Visualizzazione e monitoraggio di mRNA endogeni nelle camere uovo di Drosophila melanogaster dal vivo

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dell'RNA sul meccanismo e la funzione della localizzazione dell'RNA polarizzato. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la visualizzazione in tempo reale del traffico endogeno di RNA nei tessuti vivi. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia delle malattie correlate all'RNA perché ha il potenziale per scoprire nuovi obiettivi terapeutici.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui processi di RNA nella camera delle uova di mosca della frutta, può anche essere applicato ad altri sistemi come il pesce zebra o le cellule di coltura. In generale, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa delle sfide associate alla progettazione e consegna degli oggetti di scena faro molecolare. Per la microiniezione a faro molecolare, selezionare l'obiettivo dell'olio 40X e montare una coverlip con la camera dell'uovo sezionata sullo stadio del microscopio.

Individuare una camera d'uovo nella fase di sviluppo medio-tardiva che sia correttamente orientata per la microiniezione. Quindi impostare un microiniettore con le pressioni di iniezione e compensazione appropriate. Utilizzando il joystick del micro manipolatore, abbassare delicatamente un ago caricato con un microlitro di soluzione di faro molecolare nella goccia d'olio.

Mettere a fuoco la punta verso la periferia del campo visivo. Eseguire una funzione pulita per rimuovere l'aria dalla punta dell'ago e per assicurarsi che ci sia flusso dall'ago e portare l'ago nella posizione di casa. Concentrati sulla camera delle uova da microiniettare e riporta l'ago a fuoco vicino al bordo della camera delle uova.

Eseguire una regolazione fine della posizione z dell'obiettivo in modo che la membrana che separa le cellule follicolari dalle cellule dell'infermiere sia a fuoco. Inserire l'ago in una cella di infermiere per l'iniezione dei fari molecolari per un periodo di due o cinque secondi. Per garantire il successo della microiniezione riproducibile, concentrarsi attentamente sulla membrana che separa le cellule follicolari e le cellule infermiere che verranno iniettate mentre si porta a fuoco la punta dell'ago con il micro manipolatore.

Quando tutti i fari molecolari sono stati iniettati, rimuovere delicatamente l'ago e ritrarlo nella posizione di casa. Modificare l'obiettivo con l'ingrandimento desiderato per l'acquisizione dell'immagine. Quindi concentrati sulla camera delle uova sotto il nuovo obiettivo e inizia l'acquisizione dell'immagine.

Per il rilevamento spot dei fari molecolari, aprire le immagini in Image J.Utilizzare lo strumento converti in ICY per convertire le immagini in ICY. Una barra di scala verrà automaticamente sovrapposta allo stack. Modificare la barra di scala tramite la finestra di ispezione in base alle esigenze.

Quindi disattivare l'icona dell'occhio per la barra di scala sotto la linguetta del livello per rimuovere la barra di ridimensionamento dalla pila originale. Selezionare il rilevamento e il rilevamento, il rilevamento e il rilevatore di punti e confermare il rilevamento dell'input della sequenza corrente e lo zero del canale sono selezionati rispettivamente per i parametri di input e pre-elaborazione. Per il rilevatore, selezionare rileva punto luminoso su sfondo scuro utilizzando l'uso della forza delle lunghezze d'onda 2D per il 3D solo se non ci sono abbastanza z-slice nelle pile per eseguire l'analisi.

Selezionare le scale e la sensibilità per ogni scala aggiungendo più scale per punti più grandi e verificare che l'area di interesse dalla sequenza sia impostata per l'area di interesse. Per il filtro, verificare che non sia stato impostato alcun filtro e selezionare il formato di file appropriato in output. Se i risultati del rilevatore spot devono essere utilizzati per l'analisi di tracciamento, selezionare esporta in piscina.

Per l'analisi della colocalizzazione, ripetere il rilevamento spot per l'altro canale. Per tenere traccia delle macchie del faro molecolare, selezionare il rilevamento e il tracciamento, il tracciamento, il tracciamento spot ed eseguire il rilevatore di punti utilizzando gli stessi parametri del rilevamento dei punti. Fate clic su stima parametri (Estimate parameters) e selezionate il movimento di destinazione desiderato nella finestra popup di stima dei parametri.

Quindi fare clic su Esegui rilevamento. Per visualizzare le tracce, selezionare rilevamento e tracciamento, tracciamento e gestione tracce. Per il processore di traccia a colori, selezionare Abilita e selezionare un colore per le tracce.

In Aggiungi processore di traccia selezionare traccia del clip di tempo del processore. Nella finestra del clipper di controllo immettere il numero di rilevamenti da mostrarsi prima e dopo il punto di tempo corrente. Salvare le informazioni sulla traccia come file di traccia XML e utilizzare l'icona della fotocamera per ottenere uno screenshot dei risultati.

Per proiettare lo stack lungo la direzione z, usate la barra di ricerca per trovare il plug-in e selezionate la proiezione massima dal menu a discesa. Nella finestra della finestra di ispezione selezionare la scheda sequenza, l'area di disegno e la rotazione per regolare l'immagine in base all'orientamento desiderato e ottenere uno screenshot dell'immagine ruotata. Quindi selezionare l'area di interesse, l'area di interesse 2D, scegliere la forma area di interesse e selezionare l'area di interesse nell'immagine per il ritaglio.

Installare il plug-in di sovrapposizione timestamp e aggiungere un timestamp seguendo le istruzioni nella finestra popup per istruzioni su come posizionare e formattare il timestamp. Per modificare o aggiungere l'intervallo di tempo, fare clic su Modifica nella finestra delle proprietà della sequenza. Attivare l'icona dell'occhio per aggiungere di nuovo la barra di scala sotto la linguetta del livello nella finestra dell'ispettore.

Quindi ottenere uno screenshot dei risultati timestamp e salvare l'immagine sia in formati TIFF che AVI. Utilizzando questo metodo come dimostrato, è possibile visualizzare i modelli di trasporto e localizzazione degli mRNA endogeni attraverso fari molecolari in varie fasi dell'oogenesi e in particolare a e dopo l'oogenesi media. Quando vengono iniettati individualmente nelle stesse camere di uova dello stadio, diversi fari molecolari specifici di Oskar presentano lo stesso modello di localizzazione.

I fari molecolari iniettati nel citoplasma di una cellula infermiera si diffonderanno liberamente nelle cellule infermiere adiacenti e nell'ovociti. Così, i fari sono in grado di ibridarsi con i loro bersagli e generare segnali di fluorescenza in altri siti rispetto al sito di microiniezione. Nelle camere di uova transgeniche oskar GFP a metà oogenesi, l'analisi dei dati di acquisizione mostra un'ampia colocalizzazione per il segnale di fluorescenza dell'oskar mRNA taggato GFP geneticamente modificato con il segnale di fluorescenza rilevato utilizzando fari molecolari.

Inoltre, le pile 5D possono essere ulteriormente analizzate per determinare le traiettorie dell'mRNA oskar per il trasporto a lunga distanza sia nella cellula infermiera che nel citoplasma degli ovocite. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia dell'RNA per esplorare il trasporto e la localizzazione dell'mRNA materno endogeno nella camera delle uova di Drosophila.