Name: Rilevazione basata su piastrine di ossido nitrico nel sangue misurando VASP fosforilazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Scopri come rilevare l'ossido nitrico nel sangue usando le piastrine come sensori sensibili attraverso la fosforilazione di VASP. Questo metodo permette di misurare concentrazioni nanomolari in vitro e in vivo.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione intramurale NIH Dr Alan N. Schechter.

Nota: I campioni di sangue sono stati ottenuti dalla banca del sangue di NIH (IRB approvato protocollo: 99-CC-0168).
1. sangue preparazione del campione
Nota: Per evitare l'attivazione della piastrina, prelievo di sangue lentamente e mescolare delicatamente con citrato capovolgendo la provetta diverse volte.
<ol><li>
Preparazione di plasma ricco di piastrine (PRP)
	<ol>
<li>30 – 50 mL di sangue utilizzando un 20 G o un ago di diametro più grande di disegnare e aggiungere in una provetta contenente citrato di sodio (3.8%) in un rapporto di 1:9 o acido citrato destrosio (ACD) (citrato trisodico 85mm, acido citrico 66,6 mM, 111 millimetri di glucosio, pH 4.5) in un rapporto di 1:6.</li>
		<li>Aliquotare 5 mL di sangue intero appena raccolti in provette coniche da 15 mL vuote. Centrifugare il sangue intero a 120 x g per 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Raccogliere con cura il supernatante contenente le piastrine (plasma ricco di piastrine, PRP) dalla parte superiore mediante una pipetta di trasferimento in plastica. Nota: PRP dal punto 1.1.3 è pronto per l'uso negli esperimenti o per un'ulteriore elaborazione per preparare lavato le piastrine. Il morbido pellet ottenuto dopo centrifugazione (punto 1.1.2) contiene globuli rossi e globuli bianchi e può essere ulteriormente purificato per ottenere lavati globuli rossi (RBC) — vedere passaggio 1.3. L'esperimento deve essere finito entro 2 h dopo il prelievo di sangue. Quando si raccolgono PRP (surnatante), evitare la raccolta di buffy coat-contenenti leucociti accumulato nell'interfaccia di PRP/RBC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione delle piastrine lavate (opzionale)
	<ol>
<li>Centrifuga raccolti PRP a 400 x g per 10 min a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e mantenere i pellet della piastrina.</li>
		<li>Lavare delicatamente i pellet aggiungendo 5 mL di tampone CGS (120 mM NaCl, 12,9 millimetri trisodio citrato e 30 mM di glucosio, pH 6,5) e centrifuga a 400 x g per 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Risospendere il pellet della piastrina con 3 mL di buffer di Tyrode modificato (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH2PO4, 2,9 mM KCl, 12mm NaHCO3, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2mm CaCl2, 10 mM a pH 7,4 glucosio).</li>
		<li>Diluire le piastrine (1: 100 — come esempio, 10 µ l di piastrine nel 990 µ l di soluzione di Rees-Ecker) con soluzione di Rees Ecker e conteggio di un emocitometro.</li>
		<li>Regolare la densità delle piastrine a 3 x 108 cellule/mL aggiungendo Tyrode buffer.</li>
		<li>Incubare la sospensione della piastrina a 37 ° C per 1 h prima di iniziare l'esperimento. Nota: Piastrine lavate sono stabili per 5 – 8 h a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione della lavata di globuli rossi (RBC)
	<ol>
<li>Dopo la raccolta, centrifugare il pellet morbido ottenuto nel passaggio da 1.1.3 a 2.500 x g per 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Scartare il surnatante e lavare la pallina di RBC con 5 mL di PBS mediante centrifugazione a 2.500 x g per 10 min a temperatura ambiente. Ripetere questa operazione per 3 volte.</li>
		<li>Scartare il PBS e utilizzare globuli rossi lavati per ulteriori esperimenti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. deossigenazione
<ol><li>Aggiungere 1 mL di una miscela di PRP (preparata al punto 1.1.4. o 1.2.4.) e globuli rossi (preparati al passaggio 1.3.) presso l'ematocrito desiderata in una bottiglia in polipropilene chiusa con un tappo di gomma. Ad esempio, al 20% ematocrito, aggiungere 200 µ l di RBCs a 800 µ l di PRP. Nota: Ha suggerito gli ematocriti sono da 0% fino al 40%. Non utilizzare una bottiglia di vetro o il pallone come le piastrine aderiscono alla superficie di vetro.</li>
	<li>Inserire l'ago collegato al serbatoio di elio gas in bottiglia chiusa e rendere l'uscita del gas con l'inserimento di un ago da 26 G (Figura 1).</li>
	<li>Roteare lentamente la bottiglia a temperatura ambiente. Nota: Non consentire il gas He bolla attraverso la preparazione di sangue. Flusso di gas lento è preferibile per questa procedura ed eccessivamente veloce flusso di gas di lui conduce al hemolysis aumentato. Il flusso di gas più efficiente deve essere determinato dalla prova, come altamente dipende dalla geometria del setup sperimentale.</li>
	<li>Periodicamente è possibile seguire il processo di deossigenazione misurando la pressione parziale dell'ossigeno (pO2) utilizzando un Co-ossimetro. Nota: Nelle nostre mani, 10 min di deossigenazione diminuzioni pO2 a 25 mmHg, che è necessaria per la riduzione del nitrito di RBCs. continuando la deossigenazione ridurre ulteriormente pO2 a 10 mmHg; Tuttavia, ha condotto al hemolysis aumentato e l'aumento dell'emoglobina senza cellula (Figura 2).</li>
</ol>3. globuli nitrito riduzione
<ol><li>Aggiungere 1 mL di PBS (pH 7.4) in 0,0345 g di NaNO2 per rendere la soluzione di riserva di 500 mM di nitrito. Diluizione seriale in PBS (pH 7.4), diluire 500 mM NaNO2 a 250 µM NaNO2 (25x).</li>
	<li>Utilizzando una microsiringa, iniettare nitrito (40 µ l) attraverso il setto nel campione deossigenato di PRP e globuli rossi per ottenere le concentrazioni finali di 10 µM in totale 1 mL di campione. Nota: In questo esperimento, le concentrazioni finali di nitrito utilizzato è di 10 µM.</li>
