Un metodo automatizzato per determinare le prestazioni della drosofila in risposta a variazioni di temperatura nello spazio e nel tempo
12 ottobre 2018
Qui presentiamo un protocollo per determinare automaticamente le prestazioni dell'apparato locomotore di Drosophila alle variazioni di temperatura usando un arena di temperatura programmabile che produce i cambiamenti di temperatura veloce ed accurato nel tempo e nello spazio.
Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave sulla risposta delle mosche ai cambiamenti di temperatura, come le differenze tra genotipi, l'interazione con altri segnali sensoriali o la funzione di diversi recettori della temperatura. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente molteplici variazioni di temperatura veloci e precise controllando il tempo e lo spazio e in modo automatizzato. Inizia posizionando 20 mosche maschili e 20 femmine in una bottiglia di allevamento contenente 45 millilitri di mezzo fly food e posizionando la bottiglia all'interno di un'incubatrice di 25 gradi celsius sotto 12 ore di luce, cicli scuri di 12 ore.
Dopo 10 giorni, anestetizza le mosche appena echiuse sui cuscinetti di anidride carbonica per un massimo di quattro minuti. E usa un pennello per raccogliere mosche vergini in fiale di allevamento a mosca da 2,5 per 9,5 centimetri contenenti 6,5 millilitri di mezzo di cibo mosca fresco, separati dal sesso in gruppi di 20 mosche per flaconcino. Quindi restituire le fiale all'incubatrice per cinque o sette giorni.
Per impostare un'arena a temperatura controllata, accendere l'arena e aprire lo script delle fasi di temperatura nel computer di controllo. Verificare che la sequenza di temperatura sia impostata correttamente e verificare che la durata di ogni fase sperimentale sia impostata su 60 secondi. Nella sezione iniziale del blocco sperimentale, confermare queste impostazioni: il numero desiderato di fasi, l'impostazione iterativa on/off dei diodi indicativi di emissione di luce rossa, due gradi celsius di aumento della temperatura per fase e 16 gradi celsius come temperatura iniziale.
Eseguire quindi lo script delle fasi di temperatura. Il software verrà inizializzato per cinque secondi e quindi si fermerà. Per gli esperimenti comportamentali sulla temperatura, posizionare un filo di nastro conduttivo bianco sulla parte superiore delle piastrelle di rame dell'arena, assicurando che tutti i bordi siano coperti.
Posizionare un anello di alluminio riscaldato intorno alle piastrelle di rame e utilizzare un tessuto pulito per pulire la copertura di vetro. Posizionare il coperchio sulla parte superiore dell'anello di alluminio, lasciando uno spazio attraverso il quale una mosca può essere soffiata e toccare una fiala a mosca acclimatata due volte per forzare le mosche verso il fondo del flaconcino. Usando un aspiratore di bocca, intrappolare una mosca e chiudere il flaconcino prima di rimetterlo nell'incubatrice.
Soffiare la mosca nell'arena attraverso lo spazio tra la copertura di vetro e l'anello di alluminio e spingere immediatamente il trifoglio di vetro per colmare lo spazio. Posizionare un fotogramma di luci intorno all'arena per garantire un'illuminazione simmetrica e iniziare a registrare con il programma di registrazione video. Quindi premere la barra spazia spaziale del computer di controllo per iniziare a eseguire le fasi sperimentali.
Per tenere traccia dei video, apri il software di tracciamento dei passaggi di volo e apri il file di configurazione all'interno della cartella fly tracker. Impostare il percorso dei video nella cartella video e i nomi dei video nei file video. Specifica i bordi dell'arena di volo nelle impostazioni dell'arena in base alle coordinate x/y pixel di più punti sul bordo dell'arena.
Specifica la posizione dei LED rossi inattivi in impostazioni LED, in base alle coordinate x/y pixel della posizione del centro dei LED. Per controllare la posizione dei bordi dell'arena di volo, impostare il debug su true nelle impostazioni dell'arena, fare clic su Salva ed eseguire lo script nel terminale. Un'acquisizione dello schermo del video apparirà con un quadrato blu formato dalle coordinate immesse nelle impostazioni dell'arena.
Quindi impostare il debug nelle impostazioni dell'arena su false. Fare clic su Salva ed eseguire nuovamente lo schermo nel terminale per avviare il processo di rilevamento. In un tipico esperimento comportamentale di temperatura, singole mosche esposte a 16, 20 o 24 gradi celsius mostrano una locomozione più alta all'inizio dell'esperimento, rispetto a dopo cinque minuti.
