Name: Un protocollo personalizzabile per String Assembly gRNA clonazione (STAgR) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Impara il metodo STAgR per la clonazione di gRNA multiplex in applicazioni CRISPR/Cas9. Questo protocollo personalizzabile utilizza l'assemblaggio di Gibson per generare vettori di espressione gRNA in modo rapido ed economico.

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Gli autori piacerebbe ringraziare Dr. Stephan Beck e Dr. Jovica Ninkovic per il loro contributo, guida e supporto nello sviluppo del metodo STAgR. Tobias Klötzer, Anna Köferle e Valentin Baumann per utili commenti. L'opera è stata sostenuta da DFG (STR 1385/1-1).

1. design di STAgR clonazione strategia
<ol><li>Decidere su quanti gRNA cassette sarà inclusi nel vettore di espressione e in quale ordine. Determinare quali promotori e gRNA ponteggi devono essere utilizzati per tutte le gRNAs. Progettare il gRNAs utilizzando qualsiasi strumento online (ad esempio, www.benchling.com).</li>
</ol>2. design di STAgR clonazione primer con sporgenze
Nota: La sequenza di protospacer senso dell'ultimo gRNA e antisenso del primo gRNA rispettivamente vengono aggiunti per gli iniettori PCR usati per l'amplificazione del backbone vettoriale (Figura 1). Le sequenze rimanenti sono amplificate dalle stringhe, quindi associare il senso e antisenso gRNAs nell'ordine desiderato. La prima stringa pezzo è amplificato con un primer forward contenente il primo gRNA N20 sequenza come una sporgenza e un primer inverso con la seconda gRNA N20 sequenza (complemento inverso) come una sporgenza. Tutti i pezzi seguenti vengono generati di conseguenza.
<ol><li>Aggiungere N20 gRNA sequenze i primer di amplificazione in avanti per stringa STAgR DNA come sporgenze (tabella 1). Aggiungere senso gRNA sequenze 5' al primer forward "scf-FP" (per un ponteggio convenzionale) o "sam-FP" (per un ponteggio contenente MS2). Primer FP tempri la parte di ponteggio/MS2 della relativa stringa STAgR (Figura 1).</li>
	<li>Aggiungere il complemento inverso N20 gRNA sequenza le sequenze dell'iniettore inversa. Scegliere primer RP a seconda dei promotori specifici e stringhe utilizzate (hU6-RP, mU6-RP, 7sK-RP, H1-RP).</li>
</ol>3. generazione di STAgR clonazione di frammenti
<ol><li>Per generare i singoli frammenti clonazione per assemblaggio di Gibson, eseguire PCRs impostando 10 µ l di tampone di alta fedeltà (HF), 1 µ l di 10 mM dNTPs, 0,25 µ l di sporgenza-primer (100 µM), 10 ng della polimerasi del DNA modello (stringa o vettoriale), 0,5 µ l HF , 1,5 µ l di solfossido dimetilico (DMSO) e aggiungere H2O per rendere un volume finale di 50 µ l. Nota: Utilizzare il plasmide "STAgR_Neo" come un modello per la spina dorsale PCR per incorporare gRNA patibolo per l'ultimo gRNA, se SAM Scaffold viene scelto, utilizzare "STAgR_SAM". Per un plasmide STAgR con sei gRNA cassette per esempio, sei PCRs sono necessarie, che cinque con DNA stringhe come modelli e uno con la spina dorsale di vettore come il modello.</li>
	<li>Incubare le reazioni in un termociclatore usando le seguenti condizioni: 1 ciclo di 98 ° C per 1 min 30 s; 38 cicli di 98 ° C per 10 s, 59 ° C (per ponteggio gRNA) / 68 ° C (per ciclo di SAM) per 10 s, 72 ° C per 30 s (per inserti) / 1 min 30 s (per vettori); 1 ciclo di 72 ° C per 10 min.</li>
	<li>Rimuovere 5,5 µ l dalla reazione di PCR, Aggiungi tintura di caricamento e analizzare i frammenti amplificati su gel di agarosio 1%. Carico una scaletta di DNA appropriata per dimensionamento (100 bp DNA ladder/1 kb DNA ladder) ed eseguire il gel in un funzionamento appropriato gel buffer (ad es., TLE buffer) a 120 V per 30 min.</li>
	<li>Mentre il gel è in esecuzione, aggiungere 5 µ l di buffer fornito con l'enzima di restrizione e 0,5 µ l DpnI (10 unità) per la reazione di PCR µ 44,5 l rimanente e incubare per 30 min a 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Eseguire la purificazione del DNA usando i branelli magnetici.<ol>
<li>Aggiungere 1,8 perline magnetico µ l per 1 µ l di prodotto PCR e Miscelare pipettando su e giù. Incubare per 2 min a temperatura ambiente (TA).</li>
		<li>Perline e frammenti di DNA separate dal liquido residuo con un magnete. Lavare perle due volte con etanolo al 70% di risciacquo il pellet senza risospendere completamente.</li>
		<li>Rimuovere tutti i etanolo con una pipetta e lasciare asciugare il pellet aria.</li>
		<li>Dissolva la pallina in 15-20 µ l H2O pipettando su e giù e separare le perle dal liquido utilizzando un magnete. Trasferire il surnatante chiaro ad un nuovo tubo. Nota: In alternativa, kit di pulizia basata su colonne di reazione può essere utilizzato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinare le concentrazioni di DNA usando uno spettrofotometro come descritto altrove29.</li>
</ol>4. Gibson Assembly reazione e trasformazione batterica
Nota: I seguenti passaggi sono adattati da Gibson et al. 30.
<ol><li>Preparare una fatta in casa Gibson reazione mescolare o utilizzare un kit di clonazione commerciale di Gibson.<ol>
