Protocollo clinico di produrre tessuto adiposo-derivato Stromal frazione vascolare per potenziale rigenerazione della cartilagine

L'osteoartrite è uno dei disturbi debilitanti più comuni tra la popolazione anziana. Al momento, non esiste una cura definitiva per le cause sottostanti dell'osteoartrite. Questo protocollo clinico descrive una procedura innovativa per un trattamento promettente, minimamente invasivo e alternativo dell'osteoartrite del ginocchio umano rigenerando la cartilagine come il tessuto.

L'osteoartrite è uno dei disturbi debilitanti più comuni tra la popolazione anziana. Al momento, non esiste una cura definitiva per le cause di sottolineatura dell'osteoartrite. Questo protocollo clinico è una procedura innovativa per un trattamento promettente, minimamente invasivo e alternativo dell'osteoartrite del ginocchio umano rigenerando il tessuto simile alla cartilagine.

Portare il paziente in una sala operatoria con una cappa di classe A a rischio biologico e posizionare lui o lei in una posizione supina. Pulire l'area addominale del paziente con iodio 5%betadina-povidina e drappeggiare il paziente utilizzando la tecnica sterile, esponendo l'area pulita dell'addome per la liposuzione. Circa cinque centimetri infero-lateralmente dall'ombelico, anestetizzano due siti, uno a sinistra e l'altro sul lato destro dell'ombelico di incisione da fare.

Utilizzo di due millilitri di lidocaina al 2% senza epinefrina con un ago da 1,5 pollici calibro 25 in una siringa da cinque millilitri iniettando ogni sito a livello epidermico. Anestetizzare il sito di incisione da fare utilizzando cinque millilitri di soluzione tumescente e siringa da 10 millilitri e l'ago da 1,5 pollici calibro 25. Fare due incisioni di 0,5 centimetri circa cinque centimetri sotto l'ombelico lateralmente pizzicando la pelle per sollevare la profondità del livello sottocutaneo.

Usando una lama numero 11, aiuta la pelle sollevata a penetrare fino al livello sottocutaneo ma a non penetrare attraverso la parete addominale. Utilizzando cannula calibro 20 centimetri 60, anestetizza il livello sottocutaneo dell'intera area dell'addome inferiore che deve essere liposuctioned con 700-800 millilitri della soluzione tumescente. Dopo aver terminato l'infiltrazione dell'intero addome inferiore con soluzione tumescente, preparare un apparato di liposuzione collegando una cannula da 3,0 millimetri collegata a una siringa da 60 millilitro o 30 millilitri per la liposuzione manuale o una cannula da 3,0 millimetri appositamente progettata collegata a un kit di centrifuga.

Una siringa a sistema chiuso sviluppata da noi stessi e approvata dalla FDA CDRH allo scopo di mantenere la sterilità collegata a una macchina per vuoto per la liposuzione assistita sottovuoto. Eseguire la liposuzione per ottenere da 100 a 110 grammi di tessuto adiposo esclusa la soluzione tumescente. Quando si esegue la liposuzione, il tessuto adiposo sarà ottenuto insieme alla soluzione tumescente ma deve essere separato e rimosso.

Per separare la soluzione tumescente prima per gravità, il tessuto adiposo nel kit di centrifuga può essere trasferito su una siringa da 60 millilitri e posizionare la siringa verso il basso. Ad esempio, la parte di apertura della siringa si trova nella parte inferiore. Aspettando da cinque a sei minuti, il tessuto adiposo e la soluzione tumescente saranno separati.

Rimuovere il fluido nella parte inferiore della siringa premendo sulla parte superiore dello stantuffo della siringa. Eseguire i passaggi precedenti da nove a 11 fino a quando non è stato accumulato un totale di 100 grammo a 110 grammi di aspirato lipidico del tessuto adiposo per ginocchio. Dopo aver separato la soluzione tumescente per gravità e aver accumulato da 50 a 55 grammi di aspirato lipidico per ogni sistema chiuso sterile kit centrifuga da 60 millilitri, posizionare i due kit di centrifuga in un secchio contenitore di centrifuga e girare a 1600 G per cinque minuti, condensando l'aspirazione lipidica e separando il fluido dal tessuto adiposo.

Questo processo condensa ulteriormente l'aspirato lipidico e può produrre olio grasso in alcuni casi. Facendo attenzione a non tremare, rimuovere il tappo di sicurezza e la spina nella parte inferiore del kit di centrifuga. Rimuovere il fluido inferiore spingendo lentamente verso il basso sopra lo stantuffo del kit di centrifuga.

