Name: Sistema di coltura cellulare 3D per studiare linvasione e la valutazione terapeutica nel cancro della vescica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Scopri un metodo in vitro con sferoidi tumorali per studiare l'invasione del cancro della vescica in tempo reale. Questa tecnica consente di testare composti terapeutici e analizzare le interazioni cellulari con immunofluorescenza.

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Gli autori vorrei ringraziare il laboratorio del Dr. Howard Crawford (Università del Michigan) per supporto tecnico e fornire materiali e attrezzature per questo studio e Alan Kelleher per il supporto tecnico.
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dalla University of Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), bè YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).

1. crescente cancro sferoidi
<ol><li>
Crescita da linee cellulari
	<ol>
<li>Cellule di cancro alla vescica umane cultura sotto aderente convenzionale delle condizioni di coltura di cellule e mantengono in incubatore a 37 ° C, fornito con 5% CO2. Mantenere le cellule a < confluency di 90%. Nota: mezzi di coltura utilizzati è di Dulbecco modificato supporto essenziale minimo (DMEM) contenente 4,5 g/L D-glucosio, L-Glutammina, piruvato di sodio di 110 mg/L e fornito con 10% siero bovino fetale (FBS) in tutto questo protocollo.</li>
		<li>Un giorno prima dell'inizio dell'esperimento, tripsinizzano (utilizzando 0,25% tripsina-EDTA) quantificare la concentrazione cellulare di cellule e distribuire 1 x 106 cellule in 3 mL di coltura in ciascun pozzetto di una piastra di attacco 6 pozzetti ultra-basso.</li>
		<li>Incubare le cellule in condizioni di attacco basso a 37 ° C per ≥ 16 h. Questo dovrebbe consentire tempo sufficiente per celle da aggregare in sferoidi per la maggior parte delle linee cellulari di cancro della vescica. Nota: La formazione di sferoidi possa essere osservata al microscopio invertito campo luminoso. La dimensione ottimale e il numero di sferoidi può dipendere da diversi esperimenti, ma troviamo che sferoidi con diametri da 50 µm a 150 µm sono generalmente adatti per time-lapse imaging utilizzando un obiettivo X 20.</li>
		<li>Per incorporare i tipi di cellule supplementari, come fibroblasti o cellule immuni in sferoidi, mescolare le cellule desiderate con le cellule tumorali al rapporto desiderato (1:1, 01:10, ecc.) in un allegato di ultra-basso piastra e incubare a 37 ° C per ≥ 16 h permettere la formazione di sferoidi di tipo misto delle cellule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Crescita da tumori primari Nota: Tumore sferoidi possono anche essere derivati dal tumore primario della vescica fonti quali i tumori sviluppati da indotto da agente della vescica tumore modelli8. Ad esempio, i tumori della vescica generati dai topi nutriti con N-butilico - N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamina (BBN), possono essere raccolte e tritato in piccoli pezzi (circa 0,5 mm3) utilizzando strumenti chirurgici sterili. Digerito campioni primari della vescica umana cancri possono essere studiati anche in questo sistema.<ol>
<li>Raccogliere e lavare i 0,5 mm3 pezzi di tumore in tampone fosfato salino di 5 mL ghiacciata (PBS). Centrifugazione a 200 x g per 5 min a 4 ° C. Ripetere questo passaggio di lavaggio una volta.</li>
		<li>Raccogliere i pezzi del tumore mediante centrifugazione a 200 x g per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e aggiungere 5 mL di DMEM contenente 10% FBS. Trasferite il composto di tumore sferoide e media ad una piastra di attacco 6 pozzetti ultra-basso. Incubare a 37 ° C per ≥ 16 h prima di incorporare nella matrice del collagene (Vedi punto 2.3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione della camera 3D cultura
<ol><li>
Diluire il collagene di tipo 1 (derivato dalla coda di topo) in DMEM contenente 10% FBS per fare una miscela di 2 mg/mL secondo le istruzioni del produttore.
	<ol>
<li>Insomma, mix collagene con adeguate quantità di soluzione di NaOH N 1 e DMEM pipettando delicato basate su istruzioni del produttore per raggiungere il pH fisiologico.</li>
		<li>Dopo la miscelazione del collagene e DMEM, rapidamente ricoprire i pozzi della diapositiva da camera (per la maggior parte delle applicazioni, diapositive di camera con un vetro di copertura numero 1.5 è ottimale) con la miscela di collagene-DMEM prima di solidificazione (200 µ l/pozzetto). Lasciar camera rivestita all'essere fermo a temperatura ambiente per 15 min. Nota: La composizione della matrice a base di collagene può essere modificata con l'aggiunta di altri ingredienti di matrice extracellulare, come fibronectina o laminina, secondo le finalità dell'esperimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Delicatamente Dispensare 500 µ l di media che contengono sferoidi (o pezzi di tumore, se si utilizza un campione di tumore primario) dalla piastra di attacco 6 pozzetti ultra-basso in una microcentrifuga da 1,5 mL vuoto. Attendere 2 minuti per lasciare gli sferoidi depositano alla parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il surnatante dal tubo. Preparare un altro tubo di collagene di tipo 1 (2 mg/mL) mescolato con DMEM contenente 10% FBS e rapidamente aggiungere 500 µ l di questa miscela di sferoidi. Mescolare delicatamente le sferoidi e collagene pipettando lento.</li>
	<li>Aggiungere 250 µ l di miscela di sferoidi/collagene in un pozzetto di diapositiva di collagene pre-rivestite da camera. Consentire la matrice di collagene che contengono sferoidi a solidificare completamente (circa 30 min a 37 ° C).</li>
	<li>Dopo che la matrice del collagene è solidificata, aggiungere 1 mL di DMEM contenente 10% FBS in ciascun pozzetto (Figura 1B). Incubare il vetrino di alloggiamento in un incubatore a 37 ° C fino al momento per l'imaging in dotazione con 5% CO2 .</li>