<li>Combinare 3 mL di 1 M Tris (Tris (idrossimetil) amminometano)-HCl a pH 7.5, 300 µ l di 1 M MgCl, 60 µ l di 100 millimetri di dGTP (deossiguanosina trifosfato), 60 µ l di 100 millimetri di dATP (deossiadenosina trifosfato), 60 µ l di 100 millimetri di dTTP (deossitimidina trifosfato) e 60 µ l di 100 mM dCTP ( deossicitidina trifosfato), 300 µ l di 1 M DTT (dithiothreitol), 1,5 g di PEG-8000 (polietilene glicole), 300 µ l di 100 mM NAD (nicotinamide adenina dinucleotide) e aggiungere H2O per ottenere 6 mL di buffer di reazione isotermica × 5. Nota: Aliquotati tampone può essere conservato a-20 ° C per almeno 12 mesi.</li>
		<li>Per il master di montaggio Gibson mescolare, unire 320 µ l di tampone di reazione isotermica x 5 con 697 µ l di H2O e aggiungere 3 µ l di 10 esonucleasi T5 U / µ l, 20 µ l di 2 U / µ l DNA polimerasi e 160 µ l di 40 U / µ l Taq DNA ligasi. Nota: Questo mix può essere aliquotati e conservati a-20 ° C per almeno 12 mesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare 7,5 µ l di mix master Assemblea con 2,5 µ l di insert e vettoriale. Per una reazione di x STAgR 2 utilizzare un vettore molare per inserire il rapporto di 1:1 ma non più di 0,2 pmol di DNA in totale. Per più di 2 cassette di espressione gRNA, utilizzare un vettore per inserire il rapporto di 1:3, ma non superare una quantità di DNA totale di 0,5 pmol. Nota: Tutte le cassette di espressione amplificata gRNA devono essere utilizzate in quantità equimolari. Includere un controllo di plasmide con l'identica quantità di vettore ma senza inserti di controllo per non digerito template vettoriale (e/o auto-legatura).</li>
	<li>Incubare i campioni a 50 ° C per 45-60 min. esempi di Store su ghiaccio o a-20 ° C per la successiva trasformazione. Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
	<li>Direttamente trasformare metà del mix in batteri chimicamente competenti.<ol>
<li>Scongelare chimicamente competenti TOP10 Escherichia coli batteri sul ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere 5 µ l della miscela Gibson per 50 µ l di batteri competenti. Mescolare delicatamente, spostando il fondo della provetta. Incubare in ghiaccio per 30 min.</li>
		<li>Eseguire una scossa di calore inserendo il tubo in bagnomaria a 42 ° C o un blocco di calore per 45 s.</li>
		<li>Rimontare i tubi sul ghiaccio. Aggiungere 250 µ l di terreno SOC per i batteri e far loro recuperare a 37 ° C in un incubatore d'agitazione per 30 – 45 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo il recupero, piastra i batteri trasformati su piastre di agar brodo (LB) di 1,5% Lisogenesi contenente ampicillina (100 µ g / mL) e incubare per una notte a 37 ° C.</li>
</ol>5. selezione dei cloni STAgR di PCR della colonia batterica
<ol><li>Preparare almeno due insiemi di 200 provette di reazione di PCR di µ l (tra 3 e 24) per ogni costrutto, che sono etichettati in modo identico.</li>
	<li>Riempire un set con 100 µ l LB contenente 100 µ g / ampicillina mL.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta sterile per grattare il materiale biologico di una colonia batterica e si è diffuso nella parte inferiore del tubo di reazione di PCR 100 µ l vuoto. Trasferire immediatamente la punta per il secondo tubo di reazione corrispondente contenente il mezzo LB.</li>
	<li>Agitare delicatamente la punta intorno affinché alcuni dei batteri vengono trasferiti ai media LB e incubare a 37 ° C per un uso successivo.</li>
	<li>Impostare un mix master di PCR (10 µ l per reazione).<ol>
<li>Per 10 reazioni, unire 10 µ l di tampone di Taq , 2 µ l 10 mM dNTPs, 0,5 µ l di primer (100 µM), 0,5 µ l di Taq polimerasi e aggiungere un volume di 100 µ l di H2O.</li>
		<li>Utilizzare i seguenti primer: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di master mix PCR di provette di reazione PCR senza il supporto LB.</li>
	<li>Incubare le reazioni in un termociclatore usando le seguenti condizioni: 1 ciclo di 94 ° C per 5 min, 38 cicli di 94 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 s, 72 ° C per 2 min; 1 ciclo di 72 ° C per 10 min. Nota: Tempo di allungamento (passo di 72 ° C) dovrebbe essere aumentato con il numero di cassette espressione gRNA. Calcolare la dimensione teorica di inserti utilizzando la tabella 2 e utilizzare 1 min a 1 kb a 72 ° C.</li>
	<li>Aggiungere il colorante di caricamento e analizzare i frammenti amplificati su gel di agarosio all'1%. Caricare una scaletta di DNA appropriata per dimensionamento (1kb DNA Ladder) ed eseguire il gel appropriato in tampone (ad es., TLE Buffer) di corsa a 120 V per 30 min.</li>
	<li>Calcolare la dimensione teorica del amplicon con l'aiuto della tabella 2 sommando le dimensioni individuali dei promotori usati, gRNA scaffolds e numero delle sequenze di N20. Dai risultati della Colonia PCR, identificare i cloni batterici basati sulla taglia corretta e se sono propensi a vettori corrette del porto.</li>
	<li>Inoculare una cultura LB pernottamento 2,5 mL (con 100 ampicillina µ g/mL) con la corrispondente cultura 100 µ l, impostata in precedenza. Incubare a 37 ° C per 12 ore.</li>
	<li>Estrarre il DNA plasmidico utilizzando un kit mini commerciale plasmide e istruzioni31 del produttore.</li>
	<li>Sequenza i plasmidi utilizzando i seguenti primer: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) e StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) mediante sequenziamento Sanger.</li>
</ol>

