皿</td><td></td><td></td><td>直径60 mm</td></tr><tr><td>长型玻璃巴斯德吸管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml 离心管</td><td>MidSci Avant</td><td>2926</td><td></td></tr><tr><td>吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 ml 锥形瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G 5/8&amp;rdquo; 针头</td><td>BD PrecisionGlide&amp;nbsp;</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 玻璃离心管</td><td>Pyrex&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml 硼硅酸盐玻璃管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 × 40 mm 的1号盖玻片</td><td></td><td></td><td>1.5号盖玻片也可能适用</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 摇床培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>临床离心机</td><td>IEC</td><td>428</td><td>配备6孔摆动转子</td></tr><tr><td>小型离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;deg;C 培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C 冰箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &amp;deg;C 冰柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1 显微镜</td><td>蔡司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo 63X 1.4 油镜物镜</td><td>蔡司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraview Vox 转盘共聚焦系统</td><td>PerkinElmer&amp;nbsp;</td><td></td><td>尼康转盘共聚焦系统效果也很好，详见：http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

细胞周期分析在 秀丽隐杆线虫 使用胸苷类似物edu标记生殖系

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

真核生物的细胞周期分析通常利用染色体形态、细胞周期各阶段所需基因产物的表达和/或定位，或核苷类似物的掺入来进行。在S期，DNA聚合酶将胸苷类似物（如EdU或BrdU）掺入染色体DNA中，从而标记细胞以供分析。对于C. elegans，可在常规培养过程中通过喂食方式给予线虫核苷类似物EdU，且该方法与免疫荧光技术兼容。C. elegans的生殖系是研究信号通路、干细胞、减数分裂和细胞周期的强有力模型系统，因其组织透明、遗传操作简便，并且减数分裂前期及细胞分化/配子发生过程以线性组装的方式依次进行。这些特性使得EdU成为研究有丝分裂细胞动态行为及生殖系发育的优良工具。本实验方案详细描述了如何成功制备含EdU的细菌，喂食野生型C. elegans雌雄同体个体，解剖其生殖腺，对DNA中的EdU掺入进行染色，使用抗体检测多种细胞周期和发育标志物，成像生殖腺并分析结果。本方案还阐述了在测定S期指数、M期指数、G2期持续时间、细胞周期总时长、减数分裂进入速率以及减数分裂前期进程速率时，实验方法与分析中的各种变异条件。该方法可进一步调整，用于研究其他组织、发育阶段、遗传背景及生理条件下细胞的周期进程或细胞历史。

由于DNA合成是掺入EdU所必需的，因此可以推断，EdU标记的细胞核在EdU标记的时间窗口内经历了S期。在30分钟EdU标记细菌喂养实验中标记的细胞核可被解释为在解剖时正处于S期的细胞核。在较长时间连续EdU喂养实验中标记的细胞核可能是在时间窗口早期被标记并已离开S期，也可能是在EdU标记时间窗口的后期阶段被标记。EdU信号与DAPI信号共定位。在某些细胞核中，EdU信号覆盖所有染色体，而在其他细胞核中，EdU信号局限于1–2个明亮的点状结构（图4）。这些点状结构很可能是X染色体，其在S期晚期进行复制13。
在此实验中，动物持续摄取EdU 30分钟，随后按上述方法及图5所示进行解剖。一个年轻成年动物中EdU染色成功的示例和一个年老成年动物中EdU染色失败的示例见图4。30分钟标记产生的EdU信号定位于祖细...

本文描述了一种基于成像的方法，可用于利用胸苷类似物EdU鉴定秀丽隐杆线虫（C. elegans）雌雄同体生殖系中的S期并分析细胞周期动态。该方法无需使用转基因，且与免疫荧光染色兼容。