</ol>3. live Cell Imaging time-lapse
<ol><li>Accendere il microscopio confocale seguendo le istruzioni del produttore e assicurarsi che la camera climatica raggiunge i 37 ° C e viene fornita con 5% CO2. Nota: Il nostro microscopio e camera richiedono solitamente 1h per raggiungere l'equilibrio del sistema.</li>
	<li>Trasferire con cautela la diapositiva di alloggiamento per l'adattatore di diapositiva collegato al microscopio.</li>
	<li>Individuare le sferoidi di interesse utilizzando un obiettivo di bassa potenza (ad es., 5x) e avviare imaging con l'obiettivo di potenza più elevato (in protocollo attuale, un obiettivo X 20 è usato per la maggior parte dell'imaging cellule vive per la sua qualità di immagine migliore). Nota: Per i campioni di tumore primario della vescica, 5 X e 10 X gli obiettivi possono essere necessaria al fine di coprire la più grande area di imaging. Per il nostro Time-lapse imaging, l'intervallo di formazione immagine è impostato come 30 min e una pila di Z viene utilizzata per l'intero della sferoide di immagine. In genere la distanza tra le fette di Z è impostata a 4 µm per il 20X obiettivo e la distanza totale dell'asse Z è circa 200 µm. le immagini possono essere ottenute utilizzando DIC e con fluorescenza se cellule/tessuti harbor marcatori delle proteine fluorescenti.</li>
	<li>Eseguire imaging time-lapse per 24-72 h. Nota: La durata è determinata dal tipo di cella e le esigenze dell'esperimento.</li>
</ol>4. preparazione del campione blocco contenente sferoidi di cancro per il taglio di tessuto congelato
<ol><li>Sollevare con cautela il blocco di gel di collagene e sferoidi dalle diapositive camera usando il piccolo forcipe. Posizionare il blocco di gel di collagene in uno stampo di plastica istologia.</li>
	<li>Risciacquare il gel di collagene con 1x PBS brevemente e poi fissarlo con paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS per 30 min a temperatura ambiente. Attenzione: PFA è potenziale cancerogeno e deve essere maneggiato con cura.</li>
	<li>Lavare il gel di collagene con 1,5 mL di PBS 1X su un agitatore per 15 min. Sostituisci il PBS e ripetere il passaggio precedente lavaggio 3 x.</li>
	<li>Applicare uno strato sottile (circa 3 mm) di temperatura di taglio ottimale (OCT) composto per coprire il fondo di uno stampo di plastica istologia nuovo. Posto fisso e gel di collagene in cima il OCT. lavato composto, quindi accuratamente incorporare il gel tutto riempiendo lo stampo con OCT composto, evitando la formazione di bolle d'aria nello strumento di personalizzazione.</li>
	<li>Lasciare lo stampo a 4 ° C per 1 h.</li>
	<li>Posizionare lo stampo contenente il campione e l'OCT composto su una piastra Petri 100 mm flottante su azoto liquido. Lasciare il campione flash-congelare completamente.</li>
	<li>Memorizzare il blocco campione congelato a-80 ° C per un uso futuro.</li>
</ol>5. immunofluorescenza Imaging per cancro sezionato congelati sferoidi
<ol><li>Trasferimento il blocco campione congelato dal congelatore-80 ° C alla camera di-20 ° C di un criostato.</li>
	<li>
Eseguire la divisione surgelati convenzionale impostando l'intervallo di sezione a 7 µm. Lasciate che campioni sezionati allegare al vetrino senza rughe o intrappolata aria.
	<ol>
<li>Memorizzare le diapositive a-80 ° C prima di eseguire ulteriore colorazione. Nota: Diversi intervalli possono essere utilizzati per adattarsi alle esigenze sperimentali.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Asciugare i vetrini per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Permeabilize i campioni con PBS contenente 0.5% Triton X-100 per 15 min.</li>
	<li>Lavare i campioni 3 volte con PBS per 10 min a lavaggio.</li>
	<li>Circondano i campioni sulla diapositiva con barriere idrofobiche utilizzando una penna di barriera idrofoba.</li>
	<li>Trattare i campioni con soluzione bloccante (1x PBS contenente 5% albumina di siero bovino (BSA)), per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Applicare 40 µ l di soluzione contenente anticorpo primario (1x PBS contenente 5% BSA con diluizione 1: 100 di anticorpo primario) per ogni campione sulla diapositiva.</li>
	<li>Incubare i vetrini in anticorpo primario a 37 ° C per 1 h o a temperatura ambiente durante la notte (il tempo di incubazione e le condizioni variano a seconda dell'anticorpo primario).</li>
	<li>Lavare i campioni 3 volte con PBS per 15 min (a lavaggio).</li>
	<li>Applicare 40 µ l di soluzione contenenti anticorpi secondari (1x PBS contenente il 5% di BSA con diluizione di 1: 300 anticorpo secondario) per ogni campione sulla diapositiva.</li>
	<li>Lavare i campioni 3 volte con PBS per 15 min (a lavaggio).</li>
	<li>Macchia con Hoechst 33342 soluzione (1 µ g/mL, diluito in PBS) i campioni a temperatura ambiente per 10 min. Quindi lavare campioni con PBS per 5 min.</li>
	<li>Montare i campioni con mezzo di montaggio e coprirli con dimensioni appropriate vetrini coprioggetto. Lasciare le diapositive al buio a temperatura ambiente per 24 h e quindi eseguire la microscopia confocale.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Qui descriviamo un modello di sferoide di tumore 3D che permette l'osservazione in tempo reale di invasione di cancro della vescica, che è critica per metastasi e progressione del cancro. Questo sistema è favorevole all'incorporazione di varie componenti stromal e cellulare per consentire ai ricercatori di riepilogo meglio il microambiente del tessuto dove si svolge l'invasione del cancro della vescica. Sferoidi di cancro della vescica possono essere generati da varie fonti quali linee cellulari (compreso linee cellulari...