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<li>Xie, K., Minkenberg, B., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+CRISPR%2FCas9+multiplex+editing+capability+with+the+endogenous+tRNA-processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (11), 3570-3575 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per STAgR consentendo la generazione veloce e semplice di gRNA plasmidi di espressione di varie dimensioni. Questo protocollo può essere utilizzato per la generazione di uno stadio di gRNA plasmidi con cassette di espressione di gRNA di 2 – 8 (con o senza due RNA MS2 aptameri) verso il vettore di espressione gRNA STAgR_Neo e l'utilizzo di umano U6, mouse U6, 7sK umano e umano H1 promotori28 ,32,33. Se più di quattro cassette sono desiderati, si consiglia di utilizzare almeno due tipi di diverso promotore/impalcatura per aumentare l'efficienza. Altri vettori, promotori e combinazioni di promotore, nonché più di 8 gRNA cassette potrebbero essere fattibile pure; Tuttavia, questo non è stato testato. Sebbene nella nostra esperienza che il metodo funziona in modo affidabile e riproducibile, abbiamo determinato passaggi critici e strategie di risoluzione dei problemi deve il risultato atteso non immediatamente verificarsi. Nella nostra esperienza alcuni passaggi sono di fondamentale importanza per il successo dell'approccio: innanzitutto, è importante utilizzare il corretti rapporti molari di inserti per la spina dorsale del vettore presso il punto di montaggio di Gibson (3:1). Tuttavia, abbiamo notato che per alcuni set di gRNA un rapporto di 1:1 di inserti a vector è vantaggioso, anche quando il numero di cassette gRNA superare due. In secondo luogo, il periodo della reazione Assemblea Gibson dovrebbe essere sufficientemente lungo (almeno 45 min consigliato).
STAgR può essere impiegato con un gran numero di modifiche. Targeting per sequenze, gRNA numeri e impalcature, promotori e dorsali di vettore possono essere personalizzati e combinati liberamente. Tuttavia, ogni combinazione può avere esigenze leggermente diverse. Nella nostra esperienza, se medio o alto numeri di gRNA cassette (> 4) sono desiderato ma non ottenuti immediatamente, solitamente il modo più veloce per superare questo problema è quello di modificare l'ordine delle cassette gRNA individuali nel vettore. Allo stesso modo, combinando diversi gRNA promotori e scaffold migliora l'efficienza (e quindi abbassa il numero richiesto di PCRs Colonia che devono essere segnati) quando molti gRNA cassette vengono clonati. Abbiamo trovato che non corretti cloni sono solitamente generati dalla congiunzione spontanea di sequenze ripetute durante l'assemblaggio di Gibson. Anche se questo può ridurre l'efficienza del metodo, causando anche la generazione simultanea di vettori con funzionale gRNA sottoinsiemi28.
Generazione di multiplexing gRNA vettori contenenti più di una cassetta di espressione gRNA è stato segnalato con un numero di metodi differenti21,22,23,24,25, 26,27. Mentre alcuni impiegano simultanea o sequenziale clonazione di gRNA coppie22,34, altri dipendono da Golden Gate Assemblea e clonazione sequenziale diversi passaggi25,35. Un approccio speciale è stato utilizzato da Xie et al., impiegando il sistema di elaborazione tRNA cellulare endogeno per tagliare diversi gRNAs fuori un singolo progenitore trascrizione36. Il advangetage di questo metodo è il requisito di un solo promotore; lo svantaggio è la necessità di frammenti di DNA di nuova sintesi per ogni combinazione di gRNA. Ogni gRNA multiplexing metodo ha vantaggi e svantaggi; STAgR combina semplicità con efficienza, elevato numero di possibili gRNA cassette con basso costo.
STAgR (e altri sistemi di multiplexing) sarà probabilmente strumentale nel rendere possibile l'interruzione efficiente (e simultanea) di più geni in vivo, come sperimentato in zebrafish cervelli28. Un'altra applicazione futura di gRNA multiplexing vettori è la promessa per la manipolazione di programmi completi trascrizionale in contrasto con l'induzione o repressione di singoli geni. Probabilmente, questi approcci verranno permetterà di trasformare cellule e organi a saranno molto più elevato di quanto oggi è possibile.