L'arena a temperatura controllata può anche essere utilizzata per confrontare le risposte comportamentali della mosca provenienti da diversi background genetici con i cambiamenti dinamici della temperatura. Ad esempio, in questo esperimento, la velocità di tutte le specie testate è aumentata in base alle proprie curve di risposta con l'aumentare della temperatura, fino a raggiungere un punto di massime prestazioni, dopo di che le loro velocità sono decadite e le mosche sono morte. Quando le singole mosche sono state esposte a 40 gradi celsius nel mezzo e una piastrella laterale, con l'altra piastrella laterale a 22 gradi celsius, le mosche di tipo Selvaggio hanno rapidamente smesso di muoversi lungo l'arena e rimangono nella posizione confortevole.
Al contrario, il classico mutante di memoria Dunce vola a esplorare l'arena e trascorrere meno tempo dei controlli nella posizione confortevole. Inoltre, le combinazioni di test di temperatura e posizione sono utili anche per comprendere la funzione dei diversi recettori della temperatura durante i cambiamenti dinamici della temperatura. Come illustrato in questo esperimento in cui i singoli mutanti d melanogaster sono stati esposti ad temperature crescenti, mentre è stata fornita anche una posizione comoda e mutevole a 22 gradi celsius.
Durante l'esecuzione di queste procedure, ricorda di eseguire i passaggi in ordine e rapidamente in modo da poter catturare il maggior numero possibile di comportamenti delle mosche. Accanto a questa procedura altri metodi come geotassi negativi o test di strozzamento termico possono essere utilizzati per rispondere a domande aggiuntive come dove si muovono normalmente le mosche o hanno una normale resistenza al calore. Le implicazioni di questa tecnica si estendono fino a comprendere disturbi neurologici o mutazioni in cui la percezione della temperatura o il dolore giocano un ruolo.
In generale, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché ogni passaggio è semplice da solo, ma è necessario che siano perfettamente coordinati, quindi la tecnica deve essere praticata.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per valutare le prestazioni locomotorie di Drosophila in risposta a variazioni di temperatura, utilizzando un'arena controllata da programma con temperatura regolabile. Il metodo permette variazioni rapide e precise della temperatura, facilitando lo studio delle risposte dei moscerini ai cambiamenti ambientali.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia del Comportamento
- Sensibilità alla Temperatura
Background
- Drosophila funge da organismo modello per lo studio delle interazioni genetiche e ambientali.
- Le variazioni di temperatura possono influenzare in modo significativo l'attività locomotoria e il comportamento.
- Comprendere queste risposte può fornire informazioni sui processi sensoriali e sull'adattamento.
- I metodi automatizzati aumentano la precisione nelle condizioni sperimentali.
Scopo dello studio
- Studiare le prestazioni locomotorie di Drosophila a diverse temperature.
- Esplorare le differenze nelle risposte tra diversi genotipi.
- Analizzare le interazioni con altri stimoli sensoriali.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di un'arena programmabile con controllo della temperatura.
- Posizionamento di moscerini maschi e femmine in ambienti controllati.
- Monitoraggio dell'attività locomotoria in condizioni di temperatura variabili.
- Raccolta automatica dei dati per un'analisi accurata.
Risultati principali
- Dimostrata la capacità di modificare rapidamente le temperature e valutare il comportamento delle mosche.
- Identificate differenze significative nella performance locomotoria tra diversi genotipi.
- Messi in evidenza interazioni tra le risposte alla temperatura e i segnali sensoriali.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un quadro solido per lo studio della sensibilità alla temperatura in Drosophila.
- I risultati contribuiscono alla comprensione degli effetti genetici e ambientali sul comportamento.
- Studi futuri potranno sfruttare questa tecnica per applicazioni più ampie nelle neuroscienze.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente una valutazione ad alto rendimento e automatizzata delle prestazioni locomotorie dipendenti dalla temperatura in Drosophila, fornendo dati fenotipici quantitativi per la validazione di bersagli in studi neurogenetici. Catturando le risposte comportamentali dinamiche a stimoli termici controllati spazialmente e temporalmente, supporta l’analisi meccanicistica e la riduzione del rischio nei percorsi di rilevamento della temperatura, rilevanti per modelli di dolore e disturbi sensoriali. Il tracciamento automatizzato e il controllo riproducibile dell’ambiente aumentano l'affidabilità predittiva nei flussi di lavoro iniziali di scoperta che coinvolgono studi sulle funzioni geniche e sulle interazioni con l'ambiente.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi del contributo genetico ai fenotipi di risposta termica, supportando la validazione funzionale di geni e vie neuronali coinvolti nella percezione della temperatura.
- Valore operativo: Permette il confronto diretto tra ceppi mutanti e selvatici in condizioni ambientali identiche e programmabili, al fine di isolare effetti specifici del genotipo.
- Valore predittivo: Genera curve di prestazione simili a quelle dose-risposta lungo gradienti di temperatura, facilitando l'identificazione di soglie funzionali e gradienti di gravità fenotipica per la priorizzazione di target.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Produce output quantificabili del movimento (velocità, preferenza di posizione) che fungono da letture fenotipiche robuste e ricche di informazioni per lo screening di librerie genetiche o modulatori farmacologici della sensibilità termica.