L'invasione è un passaggio fondamentale nella progressione del cancro, che è richiesto per la metastasi ed è associata con la bassa sopravvivenza e prognosi in pazienti. Nel cancro alla vescica umano, la neoplasia più comune dell'apparato urinario che provoca circa 165.000 morti all'anno in tutto il mondo, la fase di cancro, il trattamento e la prognosi sono direttamente correlati alla presenza o all'assenza di invasione1. Circa il 75% dei casi di cancro alla vescica sono non muscolo-invasivo e sono gestiti con resezione locale. Al contrario, i tumori della vescica muscolo-invasivo (circa il 25% dei casi) sono tumori aggressivi con gli alti tassi metastatici e sono trattati con terapia aggressiva di multimodality2,3. Di conseguenza, capire le vie molecolari che attivano l'invasione è essenziale per caratterizzare meglio il rischio di progressione invasiva e sviluppare interventi terapeutici che possono impedire la progressione invasiva.
Progressione invasiva del tumore si verifica in un ambiente complesso tridimensionale (3D) e comporta l'interazione delle cellule del tumore con altre cellule del tumore, stroma, membrana basale e altri tipi di cellule compreso le cellule immuni, fibroblasti, cellule muscolari e vascolari cellule endoteliali. Supporto permeabile (ad es., Transwell) sistemi di dosaggio sono comunemente impiegati per quantificare il cancro delle cellule invasione4, ma questi sistemi sono limitati perché non consentono al microscopio di monitoraggio del processo di invasione in tempo reale e la recupero dei campioni per ulteriori macchiatura e l'analisi molecolare è impegnativo. Sviluppo di un sistema di sferoide di tumore della vescica 3D per studiare invasione è auspicabile perché permette l'incorporazione di componenti microambientali definiti con la convenienza di sistemi in vitro .
In questo protocollo, descriviamo un sistema per interrogare i processi invasivi delle cellule di cancro alla vescica umano usando un'analisi di invasione di sferoide 3D che incorporano le matrici gel a base di collagene e microscopia confocale per consentire ai ricercatori di monitorare la motilità cellulare e invasione in tempo reale (Figura 1A). Questo sistema è versatile e può essere modificato per interrogare le varie impostazioni/tumore stromal. E ' possibile incorporare la maggior parte delle linee cellulari di cancro della vescica o tumori della vescica primario e altre cellule stromal come cancro associato fibroblasti e cellule del sistema immunitario5,6,7. Questo protocollo descrive una matrice composta da collagene di tipo 1, ma può essere modificato per incorporare altre molecole quali fibronectina, laminina o altre proteine di collagene. Processi invasivi possono essere seguiti per 72 h o più a seconda della capacità del sistema utilizzato e microscopio. Fissazione e colorazione di immunofluorescenza del tumore incorporato nella matrice 3D, prima, durante e dopo l'invasione permette l'interrogatorio di sovraregolati proteine in cellule invasive, fornendo così informazioni cruciali che solitamente assenti o difficili da raccogliere utilizzo di altri modelli 3-d cultura. Questo sistema può essere utilizzato anche per composti di schermo che bloccano l'invasione e delineare vie di segnalazione colpite da tali composti.