Stringa Assemblea gRNA clonazione (STAgR) è un metodo consentendo notturna efficiente generazione di vettori di espressione contenenti più espressione di gRNA cassette nella clonazione di un singolo passo. Il protocollo di STAgR non dipende dalla competenza specialistica o materiali e offre molteplici opzioni per la personalizzazione.
La proteina batterica CRISPR Cas9 ha una capacità unica. È in grado di trovare e legare selettivamente solo quelle sequenze di DNA codificati in crRNAs naturale o derivati dal gRNAs1. Suo utilizzo come strumento molecolare ha permesso un gran numero di approcci che erano impossibili, irrealizzabile o solo limitato a determinati modelli cellulari fino a poco tempo. Questi includono le mutazioni di gene bersaglio2, genoma ingegneria3, epigenome modifica4,5,6, attivazione trascrizionale e il silenziamento genico7,8. Per quanto sappiamo che CRISPR è universalmente dispiegabili, come rapporti della sua applicazione esiste per una vasta gamma di siti di destinazione, specie e tipi di cellule. Tuttavia, molte applicazioni CRISPR dipendono direttamente o indirettamente sulla consegna di gRNAs multiple, tra cui una serie di manipolazioni genomiche (traslocazioni9,10, media11 e alterazioni genomiche su larga scala 12 , 13), ingegneria del genoma (uso di Cas9 nickases14), generazione di alleli condizionali11,15 o mutazioni seriale16e tracciare strategie17. Inoltre, per altri approcci (trascrizionale ingegneria18epigenome ingegneria19,20) sono più siti di destinazione non strettamente obbligatoria, tuttavia raggiungono la loro massimo effetto spesso soltanto sotto questo condizione.
Sono stati descritti diversi metodi utili per generare dei vettori-gRNA contenente più di una gRNA espressione cassetta21,22,23,24,25,26, 27. Qui, presentiamo un protocollo per STAgR, stringa Assemblea gRNA clonazione, che è eccezionale nella sua combinazione di semplicità e velocità (solo un pernottamento clonazione passaggio è necessario), basso costo (come modelli del DNA possono essere riutilizzate più volte), possibilità di personalizzazione (per gRNA diversi sistemi e promotori) e l'efficacia (permette la generazione di vettori contenenti un numero elevato di cassette gRNA)28.
In linea di principio STAgR può essere utilizzato per generare dei vettori di espressione con pochi (1-2 gRNAs), diversi (3 – 5 gRNAs) e alcuni del più alto numero di cassette di espressione finora riportati (6 – 8 gRNAs)28. Allo stesso modo, STAgR è applicabile per qualsiasi sequenza di gRNA, spina dorsale o promotore. Poiché tuttavia, STAgR è principalmente basato su reazioni a catena della polimerasi (PCR) e l'assemblaggio di Gibson, gRNAs con le somiglianze alta sequenza deve essere generato utilizzando un metodo alternativo.

<table><tbody><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polimerasi</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td>Polimerasi per Gibson Master Mix e tutte le PCR,</td></tr><tr><td>dNTP,</td><td>Life Technology</td>, <td>R0191</td><td>dNTP per tutte le PCR,</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Life Technology</td>, <td>R0141</td><td>dNTP per Gibson Master Mix</td></tr>, <tr><td>dCTP</td><td>Life Technology</td><td>, R0151</td><td>dNTP per Gibson Master Mix</td></tr>, <tr><td>dGTP</td><td>Life Technology</td><td>R0161</td><td>dNTP per Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>dTTP</td><td>Life Technology</td><td>R0171</td><td>dNTP per Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Agarose VWR</td><td></td><td>443666A</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>per la pulizia del DNA</td></tr><tr><td>Tris HCL</td><td>Roth</td><td>9090.2</td><td>per Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Life Technology</td><td>R0861</td><td>per Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>VWR</td><td>RC-077</td><td>per Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Cayman Chemicals Company</td><td>16077</td><td>per Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>T5 Esonucleasi</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>per Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Taq DNA Ligasi</td><td>NEB</td><td>M0208S</td><td>per Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>SigmaAldrich</td><td>PHR1393-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder 1 kb Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit plasmidico</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Sequenze</td><td></td><td></td> plasmiche e primer <td>Tutte le sequenze disponibili su Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q).</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReacAppliChem</td><td>6381-92-6</td><td>per TLE Tampone</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>M8266</td><td>per Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Top10 batteri chimicamente competenti</td><td>Thermo Scientific</td><td>C404003</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>SigmaAldrich</td><td>Y1625</td><td>per brodo lisogenico (LB Media)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>S7653</td><td>per brodo lisogenico (LB Media)</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>SigmaAldrich</td><td>91249</td><td>per brodo lisogenico (LB Media)</td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>SigmaAldrich</td><td>5040</td><td>per brodo lisogenico (LB Media)</td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasi</td><td>Quiagen</td><td>201203</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocollo personalizzabile per string assembly grna clonazione (stagr)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