细胞周期分析在 秀丽隐杆线虫 使用胸苷类似物EdU标记生殖系

真核生物中的细胞周期分析常利用染色体形态、不同周期阶段所需基因产物的表达和/或定位……

该方法有助于解答有关秀丽隐杆线虫（C.elegans）细胞周期和生殖系干细胞群体动态的关键问题。该技术的主要优势在于无需使用转基因，可与免疫荧光染色兼容，并且能够经过修改以研究多种不同条件下细胞的状态。当我首次看到Scheda实验室应用该方法时，感到非常兴奋。尽管该方法可为秀丽隐杆线虫（C.elegans）的细胞周期提供研究线索，也可应用于有关衰老、营养或基因型改变的更广泛问题。通常，初次使用该方法的实验室可能在初期的个体分离或秀丽隐杆线虫苏木精染色步骤中遇到困难。首先，采用无菌技术，将200微升10毫摩尔的EdU加入含100毫升M9缓冲液及适当补充物的4毫升新鲜培养过夜的MG 1693大肠杆菌（E.coli）培养物中。制备idiodiscious需要在EdU和胸腺嘧啶补充之间保持精细的平衡。胸腺嘧啶的量必须足以支持大肠杆菌良好生长，而EdU的量则必须足以提供对水平化作用的强效保护。在37°C、200 RPM条件下培养不超过24小时后，采用无菌操作技术将培养物分装至两到四个无菌的50毫升锥形管中，用于离心。用4毫升新鲜M9缓冲液重悬沉淀，并使用同一支移液器将约8滴EdU标记的E. coli MG1693溶液加至室温下的60毫升M9琼脂培养皿中央。为将EdU标记的细菌喂食给线虫，使用新鲜PBS将C. elegans从线虫生长培养基培养皿中冲洗至1.5毫升离心管中，并通过重力让线虫短暂沉降。用1毫升PBS洗涤线虫1至2次，并使用玻璃巴斯德移液器将线虫转移至EdU细菌草坪中央，以微量PBS液滴承载。等待几分钟，待液体被吸收后，根据实验方案在20摄氏度条件下孵育培养物至少30分钟。孵育结束后，使用两毫升PBS将EdU培养板中的线虫冲洗至玻璃解剖皿中。按照先前所述方法解剖并固定线虫性腺后，用添加0.1%吐温20的PBS冲洗一个小型1毫升硼硅酸盐玻璃管和一支长玻璃巴斯德吸管，并用该吸管将固定后的性腺转移至玻璃管中，加入少量含吐温20的PBS。通过离心收集性腺，并使用细长的玻璃巴氏吸管尽可能吸除上清液，注意不要扰动性腺沉淀。进行EdU检测时，向性腺中加入100 µL的点击化学EdU反应混合液，用实验室封口膜覆盖管口，在室温下孵育30至60分钟。孵育结束后，先用100 µL反应清洗缓冲液洗涤性腺一次，再用1 mL含吐温的PBS缓冲液洗涤四次。最后一次洗涤后，向样品中加入 25 µL 含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂。在封片剂覆盖性腺的同时，将一个较大的 2.5% 琼脂糖垫放置在标准玻璃载玻片上，然后用另一张载玻片压平。接下来，使用一根长玻璃巴斯德吸管，将所有液体和性腺保留在吸管狭窄的尖端，以在将性腺转移至琼脂糖垫时尽量减少样品损失。用一根粘在牙签上的睫毛轻轻将性腺在琼脂糖垫上分散开，并去除任何灰尘颗粒。然后缓慢地将一块矩形玻璃盖玻片盖在性腺上，注意避免产生气泡，并用实验用纸巾吸除多余的溶液。可靠地进行三维细胞计数需要一定的练习。使用 Fiji 的细胞计数插件并结合脚本标记细胞，以去除重复计数，有助于提高计数的可重复性。在盖玻片静置过夜后，利用细胞计数插件和 Fiji 手动计数每个细胞核，并根据是否存在磷酸化组蛋白 H3、EdU 或前体区细胞标记，对每个单独的细胞核进行标注。EdU信号与DAPI信号共定位。在某些细胞核中，EdU信号覆盖所有染色体，而在另一些细胞核中，EdU信号定位于一至两个明亮的点状区域，可能位于S期晚期复制的X染色体上。成功进行30分钟标记后，EdU信号出现在前体区约一半的细胞核中。尽管该技术在野生型年轻成虫中效果稳定，但大量交配后的5日龄雌雄同体在30分钟的EdU脉冲标记中未能成功标记。通过分析在时间过程中处于M期且EdU阳性的细胞核所占百分比，可估算G2期的持续时间，从而计算出G2期的中位数和最长时间。根据前生殖区所有细胞核中EdU阳性细胞核所占的百分比，可估算G2期和G1期的持续时间，进而计算这两个时期合并后的最长时间。在进行该操作时，需注意使用同一批制备的EdU培养皿，以尽量减少实验间的变异性。完成此操作后，可进行其他方法，如使用额外抗体染色，或解答有关细胞周期、细胞命运或信号通路的其他问题。请注意，使用核苷类似物和多聚甲醛可能存在危险，操作时应始终采取预防措施，例如佩戴腈类手套。

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科研

JoVE Journal

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发育生物学

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利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷掺入法测定酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的S期持续时间

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细胞周期分析在秀丽隐杆线虫使用胸苷类似物EdU标记生殖系

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