Un modello di linfoma della B-cellula Syngeneic del topo per la valutazione pre-clinica delle cellule di T di CD19 auto
16 ottobre 2018
Qui, presentiamo un protocollo per la produzione e la sperimentazione pre-clinica di cellule CD19 auto T murine di trasduzione retrovirale e l'utilizzazione come terapia contro il linfoma della B-cellula di A20 syngeneic stabilita nei topi BALB/c con o senza lymphodepleting pre-condizionamento.
Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nel campo della terapia immunitaria delle cellule T CAR, come la modificazione genetica delle cellule T CAR e la combinazione con altre terapie immunitarie. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente confronti tra il linfospleto e le impostazioni impoverite del linfo. Questo ci permette di vedere il ruolo delle cellule immunitarie endogene sia nella progressione della malattia che nella loro interazione con le cellule T CAR terapeutiche.L'implicazione di questa tecnica come 10 alla terapia sulla diagnosi di tumore solido perché le lezioni apprese in questo modello possono essere tradotte direttamente a casa di caramelle con altri obiettivi come il CEA. Per iniziare questa procedura. In primo luogo, preparare tutti i supporti e le celle necessari come delineato nel protocollo di testo. Il primo giorno a piatti di coltura completi da DMEM a 15 centimetri quadrati. Semina 7,5 milioni di cellule E di platino in questi piatti e incubare durante la notte a 37
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la produzione di cellule T CAR anti-CD19 murine mediante trasduzione retrovirale. Viene esplorata la loro applicazione come terapia contro un linfoma B-cellulare A20 siringeneico stabilizzato in topi BALB/c, con o senza condizionamento linfodepletivo preliminare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunoterapia
- OnCOlogia
- Biologia cellulare
Sfondo
- La terapia con cellule T CAR è un approccio promettente nel trattamento del cancro.
- Comprendere l'interazione tra le cellule T CAR e le cellule immunitarie endogene è fondamentale.
- Lo studio si concentra sul confronto tra condizioni linfocitari complete e condizioni deplete di linfociti.
- Le conoscenze acquisite potrebbero essere applicabili ai tumori solidi e ad altri bersagli terapeutici.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per la generazione di cellule T CAR anti-CD19.
- Valutare l'efficacia di queste cellule nel trattamento del linfoma.
- Studiare il ruolo dell'ambiente immunitario negli esiti della terapia.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di mezzi di coltura e cellule secondo il protocollo descritto.
- Seeding di cellule E-Platino in piatti di coltura.
- Incubazione delle cellule in condizioni controllate.
- Valutazione della funzionalità delle cellule T CAR in diversi contesti immunitari.
Risultati principali
- Produzione con successo di cellule T con recettore chimerico anti-CD19 murino.
- Differenze dimostrate nell'efficacia terapeutica in base al condizionamento immunitario.
- Informazioni sul ruolo delle cellule immunitarie endogene nella risposta alla terapia.
- Possibili implicazioni per applicazioni più ampie in oncologia.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce uno strumento prezioso per la ricerca sui linfociti T con recettore chimerico (CAR T-cell).
- I risultati contribuiscono alla comprensione delle interazioni dei linfociti T con recettore chimerico in vivo.
- Studi futuri potranno approfondire questi risultati per migliorare le terapie contro il cancro.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Questo protocollo consente la valutazione preclinica di cellule T con recettore chimerico anti-CD19 (CAR T) in un modello murino siringeneico di linfoma, supportando la validazione dell'obiettivo terapeutico e la riduzione dei rischi meccanicistici nei percorsi di immuno-oncologia. Confrontando condizioni di linforeintegrazione e linfodeplezione, il protocollo fornisce indicazioni predittive sull'efficacia delle cellule CAR T e sulle loro interazioni con il microambiente immunitario. Il modello sostiene decisioni di scoperta precoce riguardo a costrutti di cellule CAR T e terapie combinate, prima degli studi abilitanti all'IND.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di costrutti di cellule CAR T su linfoma B consolidato per convalidare l'interazione con il target e la specificità per l'antigene.
- Valore operativo: Fornisce un sistema riproducibile per valutare la funzionalità delle cellule CAR T ex vivo mediante citometria a flusso, luminometria ed ELISA.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera cellule T CAR murine validate per lo screening successivo di modifiche genetiche e potenziamento con citochine (ad esempio, IL-12).
- Valore operativo: Standardizza le procedure di produzione retrovirale e di trasduzione mediante l'uso di cellule Plat-E, costrutti MP71 e centrifugazione assistita da fibronectina.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Verifica l'attività delle cellule CAR T in vivo mediante imaging bioluminescente e monitoraggio della progressione della malattia in modelli sistemici di linfoma.
- Valore operativo: Consente il confronto tra condizioni di linforeplezione e linfodeplezione per ridurre i rischi associati ai meccanismi terapeutici e orientare strategie combinate.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel continuum dalla scoperta alla fase preclinica, supportando l'identificazione di candidati promettenti tra le progettazioni delle cellule T CAR e contribuendo alla validazione preclinica attraverso la modellizzazione del contesto immunitario.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi delle cellule T CAR e sulle interazioni con le cellule immunitarie endogene nel linfoma.
- Screening: Fornisce prodotti cellulari T CAR standardizzati e quantificabili per condizioni di saggio riproducibili.
- Analisi: Utilizza bioluminescenza, citometria a flusso ed ELISA per generare letture comparative tra gruppi sperimentali.
- Ricerca Translazionale: Modella la rilevanza della malattia in ospiti sinnigeni per collegare la scoperta valutativa dell'efficacia preclinica.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la valutazione di varianti delle cellule T CAR, combinazioni di citochine e terapie adiuvanti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo e comprensione meccanicistica della dinamica tra cellule T CAR e microambiente immunitario.
- Valore operativo: Produzione riproducibile di cellule T CAR e validazione funzionale attraverso letture ex vivo e in vivo.
- Valore strategico: Guida le decisioni di proseguimento o interruzione rivelando l'efficacia dipendente dalla linfo-deplezione e il potenziale di terapie combinate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione corretta per rischio dei candidati di cellule T CAR in base alla risposta al contesto immunitario.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze nella produzione di vettori retrovirali, nella coltura cellulare e nei saggi immunologici.
- Accesso a cellule Platinum-E, frammenti ricombinanti di fibronectina e infrastrutture di livello di sicurezza biologica 2.
- Standardizzazione dell'efficienza di trasduzione e validazione dell'espressione del CAR tra diversi lotti.
- Considerazioni sull'adattamento per diversi costrutti di CAR, antigeni bersaglio e modelli di linfoma murino.
- I limiti pratici includono l'espressione dell'antigene specifica del modello e le differenze tra il sistema immunitario murino e la fisiologia umana.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
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Title
0:55
Days 1 & 2: Preparation and Transfection of Plat-E Retroviral Packaging Cell Line
2:11
Day 3: Preparation of Virus-Containing Supernatant for Transduction and Isolation and In Vitro Activation of Mouse Splenic T Cells
4:27
Day 4: Transduction of Mouse T Cells
6:43
Day 5: Round 2 of Transduction
8:33
In Vitro Validation of CAR T Cell Activity
9:53
Results: Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells
11:32
Conclusion