Il sistema CRISPR/Cas9 batterico è aumentato sostanzialmente opzioni metodologiche per gli scienziati di vita. Dovuta al suo utilizzo, ingegneria genetica e genomica è divenuto applicabile a una vasta gamma di sistemi. Inoltre, molti trascrizionale ed epigenomic ingegneria approcci sono generalmente fattibili ora per la prima volta. Uno dei motivi per l'ampia applicabilità di CRISPR sta nella sua natura bipartito. Piccolo gRNAs determinare il target genomici del complesso, varianti della proteina Cas9 e le conseguenze molecolari locali. Tuttavia, molti approcci CRISPR dipendono la consegna simultanea di più gRNAs nelle singole celle. Qui, presentiamo un protocollo personalizzabile per stringa Assemblea gRNA clonazione (STAgR), un metodo che consente la generazione semplice, veloce ed efficiente di multiplex gRNA vettori di espressione in una clonazione singolo passo. STAgR è conveniente, dal momento che (in questo protocollo) le singole sequenze di targeting sono introdotti da primer sbalzo corto, mentre i modelli di DNA lunghi delle cassette gRNA espressione possono essere riutilizzati più volte. Inoltre, STAgR permette singolo passo incorporazione di un gran numero di gRNAs, così come combinazioni di gRNA diverse varianti, vettori e promotori.

Seguendo il protocollo a portata di mano rende la generazione di personalizzato multiplexing gRNA vettori fattibile (Figura 1). Risultati rappresentativi degli approcci STAgR utilizzano sei gRNA diverse cassette sono rappresentati in Figura 2. Figura 2 A Mostra un tipico risultato di PCRs utilizzato per ottenere i pezzi di STAgR (protocollo 3.1-3.3). Gli sei ampliconi (BB, S1-S5) rappresentano pezzi di DNA lineari contenenti le sequenze individuali gRNA N20 sulla loro estremità. La spina dorsale del plasmide (BB) è ora estesa con le sequenze di targeting di gRNA1 e gRNA6 e quindi possiede il necessario si sovrappone a due altri PCRs (S1 e S5) per l'assemblaggio di Gibson (Figura 2A, tabella 3). Dopo la purificazione può essere ottenuto un rendimento del DNA di almeno 1 µ g per vettori e inserti.
Dopo l'assemblaggio di Gibson, trasformazione batterica dovrebbe risultare in colonie batteriche 100-700. Figura 2 B Mostra una rappresentativa analisi di 10 colonie batteriche tramite PCR, seguendo un protocollo STAgR con sei gRNA cassette della Colonia. Elettroforesi del gel indica che tre cloni mostrano la dimensione amplicone previsto per il montaggio completo (tabella 2). Altri cloni probabilmente ricevuto STAgR vettori contenenti un massimo di cinque cassette gRNA, considerando che un clone (Figura 2B, n ° 18) è vuoto.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig1.jpg"> Figura 1 : Panoramica di disegno dell'iniettore di STAgR. Prima gRNA numero e ponteggi sono scelti, poi gRNA ordine e promotore e ultimo, deve essere utilizzato quale tipo di vettore. Per ogni gRNA, un primer specifico in avanti con il gRNA targeting sequenza in orientamento di senso e la parte comune delle "scf-FP" o "sam-FP" è stato progettato. Allo stesso modo, per generare il primer reverse individuo la corrispondente sequenza del promotore (RP) si fonde con il complemento inverso della sequenza della prossima gRNA N20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig2.jpg"> Figura 2 : Risultati rappresentativi degli approcci STAgR utilizzano sei gRNA diverse cassette. (A) esempio rappresentativo di una PCR di cinque inserti come pure il vettore STAgR_Tomato. (B) Colony PCR di un 6 x STAgR reazione usando promotori hU6 e mU6 e canonico gRNA così come SAM impalcature. 22 colonie batteriche sono state analizzate, di cui 7 ha mostrato la band prevista che indica il gruppo completo. Scaletta: 1KB plus, numeri in coppie di basi (bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Forward primer per String e vettoriale</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>scaffold_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reverse primer per String e vettoriale</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hU6_rev</td>
			<td>CGGTGTTTCGTCCTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>mU6_rev</td>
			<td>CAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>hH1_rev</td>
			<td>CTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>h7SK_rev</td>
			<td>CCGAGGTACCCAAGCGG</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Sequenze Primer per gRNA scaffolds e promotori.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Dimensioni dei promotori e impalcature.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hU6</td>
			<td>265 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>hH1</td>
			<td>225 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>mU6</td>
			<td>316 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>h7SK</td>
			<td>245 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA impalcatura</td>
			<td>83 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAMloop + gRNA impalcatura</td>
			<td>143 bp</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Dimensioni teoriche di ogni cassetta di espressione per calcolare il risultato PCR di Colonia.
<table><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Scf</td>
			<td>400 bp</td>
			<td>360 bp</td>
			<td>451 bp</td>
			<td>380 bp</td>
			<td>bp di 3722</td>
			<td>4487 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM</td>
			<td>460 bp</td>
			<td>420 bp</td>
			<td>511 bp</td>
			<td>440 bp</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: Misure di promotori e scaffold.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Scf</td>
			<td>368 bp</td>
			<td>328 bp</td>
			<td>419 bp</td>
			<td>348 bp</td>
			<td>+ 74 bp</td>
			<td>+ 67 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM</td>
			<td>428 bp</td>
			<td>388 bp</td>
			<td>479 bp</td>
			<td>408 bp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 4: Dimensioni calcolate di STAgR pezzi dopo PCR.