Su una siringa separata da 60 millilitri, sciogliere 10 milligrammi di collagenasi, cinque milligrammi di collagenasi specifici per il tessuto connettivo e cinque milligrammi di collagenasi specifici per il tessuto adiposo con 50 millilitri di soluzione salina normale. Mescolare circa 25-30 millilitri di aspirato lipidico condensato con collagenasi disciolta, cinque milligrammi di collagenasi specifici per il tessuto connettivo e cinque milligrammi di collagenasi specifici per il tessuto adiposo ad un rapporto di uno a uno, volume/volume, collegando la siringa da 60 millilitri a un kit di centrifuga utilizzando un connettore specializzato. Mescolare accuratamente per condensare l'aspirato di preparazione e la collagenasi spingendo il contenuto tra la siringa da 60 millilitri e il kit di centrifuga utilizzando un'asta o un pusher.

Trasferire la miscela dell'aspirato lipidico e della collagenasi alla siringa da 60 millilitri. Collegare ogni siringa da 60 millilitri contenente la miscela con l'omogeneizzatore tissutale che contiene lame. Collegare una siringa vuota da 60 millilitri all'altra estremità dell'omogeneizzatore.

Spingere la miscela verso l'altra siringa da 60 millilitri attraverso l'omogeneizzatore per quattro o sei volte, con conseguente taglio e tritare l'aspirato lipidico. Trasferire l'aspirato lipidico omogeneizzato e la miscela collagenosa al kit di centrifuga da 60 millilitri attraverso un connettore specializzato. Posizionare i kit di centrifuga in un contenitore da posizionare in un incubatore che è stato preriscaldato a 37 gradi Celsius.

Incubare i due kit di centrifuga con la miscela omogeneizzata a 37 gradi Celsius per 40 minuti mentre si ruota a 45 giri/min. Dopo 40 minuti di incubazione, rimuovere il contenitore dall'incubatore in modo sterile. Quindi rimuovere i kit di centrifuga e metterli in una macchina di centrifuga.

Centrifugare le miscele a 800 G per cinque minuti per separare la SVF derivata dal tessuto adiposo. Dopo la centrifuga, il supernatante, che include collagenasi e tessuto adiposo digerito, viene rimosso da ogni kit di centrifuga rimuovendo il cappuccio della siringa sopra lo stantuffo e posizionando una siringa da 30 millilitri sull'apertura dello stantuffo attraverso una connessione di blocco della siringa. Premere lentamente verso il basso sulla parte della canna della siringa da 30 millilitri affinché il supernatante si riempia nella siringa da 30 millilitri.

Premere la canna della siringa da 30 millilitri fino agli ultimi tre o quattro millilitri del fondo del kit di centrifuga, lasciando solo gli ultimi tre o quattro millilitri di SVF derivato dal tessuto adiposo. Il supernatante viene scartato. Rimuovere la siringa da 30 millilitri dalla parte superiore dello stantuffo e riempire la siringa con una soluzione di suoneria lattata al 5%destrosio, nota anche come D5LR.

Attaccando la siringa da 30 millilitri riempita con D5LR sulla parte superiore dell'apertura dello stantuffo, riempire i kit di centrifuga contenenti da tre a quattro millilitri di SVF derivato dal tessuto adiposo con D5LR fino a 55 millilitri. Quindi rimuovere la siringa da 30 millilitri, cappuccio l'apertura dello stantuffo e centrifugare nuovamente i kit di centrifuga a 300 G per circa quattro minuti. Ripetere i passaggi da 17 a numero 21 per un totale di quattro lavaggi.

Dopo la quarta centrifuga, al fine di ottenere la SVF finale per iniezione, rimuovere il tappo di sicurezza e la spina all'apertura inferiore del kit centrifuga senza scuotere o ruotare il kit centrifuga. Collegare una siringa da 20 millilitri all'apertura inferiore del kit di centrifuga utilizzando un connettore appositamente progettato. Tirare lo stantuffo della siringa da 20 millilitri più volte avanti e indietro per scuotere le cellule che si sono depositate sul fondo del kit di centrifuga.