<table><tbody><tr><td>Linee cellulari di cancro della vescica umana UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Terreno di coltura cellulare DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Costar Cluster a 6 pozzetti con attacco ultrabasso</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito convenzionale</td><td>Carl Zeiss</td><td>491206-0001-000</td><td>Uso generale per colture cellulari e controllo degli sferoidi</td></tr><tr><td>Collagene di tipo 1 dalla coda di ratto, ad alta concentrazione</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Coverglass camerato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM800</td><td>Un miscoscopio confocale con camera climatica, imaging multi-posizione e funzione di scansione Z-stack&nbsp;</td></tr><tr><td>Micromtome Criostato</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Zen 2 Software di elaborazione delle immagini&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Barriera idrofobica PAP</td><td>Pen Vector Laboratories&nbsp;</td><td>Composto H4000</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>soluzione Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-ATDC (Trim29)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA020053</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Citocheratina 14</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Vimentina</td><td>Abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Supporto di montaggio</td></tr></tbody></table>

sistema di coltura cellulare 3d per studiare l'invasione e la valutazione terapeutica nel cancro della vescica

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Cancro alla vescica è un problema significativo per la salute. Si stima che più di 16.000 persone moriranno quest'anno negli Stati Uniti dal cancro alla vescica. Mentre il 75% dei cancri alla vescica sono non-invasivo e rischiano di riprodurrsi per metastasi, circa il 25% progredire ad un modello di crescita dilagante. Fino a metà dei pazienti con i tumori invasivi si svilupperà letale ricaduta metastatica. Così, la comprensione del meccanismo della progressione invasiva nel cancro alla vescica è fondamentale prevedere gli esiti dei pazienti e prevenire le metastasi letale. In questo articolo, presentiamo un modello di invasione del tridimensionale che permette l'incorporazione delle cellule del tumore e componenti stromal di imitare in vivo le condizioni che si verificano nel microambiente del tumore della vescica. Questo modello offre l'opportunità di osservare il processo invasivo in tempo reale usando la formazione immagine di time-lapse, interrogare le vie molecolari coinvolte utilizzando composti immunofluorescenti confocal di formazione immagine e schermo con il potenziale di invasione di blocco. Mentre questo protocollo si concentra sul cancro della vescica, è probabile che simili metodi potrebbero essere utilizzati per esaminare l'invasione e la motilità in altri tipi di tumore.