Qui, presentiamo la stringa Assemblea gRNA clonazione (STAgR), un metodo per multiplex facilmente gRNA vettori per CRISPR/Cas9 si avvicina. STAgR rende gRNA multiplexing semplice, efficiente e personalizzabile.

Un protocollo personalizzabile per String Assembly gRNA clonazione (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Il sistema batterico CRISPR-Cas9 ha notevolmente aumentato le opzioni sperimentali per gli scienziati della vita. Tuttavia, diversi approcci CRISPR dipendono dalla distribuzione simultanea di più RNA guida nelle singole celle. La clonazione del gRNA dell'assembly di stringhe consente la generazione semplice e veloce di vettori di espressione di gRNA multiplex in un unico passaggio di clonazione.Ma STAgR non è solo semplice, ma è anche efficiente, economico e facile da personalizzare. Per iniziare, aggiungere le sequenze di gRNA N20 ai primer di amplificazione in avanti per la stringa di DNA STAgR come sporgenze. Aggiungere le sequenze di gRNA di senso cinque prime al primer in avanti, primer in avanti Scaffold, per un'impalcatura convenzionale, o al primer in avanti SAM per un'impalcatura contenente MS2.Successivamente, aggiungere le sequenze di gRNA N20 del complemento inverso alle sequenze primer inverse, scegliendo primer RP, a seconda dei promotori e delle stringhe specifiche utilizzate. Per iniziare a generare i singoli frammenti di clonazione per Gibson Assembly, trasferire 10 microlitri del buffer ad alta fedeltà su un tubo. Aggiungere un microlitro di 10 dNTP milimolari e 0,25 microlitri di entrambi i primer a strapiombo micromolare.Aggiungere 10 nanogrammi della stringa del modello di DNA, o vettore, e 1,5 microlitri di DMSO. Aggiungere abbastanza acqua per portare il volume finale a 49,5 microlitri, quindi aggiungere 0,5 microlitri di HF polimerasi. Incubare le reazioni su un termociclo, come delineato nel protocollo di testo.Successivamente, prendere un'aliquota di 5,5 microliter dalla reazione PCR. Aggiungere il colorante di caricamento a tutte le aliquote e caricarlo su un gel di agarosio all'1%. Caricare una scala del DNA appropriata per il dimensionamento ed eseguire il gel in un buffer di funzionamento del gel appropriato a 120 volt per 30 minuti.Mentre il gel è in funzione, aggiungere cinque microlitri del tampone fornito con l'enzima di restrizione e 0,5 microlitri DpnI ai restanti 44,5 microlitri di reazione PCR vettoriale per rimuovere il modello plasmide residuo utilizzato durante la PCR. Incubare a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti. Verificare che le ampliconi siano delle dimensioni corrette.Per iniziare la purificazione del DNA, aggiungere 1,8 microlitri di perline magnetiche per un microlitro di prodotto PCR e mescolare pipettando su e giù. Incubare a temperatura ambiente per due minuti. Usando un magnete, separare le perline nei frammenti di DNA dal liquido residuo.Risciacquare il pellet con etanolo al 70% senza rimescolarlo completamente, per lavare le perline. Ripetere questo lavaggio un'altra volta. Utilizzando una pipetta, rimuovere tutto l'etanolo e lasciare asciugare l'aria del pellet.Quindi aggiungere da 15 a 20 microlitri di acqua e pipettare su e giù per mescolare e sciogliere il pellet. Utilizzare un magnete per separare le perline dal liquido. Trasferire il supernatante trasparente su un nuovo tubo.Successivamente, utilizzare uno spettrofotometro per determinare le concentrazioni di DNA. In primo luogo, preparare il buffer di reazione isotermico 5x come descritto nel protocollo di testo. Per il Gibson Assembly Master Mix, combinare 320 microlitri del tampone di reazione isotermico 5x con 697 microlitri di acqua.Aggiungere 3 microlitri di esonucleasi T5, 20 microlitri di DNA polimerasi e 160 mciroliter di Taq DNA ligasi. Trasferire 7,5 microlitri dell'Assembly Master Mix su un tubo fresco. Quindi aggiungere 2,5 microlitri di inserto nel vettore, come delineato nel protocollo di testo.Incubare i campioni a 50 gradi Celsius per 45-60 minuti. Successivamente, conservare i campioni sul ghiaccio, o a 20 gradi Celsius, per la successiva trasformazione. Quando è pronto a trasformare i batteri, scongelare i batteri TOP10 E.Coli chimicamente