- Valore operativo: Il tracciamento automatico mediante video e la standardizzazione dell'arena riducono la variabilità tra esperimenti, consentendo saggi scalabili e riproducibili, adatti a campagne di screening da medio ad alto rendimento.
- Prontezza del saggio: Genera metriche comportamentali normalizzate che possono essere confrontate tra diversi genotipi e lotti sperimentali, favorendo la validazione del saggio e la riproducibilità tra laboratori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza traslazionale: Modella i meccanismi di adattamento termico negli eterotermi, offrendo spunti sui percorsi conservati di termosensazione neuronale con possibili implicazioni per i bersagli mammiferi coinvolti nel dolore e nella termoregolazione.
- Continuità preclinica: Permette la valutazione longitudinale delle curve di prestazione termica, supportando decisioni di avanzamento ponderate sui rischi nei percorsi di validazione dei bersagli, grazie all'individuazione di relazioni genotipo-fenotipo-ambiente.
- De-risking meccanicistico: Consente l'analisi della funzione dei recettori termici mediante profili termici spaziali e temporali, riducendo l'ambiguità nell'associare lesioni genetiche a deficit nel processamento sensoriale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, collegando la perturbazione genetica a un output comportamentale quantificabile in un contesto ambientale controllato, sostenendo così gli sforzi di validazione dell'obiettivo guidati da ipotesi e l'identificazione di composti promettenti nella ricerca neurocomportamentale.
- Biologia della Scoperta: Supporta l'interrogazione sistematica della funzione dei geni coinvolti nella termosensibilità correlando il background genetico con le risposte locomotorie dinamiche a stimoli termici controllati.
- Screening: Fornisce letture comportamentali quantitative e standardizzate (ad esempio, velocità, preferenza spaziale) che permettono screening affidabili di composti o genotipi in vie sensibili alla temperatura.
- Analisi: Genera set di dati comportamentali risolti nel tempo e nella temperatura, adatti per il confronto statistico di curve di prestazione, soglie termiche simili all'EC50 e metriche basate sull'area sotto la curva tra gruppi sperimentali.
- Ricerca Translazionale: Collega i fenotipi di risposta termica di Drosophila a meccanismi conservati di trasduzione sensoriale, contribuendo alla validazione incrociata di bersagli in studi sulla termosensibilità e sul dolore.
- Riutilizzo Aziendale: L'arena automatizzata e la pipeline di tracciamento rappresentano una piattaforma riutilizzabile per lo studio delle interazioni gene-ambiente in molteplici modalità sensoriali oltre la termosensibilità.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce chiarezza meccanicistica sui circuiti neurali del rilevamento termico consentendo una stimolazione termica spazio-temporalmente precisa e una quantificazione automatizzata del comportamento.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità attraverso un controllo ambientale standardizzato, acquisizione automatica dei dati e riduzione della manipolazione manuale, minimizzando la variabilità dipendente dall'operatore.
- Valore strategico: Migliora l'affidabilità delle decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati fenotipici oggettivi e quantitativi, riducendo la dipendenza da valutazioni comportamentali soggettive negli schermi neurogenetici.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione mirata in base al rischio collegando lesioni genetiche a deficit misurabili nelle prestazioni termiche, favorendo l'identificazione precoce di bersagli terapeutici ad alta affidabilità.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel manipolaggio di Drosophila, nella progettazione di saggi comportamentali e nella configurazione di software di tracciamento basati su video.
- È dipendente da un'arena dotata di controllo termico, da un sistema di illuminazione sincronizzato e da sistemi di registrazione video per acquisire dati comportamentali e ambientali accurati.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda la calibrazione dell'arena, i parametri di tracciamento e le definizioni dei protocolli termici, al fine di garantire la riproducibilità tra diversi siti o utenti.
- L'adattamento ad altri modelli di insetti o a stimoli sensoriali differenti potrebbe richiedere una ricalibrazione delle dimensioni dell'arena, delle soglie di tracciamento e delle velocità di rampa termica, in base alle dimensioni specifiche della specie e alla cinetica delle risposte.
- I limiti pratici includono i vincoli sulla capacità produttiva dell'arena (un moscerino per ogni prova) e la necessità di una coordinazione procedurale meticolosa per mantenere l'allineamento temporale tra i cambiamenti termici e la registrazione del comportamento.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Fly and Temperature-Controlled Arena Preparation
2:02
Temperature Behavioral Experiments
3:13
Video Tracking and Data Analysis
4:31
Results: Representative Drosophila Performance Analyses in Response to Temperature Changes in Space and Time
6:08
Conclusion