Creazione riuscita di sferoide di tumore cancro invasivo della vescica richiede la formazione di sferoidi di dimensioni del tumore da linee cellulari o tumori primari. Figura 2 A Mostra dimensioni appropriate sferoidi sviluppati da quattro linee di cellulari del cancro alla vescica umane in (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J e UM-UC18). Figura 2 B viene illustrato uno sferoide di tumore da un tumore...

I processi che governano l'invasione della vescica cancro rappresentano opportunità di biomarcatore e sviluppo terapeutico. Qui vi presentiamo un modello di invasione del cancro della vescica che incorpora 3-d cultura di sferoidi di tumore, time-lapse imaging e microscopia confocale. Questa tecnica è utile per definire le caratteristiche del processo invasivo e per lo screening di agenti terapeutici.

Sistema di coltura cellulare 3D per studiare l'invasione e la valutazione terapeutica nel cancro della vescica

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

La progressione invasiva è un determinante cruciale dell'esito clinico nei pazienti con carcinoma della vescica. Qui descriveremo un semplice metodo in vitro, che utilizza sferoidi tumorali generati utilizzando linee cellulari o tumori primari per studiare l'invasione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che siamo in grado di monitorare il processo di invasione del cancro in tempo reale e di utilizzare anche la colorazione immunofluorescente per interrogare i campioni alla fine dell'esperimento.Questa tecnica può essere personalizzata per incorporare altri tipi di cellule, come i fibroblasti o le cellule immunitarie. Può anche essere utilizzato per testare composti che potrebbero essere utili per bloccare l'invasione. I fattori critici per il successo includono l'ottimizzazione della formazione di sferoidi tumorali e l'inclusione nel collagene, l'uso di una microscopia appropriata con una corretta distanza di lavoro e procedure di immunocolorazione appropriate.Per iniziare a generare sferoidi da linee cellulari, coltivare cellule tumorali della vescica umana in condizioni convenzionali di coltura cellulare ad aderenza. Un giorno prima dell'esperimento, tripsinizzare le cellule e distribuire 1.000.000 di cellule in tre millilitri di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Successivamente, incubare le cellule in condizioni di basso attaccamento a 37 gradi Celsius per almeno 16 ore.Per generare sferoidi da tumori primari, raccogliere e lavare pezzi di tumore cubi da 0,5 millimetri in cinque millilitri di PBS ghiacciato. Centrifugare i pezzi tumorali a 200 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, raccogliere i pezzi di tumore tramite centrifugazione a 200 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Quindi rimuovere il surnatante e aggiungere cinque millilitri di DMEM integrati con il 10% di FBS. Trasferire la miscela di terreni sferoidi tumorali in una piastra di attacco ultra bassa a sei pozzetti. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per almeno 16 ore.Innanzitutto, diluire il collagene di tipo uno in DMEM integrato con il 10% di FBS per ottenere una miscela di due milligrammi per millilitro. Quindi rivestire rapidamente i pozzetti di un vetrino da camera con la miscela. Tenere fermo il vetrino della camera a temperatura ambiente per 15 minuti.Successivamente, pipettare delicatamente 500 microlitri di terreno sferoidale dalla piastra di attacco ultra-bassa in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi lasciare che gli sferoidi si depositino sul fondo del tubo per due minuti. Rimuovere con cautela il surnatante dal tubo.Quindi aggiungere rapidamente 500 millilitri di miscela di collagene fresco DMEM agli sferoidi. Pipettare su e giù per mescolare delicatamente gli sferoidi e il collagene. Quindi aggiungere 250 microlitri della miscela di collagene sferoidale ai pozzetti del vetrino della camera rivestita di collagene.Lasciare che la matrice di collagene contenente lo sferoide si solidifichi completamente. Dopo che la matrice di collagene si è solidificata, aggiungere un millilitro di DMEM integrato con FBS a ciascun pozzetto dei vetrini della camera. Quindi incubare il vetrino della camera a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2.Preparare il microscopio confocale secondo le istruzioni del produttore e assicurarsi che la camera climatica raggiunga i 37 gradi Celsius e sia alimentata con il 5% di CO2. Quindi, trasferire il vetrino da camera nell'adattatore per vetrini da microscopio. Utilizzando un obiettivo a bassa