competenti sul ghiaccio.Successivamente, aggiungere cinque microlitri del Gibson Mix a 50 microlitri di batteri competenti e mescolare facendo scorrere delicatamente il fondo del tubo. Incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Posizionare il tubo in un bagno d'acqua o in un blocco di calore di 42 gradi Celsius per 45 secondi per sconvolgire termicamente i batteri.Quindi, rimettete i tubi sul ghiaccio. Aggiungere 250 microlitri di mezzo SOC ai batteri e lasciarli recuperare a 37 gradi Celsius in un'incubatrice di scuotimento per 30-45 minuti. Dopo che i batteri si sono ripresi, placcarli su piastre Agar 1,5%LB che contengono 100 microgrammi per ampicillina millilitro.Incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte. Per iniziare, preparare almeno due serie di tubi di reazione PCR da 200 microliter per ogni costrutto. Riempire uno dei set di tubi di reazione con mezzo LB da 100 microlitri, contenente 100 microgrammi per millilitro di ampicillina.Utilizzando una punta di pipetta sterile, graffiare il materiale biologico da una colonia batterica e stenderlo sul fondo di un tubo di reazione PCR vuoto da 200 microliter. Trasferire immediatamente la punta della pipetta al secondo tubo di reazione corrispondente che contiene il mezzo LB. Ruotare la punta in giro per assicurarsi che alcuni dei batteri siano trasferiti sul supporto LB.Incubare a 37 gradi Celsius per un uso successivo. Quindi, preparare 10 microlitri di PCR Master Mix per tubo di reazione, come delineato nel protocollo di testo. Aggiungere 10 microlitri del PCR Master Mix ai tubi di reazione PCR etichettati, senza il supporto LB.Utilizzando un termociclo, incubare le reazioni come delineato nel protocollo di testo. Successivamente, aggiungere il colorante di caricamento ai frammenti amplificati e caricarli su un gel di agarosio all'1%. Caricare una scala del DNA appropriata per il dimensionamento ed eseguire il gel in un buffer di funzionamento del gel appropriato a 120 volt per 30 minuti.Calcola la dimensione teorica dell'amplicon aggiungendo le singole dimensioni dei promotori usati, delle impalcature gRNA e del numero di sequenze N20. Dai risultati della PCR colonia, identificare i cloni batterici, in base alla dimensione corretta della banda, e se è probabile che portino vettori corretti. Utilizzando la corrispondente coltura di 100 microlitri, inoculare una coltura LB overnight da 2,5 millilitri contenente 100 microgrammi per ampicillina millilitro.Incubare a 37 gradi Celsius per 12 ore. Quindi, utilizzare un mini-kit plasmide commerciale per estrarre il DNA plasmide, secondo le istruzioni del produttore. In questa procedura, la clonazione del gRNA dell'assembly di stringhe viene utilizzata per generare rapidamente plasmidi di espressione gRNA.Un risultato tipico dei PCR utilizzati per ottenere i pezzi STAgR è visto qui. Le sei ampliconi rappresentano pezzi lineari di DNA, ognuno contenente le singole sequenze gRNA N20 alle loro estremità. La dorsale plasmide è estesa con le sequenze di punta di gRNA1 e gRNA6, e quindi possiede le sovrapposizioni richieste ad altri due PCR per Gibson Assembly.Dopo la purificazione, è possibile ottenere una resa di DNA di almeno un microgrammo per vettori e inserti. Dopo Gibson Assembly, la trasformazione batterica si traduce in 100-700 colonie batteriche. L'analisi rappresentativa di 22 colonie batteriche, tramite colonia PCR a seguito di un protocollo STAgR con sei cassette gRNA, indica che sette cloni mostrano la dimensione dell'amplicone prevista per l'assemblaggio completo.Gli altri cloni probabilmente ricevettero vettori STAgR, contenenti da una a cinque cassette gRNA, mentre un clone è completamente vuoto. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in poche ore. Eseguito correttamente, consente la generazione di una moltitudine di vettori di espressione di gRNA multiplex in meno di una settimana lavorativa.Durante il tentativo di questa procedura, è importante prestare attenzione all'assegnazione e alla combinazione corrette di primer di sporgenza N20. Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione su come creare i tuoi vettori di espressione dell'RNA guida multiplex.