Rimuovere il volume totale desiderato della SVF contenente sia AST che ECM insieme ad altre cellule e tessuti. Di solito da tre a quattro millilitri da ogni kit di centrifuga per iniezioni di articolazione del ginocchio. Abbiamo fatto 30 millilitri di sangue autologo insieme a 2,5 millilitri di soluzione anticoagulante di destrosio citrato.

Quindi il sangue prelevato è stato trasferito ai kit di barili di centrifuga da 60 millilitri. È stato poi centrifugato a gravità 730 per cinque minuti. E il supernatante è stato rimosso e messo in un nuovo kit di barili di centrifuga da 60 millilitri.

Il supernatante fu centrifugato a gravità 1350 per quattro minuti, ottenendo 4,4 millilitri di PRP. Pulire il ginocchio del paziente con il 5% di betadina e drappeggiarlo in modo sterile. Palpare la parte anteriore del ginocchio per lo spazio articolare tra le ossa tibiali e femorali.

Anestetizzare superficialmente il sito di iniezione con lidocaina diluita, un millilitro di 1%lidocaina diluito con quattro millilitri di normale salina, dalla pelle all'appena fuori dalla capsula articolare. Quindi anestetizzare l'interno della capsula articolare con ropivacaina diluita, un millilitro 0,75% diropivacaina diluita con tre millilitri di soluzione salina normale. Mescolare due millilitri di HA con i sei-otto millilitri di SVF contenuti in una siringa da 20 millilitri attraverso un connettore siringa-siringa.

Utilizzando una siringa al connettore della siringa, aggiungere 0,4 millilitri di cloruro di calcio ai tre o quattro millilitri di PRP autologo che è già stato preparato ed essendo pronto in una siringa da cinque millilitri. Unire da 3,5 a 4,5 millilitri cloruro di calcio PRP in una siringa da cinque millilitri con da otto a 10 millilitri di miscela HA-SVF in una siringa da 20 millilitri attraverso un connettore siringa-siringa. Iniettare immediatamente la miscela, da circa 12 a 15 millilitri, lentamente nell'articolazione tibiale-femorale anteriore del ginocchio, utilizzando un ago da 38 millimetri calibro 18 con o senza la guida ad ultrasuoni.

Dopo l'iniezione, bendare il sito di iniezione con pressione piegando quattro volte la garza di cotone 4x4 e posizionando nastri sulla garza 4x4 piegata. Istruire il paziente a rimanere fermo per 60 minuti per consentire l'attacco cellulare. Istruisi il paziente a limitare le attività per un minimo di una settimana dopo la dimissione dalla clinica.

Rientro in clinica per altre tre iniezioni di PRP attivate dal cloruro di calcio nell'corso di tre settimane. Il paziente con OA di terza fase ha ricevuto il trattamento come descritto nella sezione del protocollo. Dopo la seconda settimana di iniezione della miscela ASV-ECM, il dolore e la ROM del paziente sono migliorati.

Alla 16a settimana, il dolore e la ROM del paziente migliorarono significativamente più del 70% La risonanza prima del trattamento, assunta dopo la 16a settimana, mostrò l'aumento dello spessore del tessuto simile alla cartilagine sul lato mediale del ginocchio. Un altro paziente con OA di terza fase ha ricevuto il trattamento come descritto nella sezione del protocollo. Dopo la seconda settimana di iniezione della miscela ASV-ECM, il dolore e la ROM del paziente sono migliorati.

Alla 18a settimana, il dolore e la ROM migliorarono significativamente fino all'80%La risonanza malata ripetuta scattata dopo la 18a settimana mostrò un aumento dell'altezza del tessuto simile alla cartilagine sul lato anteriore-mediale del ginocchio. Il terzo paziente con OA di terza fase ha ricevuto il trattamento come descritto nella sezione del protocollo. Dopo la seconda settimana di iniezione di miscela ASV-ECM, il dolore e la ROM del paziente sono migliorati di circa il 50% Entro la 22a settimana, il dolore e la ROM sono migliorati significativamente di oltre l'80%La risonanza ripetuta assunta dopo la 22a settimana ha mostrato un aumento dell'altezza del tessuto simile alla cartilagine sul lato mediale del ginocchio.

Attualmente non è disponibile alcuna terapia curativa per il trattamento dell'OA. Tuttavia, l'iniezione percutanea di terapia con cellule staminali con ASC e ECM omogeneizzato insieme all'HA e al PRP analogo attivato con cloruro di calcio può fornire un'alternativa all'attuale terapia di trattamento del trattamento dell'OA del ginocchio.