potenza, individuare gli sferoidi di interesse, quindi avviare l'imaging con un obiettivo ad alta potenza ed eseguire l'imaging time lapse per 24-72 ore.Per prima cosa, usa una piccola pinza per sollevare il blocco di gel di collagene e sferoidi dal vetrino della camera. Quindi posizionare il blocco di gel di collagene in uno stampo istologico di plastica. Sciacquare brevemente il blocco di gel di collagene con 1x PBS.E fissalo con il 4% di PFA e PBS per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare il blocco di gel di collagene con 1,5 millilitri di 1x PBS su uno shaker per 15 minuti. Applicare uno strato sottile di composto OTC sul fondo di un nuovo stampo istologico in plastica.Quindi posizionare il blocco di gel di collagene fissato e lavato sopra il composto OTC prima di riempire accuratamente il resto dello stampo con il composto OTC. Tenete lo stampo a quattro gradi per un'ora. Successivamente, congelare lo stampo su una capsula di Petri da 100 millimetri che galleggia su azoto liquido e conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius.Trasferire il blocco di campioni congelato nella camera a meno 20 gradi Celsius di un criostato. Quindi eseguire il sezionamento congelato convenzionale con un intervallo di sezione di sette micrometri. Dopodiché, asciugare i vetrini all'aria per un'ora a temperatura ambiente.Quindi permeabilizzare i campioni per 15 minuti con PBS contenente lo 0,5% di Triton X-100. Quindi, lavare i campioni con PBS tre volte per 10 minuti ciascuno. Quindi circondare i campioni con una penna barriera idrofobica.Trattare i campioni con una soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente. Quindi applicare 40 microlitri di soluzione contenente anticorpi primari su ciascun campione. Incubare i vetrini per un'ora a 37 gradi Celsius.Successivamente, lavare il campione tre volte con PBS per 15 minuti per lavaggio. Applicare quindi 40 microlitri di soluzione contenente anticorpi secondari su ciascun campione. Quindi lavare i campioni tre volte con PBS per 15 minuti per lavaggio.Colorare il campione con la soluzione Hoechst 33342 a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi lavare i campioni con PBS per cinque minuti. Montare i campioni con il mezzo di montaggio e coprirli con vetrini.Infine, lasciare i vetrini al buio a temperatura ambiente per 24 ore prima di eseguire la microscopia confocale. In questo protocollo, gli sferoidi tumorali invasivi del cancro della vescica sono stati formati da linee cellulari e tumori primari. Un video time lapse rappresentativo mostra l'invasione di sferoidi tumorali del cancro alla vescica nella matrice di collagene.Un video time lapse rappresentativo dimostra il comportamento invasivo degli sferoidi tumorali del cancro della vescica marcati con GFP da soli o in co-coltura con fibroblasti marcati con RFP. Per dimostrare la fattibilità dell'utilizzo della colorazione immunofluorescente dei marcatori proteici, gli sferoidi sono stati fissati, sezionati e colorati a 24 o 72 ore. La vista con ingrandimento più elevato degli sferoidi UM-UC-14 mostra una colorazione filamentosa per la proteina associata al gruppo D dell'atassia teleangectasia.Le cellule altamente invasive disseminate dagli sferoidi UM-UC-18 dopo 24 ore dall'invasione, esprimono un alto livello di Vimentina, un marcatore di transizione da epiteliale a mesenchimale. Questo test è utile per screening limitati di inibitori farmacologici dell'invasione del cancro della vescica. La citocalasina D è usata qui per rappresentare l'inibizione farmacologica dell'invasione.Qui descriviamo un modello che consente l'osservazione in tempo reale dell'invasione del cancro della vescica. Questo sistema è suscettibile di incorporare vari componenti stromali e cellulari, il che consente agli investigatori di ricapitolare meglio il microambiente tissutale in cui avviene l'invasione del cancro alla vescica. Questo sistema non solo fornisce uno strumento utile per studiare l'invasione in ambiente 3D, ma è anche adatto per lo screening limitato di composti farmaceutici che hanno il potenziale di bloccare l'invasione delle cellule tumorali.

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Flusso di fluido interstiziale è elevata in tumori solidi e in grado di modulare l'invasione delle cellule tumorali. Qui si descrive una tecnica per applicare il flusso di fluido interstiziale alle cellule incorporati in una matrice e quindi misurare i suoi effetti sulla invasione cellulare. Questa tecnica può essere facilmente adattato per studiare altri sistemi.