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Questo lavoro descrive un nuovo metodo per selettivamente organelli subcellulari nelle piante, saggiata usando l'BioRad Gene Gun.

Transient espressione genica in tabacco con all&#39;Assemblea Gibson e Gene Gun

La sintesi di plasmidi personalizzati richiede lavoro e tempo. Questo protocollo descrive l'uso della clonazione dell'assemblaggio Gibson per ridurre il lavoro e la durata della procedura di clonazione del DNA personalizzata. Il protocollo descritto produce anche costrutti proteici marcati affidabili per l'espressione nei mammiferi a un costo simile al tradizionale clonaggio del DNA taglia e incolla.

Generazione di plasmidi vettori che esprimono proteine ​​FLAG-tagged Ai sensi del regolamento di Human Factor-allungamento 1α Promotore Uso Gibson Assembly

Utilizzando assemblaggio DNA, vettori multipli CRISPR possono essere costruiti in parallelo in una singola reazione clonazione, rendendo la costruzione di un gran numero di CRISPR vettori un compito semplice. Pomodoro radici pelose sono un sistema eccellente modello per convalidare vettori CRISPR e generare materiali mutanti.

High-throughput CRISPR vettore Costruzione e caratterizzazione di modifiche del DNA da Generazione di Roots pomodoro Peloso

La proteina Cpf1 associata a CRISPR può essere guidata da un CRISPR RNA (crRNA) appositamente progettato per separare il DNA a doppio filamento nei siti desiderati, generando estremità appiccicose. Sulla base di questa caratteristica, è stato stabilito un standard di assemblaggio del DNA (C-Brick) e qui viene descritto un protocollo che descrive il suo utilizzo.

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Metodi per la generazione di librerie di gRNA su larga scala dovrebbero essere semplice, efficiente e conveniente. Descriviamo un protocollo per la produzione di gRNA librerie basate su digestione enzimatica del DNA bersaglio. Questo metodo, CORALINA (generazione della libreria completa gRNA attraverso attività controllata nucleasi) presenta un'alternativa alla sintesi del oligonucleotide personalizzato costosi.

Un protocollo universale per gRNA su larga scala produzione di libreria da qualsiasi fonte di DNA

Qui, un semplice, efficiente e conveniente metodo di clonazione sgRNA è descritta.

CRISPR guida RNA clonazione per sistemi mammiferi

Cloniamo e analizziamo i geni dei reporter generando RNA circolari. Questi geni reporter sono più grandi dei costrutti per analizzare lo splicing lineare e contenere elementi Alu. Per studiare gli RNA circolari, i costrutti vengono trasfettati in cellule e l'RNA risultante viene analizzato utilizzando RT-PCR dopo la rimozione dell'RNA lineare.

Uso dell'elemento Alu contenente Minigenes per analizzare gli RNA circolari

Qui, presentiamo un protocollo che descrive come i) assemblare un vettore auto-replicante utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate, ii) introdurre il vettore in un ospite cianobatterico per coniugazione, e iii) caratterizzano ceppi di cianobatteri transgenici utilizzando un lettore di lamele o citometria di flusso.

Modificazione genetica dei cianobatteri mediante congiugazione utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate

L'obiettivo di questo protocollo è fornire una guida dettagliata e dettagliata per assemblare costrutti multi-genico utilizzando il sistema di clonazione modulare basato sulla clonazione di Golden Gate. Fornisce anche raccomandazioni sui passaggi critici per garantire un assemblaggio ottimale in base alle nostre esperienze.

Assemblaggio rapido di costrutti multi-gene utilizzando la clonazione modulare del Golden Gate

Un modulo di clonazione molecolare adattabile di Gibson Assembly è stato impiegato in un formato di esperienza di ricerca universitaria (CURE) basato su corsi per studenti di laboratori di biologia molecolare. La valutazione dei risultati di apprendimento degli studenti ha mostrato una migliore comprensione e fiducia nella clonazione molecolare dopo il completamento del CURE e nuovi plasmidi sono stati clonati per la ricerca sulla biosintesi di prodotti naturali.

Migliorare i risultati degli studenti con un'esperienza di ricerca universitaria basata su corsi di clonazione molecolare adattabile

Questo articolo presenta un protocollo passo-passo che dimostra come la clonazione modulare (MoClo) possa essere adattata per la clonazione di operoni policistronici.

Assemblaggio modulare standardizzato di operoni policistronici con clonazione modulare (MoClo) utilizzando il toolkit In-Cloning

Impara il metodo STAgR per la clonazione di gRNA multiplex in applicazioni CRISPR/Cas9. Questo protocollo personalizzabile utilizza l'assemblaggio di Gibson per generare vettori di espressione gRNA in modo rapido ed economico.

Un protocollo personalizzabile per String Assembly gRNA clonazione (STAgR)

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