Un metodo automatizzato per determinare le prestazioni della drosofila in risposta a variazioni di temperatura nello spazio e nel tempo

Qui presentiamo un protocollo per determinare automaticamente le prestazioni dell'apparato locomotore di Drosophila alle variazioni di temperatura usando un arena di temperatura programmabile che produce i cambiamenti di temperatura veloce ed accurato nel tempo e nello spazio.

Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave sulla risposta delle mosche ai cambiamenti di temperatura, come le differenze tra genotipi, l'interazione con altri segnali sensoriali o la funzione di diversi recettori della temperatura. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente molteplici variazioni di temperatura veloci e precise controllando il tempo e lo spazio e in modo automatizzato. Inizia posizionando 20 mosche maschili e 20 femmine in una bottiglia di allevamento contenente 45 millilitri di mezzo fly food e posizionando la bottiglia all'interno di un'incubatrice di 25 gradi celsius sotto 12 ore di luce, cicli scuri di 12 ore.

Dopo 10 giorni, anestetizza le mosche appena echiuse sui cuscinetti di anidride carbonica per un massimo di quattro minuti. E usa un pennello per raccogliere mosche vergini in fiale di allevamento a mosca da 2,5 per 9,5 centimetri contenenti 6,5 millilitri di mezzo di cibo mosca fresco, separati dal sesso in gruppi di 20 mosche per flaconcino. Quindi restituire le fiale all'incubatrice per cinque o sette giorni.

Per impostare un'arena a temperatura controllata, accendere l'arena e aprire lo script delle fasi di temperatura nel computer di controllo. Verificare che la sequenza di temperatura sia impostata correttamente e verificare che la durata di ogni fase sperimentale sia impostata su 60 secondi. Nella sezione iniziale del blocco sperimentale, confermare queste impostazioni: il numero desiderato di fasi, l'impostazione iterativa on/off dei diodi indicativi di emissione di luce rossa, due gradi celsius di aumento della temperatura per fase e 16 gradi celsius come temperatura iniziale.

Eseguire quindi lo script delle fasi di temperatura. Il software verrà inizializzato per cinque secondi e quindi si fermerà. Per gli esperimenti comportamentali sulla temperatura, posizionare un filo di nastro conduttivo bianco sulla parte superiore delle piastrelle di rame dell'arena, assicurando che tutti i bordi siano coperti.

Posizionare un anello di alluminio riscaldato intorno alle piastrelle di rame e utilizzare un tessuto pulito per pulire la copertura di vetro. Posizionare il coperchio sulla parte superiore dell'anello di alluminio, lasciando uno spazio attraverso il quale una mosca può essere soffiata e toccare una fiala a mosca acclimatata due volte per forzare le mosche verso il fondo del flaconcino. Usando un aspiratore di bocca, intrappolare una mosca e chiudere il flaconcino prima di rimetterlo nell'incubatrice.

Soffiare la mosca nell'arena attraverso lo spazio tra la copertura di vetro e l'anello di alluminio e spingere immediatamente il trifoglio di vetro per colmare lo spazio. Posizionare un fotogramma di luci intorno all'arena per garantire un'illuminazione simmetrica e iniziare a registrare con il programma di registrazione video. Quindi premere la barra spazia spaziale del computer di controllo per iniziare a eseguire le fasi sperimentali.

Per tenere traccia dei video, apri il software di tracciamento dei passaggi di volo e apri il file di configurazione all'interno della cartella fly tracker. Impostare il percorso dei video nella cartella video e i nomi dei video nei file video. Specifica i bordi dell'arena di volo nelle impostazioni dell'arena in base alle coordinate x/y pixel di più punti sul bordo dell'arena.

Specifica la posizione dei LED rossi inattivi in impostazioni LED, in base alle coordinate x/y pixel della posizione del centro dei LED. Per controllare la posizione dei bordi dell'arena di volo, impostare il debug su true nelle impostazioni dell'arena, fare clic su Salva ed eseguire lo script nel terminale. Un'acquisizione dello schermo del video apparirà con un quadrato blu formato dalle coordinate immesse nelle impostazioni dell'arena.

Quindi impostare il debug nelle impostazioni dell'arena su false. Fare clic su Salva ed eseguire nuovamente lo schermo nel terminale per avviare il processo di rilevamento. In un tipico esperimento comportamentale di temperatura, singole mosche esposte a 16, 20 o 24 gradi celsius mostrano una locomozione più alta all'inizio dell'esperimento, rispetto a dopo cinque minuti.

L'arena a temperatura controllata può anche essere utilizzata per confrontare le risposte comportamentali della mosca provenienti da diversi background genetici con i cambiamenti dinamici della temperatura. Ad esempio, in questo esperimento, la velocità di tutte le specie testate è aumentata in base alle proprie curve di risposta con l'aumentare della temperatura, fino a raggiungere un punto di massime prestazioni, dopo di che le loro velocità sono decadite e le mosche sono morte. Quando le singole mosche sono state esposte a 40 gradi celsius nel mezzo e una piastrella laterale, con l'altra piastrella laterale a 22 gradi celsius, le mosche di tipo Selvaggio hanno rapidamente smesso di muoversi lungo l'arena e rimangono nella posizione confortevole.

Al contrario, il classico mutante di memoria Dunce vola a esplorare l'arena e trascorrere meno tempo dei controlli nella posizione confortevole. Inoltre, le combinazioni di test di temperatura e posizione sono utili anche per comprendere la funzione dei diversi recettori della temperatura durante i cambiamenti dinamici della temperatura. Come illustrato in questo esperimento in cui i singoli mutanti d melanogaster sono stati esposti ad temperature crescenti, mentre è stata fornita anche una posizione comoda e mutevole a 22 gradi celsius.

Durante l'esecuzione di queste procedure, ricorda di eseguire i passaggi in ordine e rapidamente in modo da poter catturare il maggior numero possibile di comportamenti delle mosche. Accanto a questa procedura altri metodi come geotassi negativi o test di strozzamento termico possono essere utilizzati per rispondere a domande aggiuntive come dove si muovono normalmente le mosche o hanno una normale resistenza al calore. Le implicazioni di questa tecnica si estendono fino a comprendere disturbi neurologici o mutazioni in cui la percezione della temperatura o il dolore giocano un ruolo.

In generale, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché ogni passaggio è semplice da solo, ma è necessario che siano perfettamente coordinati, quindi la tecnica deve essere praticata.