Tridimensionale Cultura modello cellulare per misurare gli effetti del flusso del fluido interstiziale sulla Invasion cellule tumorali

Questo video fornisce una metodologia dettagliata per far crescere cellule di cancro al seno in una matrice proteica di membrana basale 3D, esemplificando il potenziale della coltura 3D nella valutazione dell'invasione cellulare nell'ambiente circostante.

Saggio della membrana basale di coltura 3D: coltura di cellule tumorali su matrice proteica della membrana basale 3D per studiare l'invasione cellulare

Questo articolo fornisce metodologie dettagliate per l'utilizzo di tridimensionali (3D) test per quantificare l'invasione delle cellule di cancro al seno. In particolare, discuteremo le procedure necessarie per configurare tali analisi, quantificazione e analisi dei dati, così come i metodi per esaminare la perdita dell'integrità della membrana che si verifica quando le cellule invadono.

Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello

L'invasione dei tessuti normali circostanti è una caratteristica distintiva dei tumori maligni. Forniamo qui un semplice saggio semi-automatico su micropiastra dell'invasione in una biomatrice 3D naturale che è stata esemplificata con una serie di modelli di tumori umani avanzati.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Questo metodo valuta l'invasione delle cellule tumorali dagli sferoidi in una matrice 3D circostante.  Gli sferoidi vengono generati con il metodo della coltura a goccia sospesa e quindi incorporati in una matrice composta da materiali a membrana basale e collagene di tipo I.  L'invasione degli sferoidi viene successivamente monitorata.

Un Cancer Cell Saggio sferoide valutare Invasion in un Ambiente 3D

Le cellule tumorali vengono incorporate in un gel di collagene e poi inserite in un gel di fibrina acellulare per generare un sistema di coltura 3D in cui l'invasività e la formazione di tumori satelliti possono essere monitorate.

Three-Dimensional Cultura Assay per esplorare Cancer Cell invasività e formazione di tumori Satellite

Questo protocollo fornisce passaggi sperimentali dettagliati per stabilire una coltura tridimensionale in vitro degli organoidi tumorali della vescica derivati dal cancro della miscite della vescica indotta da cancerogeni cancero. Sono descritti metodi di coltura tra cui passaggio, ingegneria genetica e trapianto ortotopico di organoidi tumorali.

Cultura, manipolazione e trapianto ortotopico di organidi tumorali della vescica del topo

L'approccio presentato valuta simultaneamente l'invasione delle cellule tumorali nei saggi dello sferoideo 3D e nella citotossicità delle cellule T. Gli spheroidi sono generati in un cast multi-microwell senza scaffold. La co-coltura e l'incorporamento nella matrice di collagene di tipo I vengono eseguite all'interno dello stesso dispositivo che permette di monitorare l'invasione delle cellule tumorali e la citotossicità mediata a cellule T.

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Gli organoidi derivati dal paziente (DOP) sono un potente strumento nella ricerca traslazionale sul cancro, che riflette sia l'eterogeneità genetica che fenotipica della malattia e la risposta alle terapie antitumorali personalizzate. Qui, viene dettagliato un protocollo consolidato per generare DOP di carcinoma della vescica primario umano in preparazione per la valutazione delle analisi fenotipiche e delle risposte ai farmaci.

Coltura di organoidi del cancro della vescica come strumenti di medicina di precisione

Descriviamo un approccio per rilevare e catturare sottopopolazioni cellulari invasive in tempo reale. Il progetto sperimentale utilizza l'analisi cellulare in tempo reale monitorando i cambiamenti nell'impedenza elettrica delle cellule. Il cancro invasivo, le cellule immunitarie, endoteliali o stromali nei tessuti complessi possono essere catturati e l'impatto delle co-colture può essere valutato.

Rilevamento e acquisizione in tempo reale di sottopopolazioni cellulari invasive da co-colture

L'invasione è un importante fenomeno biologico nello sviluppo e nella progressione del cancro. Questo processo è influenzato dalle cellule non neoplastiche e dai componenti del microambiente tumorale. Lo scopo di questo studio è quello di descrivere un metodo alternativo per analizzare l'invasione delle cellule tumorali in vitro utilizzando colture tridimensionali (3D).

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Scopri un metodo in vitro con sferoidi tumorali per studiare l'invasione del cancro della vescica in tempo reale. Questa tecnica consente di testare composti terapeutici e analizzare le interazioni cellulari con immunofluorescenza.

Sistema di coltura cellulare 3D per studiare l'invasione e la valutazione terapeutica nel cancro della vescica

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