Inibizione della proteina viscoelastica e reversibile dominante-negativo (DN)

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in un'ampia varietà di campi che richiedono l'inattivazione condizionale e transitoria di un gene di interesse esprimendo in modo reversibile una versione negativa dominante di esso. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente solo un'ablazione parziale nell'attività proteica, preservando così un'espressione endogena residua. Anche se qui descriviamo l'inattivazione della condizione della proteina RB, che funziona in un assemblaggio multimerico, questa metodologia può essere applicata anche alle proteine monomeriche.

Umesh Pyakurel, il nostro tecnico di laboratorio e coautore del manoscritto dimostreranno le procedure. Per iniziare, far crescere le cellule NIH3T3, seguendo le specifiche del fornitore, a 37 gradi Celsius con 5%CO2, utilizzando il mezzo di coltura cellulare raccomandato contenente il 10% di siero bovino fetale. Per cotrasfettare le cellule utilizzando vettori pTet-Splice e pCMV-Tet3G, mescolare prima da due a quattro microlitri del reagente di trasfezione a base lipidica per pozzo e un millilitro di DMEM incompleto per pozzo in un tubo da 15 millilitri e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.