	<li>Incubare il campione a 37 ° C per 10 minuti o più. Nota: Regolare l'esatta durata di incubazione di RBC con nitrito necessario per la riduzione del nitrito massima per diversi tipi di esperimenti.</li>
	<li>Rimuovere il tappo e la pipetta da 1 mL del campione in una provetta da microcentrifuga.</li>
	<li>Centrifugare a 200 x g per 3 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dispensare 300 µ l della sospensione piastrinica da parte superiore del surnatante e mescolare con il ACD (pH 6,5) in un rapporto di 1:9. Scartare il pellet di RBC.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione delle piastrine a 500 x g per 4 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 80 µ l di tampone di lisi ghiacciata (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5% NP-40, pH 7.4) contenente inibitore della proteasi cocktail III (1: 500) il recettore piastrinico pellet.</li>
</ol>4. Western Blotting della VASP
<ol><li>Carico 15 µ g di proteina da ogni campione a 2 separati 10% gel di SDS-PAGE. Nota: Buffer di strippaggio duro, che contiene b-mercaptoetanolo, non è possibile rimuovere gli anticorpi P-VASPSer239 e VASP dalla membrana; di conseguenza, P-VASP Ser239 e VASP dovrebbe essere gestito separatamente.</li>
	<li>Eseguire i gel 120 V per h 1,30 e trasferimento alla membrana di nitrocellulosa.</li>
	<li>Legame non specifico di blocco con 5% senza grassi del latte secco.</li>
	<li>Incubare la membrana con P-VASPSer239 (1: 500), VASP (1:1, 000) e GAPDH (1:1, 000) per una notte a 4 ° C.</li>
	<li>Incubare anticorpo secondario di rafano perossidasi (HRP) con la membrana per 45 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Esporre la membrana con una macchina di imager e quantificare la densità di banda usando ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reaction+between+nitrite+and+deoxyhemoglobin.+Reassessment+of+reaction+kinetics+and+stoichiometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).</li>
<li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li>
<li>Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+a+cellular+nitric+oxide%2FcGMP%2Fphosphodiesterase-5+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).</li>
<li>Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+nitrite+on+coagulation+processes+demonstrated+by+thromboelastography%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+oxide%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography.</a> Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).</li>
<li>Wajih, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+red+blood+cell+S-nitrosation+in+nitrite+bioactivation+and+its+modulation+by+leucine+and+glycose%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose.</a> Redox Biology. 8, 415-421 (2016).</li>
<li>Akrawinthawong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometric+analysis+of+the+inhibition+of+platelet+reactivity+due+to+nitrite+reduction+by+deoxygenated+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 9 (3), e92435(2014).</li>
<li>Friebe, A., Koesling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nitric+oxide-sensitive+guanylyl+cyclase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase.</a> Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).</li>
<li>Srihirun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+inhibition+by+nitrite+is+dependent+on+erythrocytes+and+deoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation.</a> PLoS One. 7 (1), e30380(2012).</li>
<li>Smolenski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+regulation+of+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+serine+239+phosphorylation+in+vitro+and+in+intact+cells+using+a+phosphospecific+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).</li>
<li>Burkhart, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+comprehensive+and+quantitative+analysis+of+human+platelet+protein+composition+allows+the+comparative+analysis+of+structural+and+functional+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways.</a> Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).</li>
<li>Parakaw, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+inhibition+and+increased+phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+following+sodium+nitrite+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+oxide%22%5BJournal%5D)">Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation.</a> Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).</li>
<li>Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+%28P-VASPSer239%29+in+platelets+is+increased+by+nitrite+and+partially+deoxygenated+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 13 (3), e0193747(2018).</li>
<li>Mal Cortese-Krott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+soluble+guanylate+cyclase+in+RBCs%3A+preserved+activity+in+patients+with+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease.</a> Redox Biology. 14, 328-337 (2018).</li>
<li>Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+the+focal+adhesion+protein+VASP+in+vitro+and+in+intact+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letter%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets.</a> FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).</li>
</ol>

Dr. Alan Schechter è elencato come co-inventore su numerosi brevetti rilasciati ai National Institutes of Health, per l'uso di nitrito sali per il trattamento delle malattie cardiovascolari. Egli riceve i diritti d'autore basati su NIH licenze di questi brevetti per lo sviluppo clinico, ma nessun altro indennizzo.

Poiché le piastrine sono attivate, un trattamento delicato del piastrina-contenenti campioni è richiesto. Pipettaggio veloce e vigorosa agitazione dovrebbe essere evitati. Inibitori delle piastrine come prostaciclina (PGI2) possono essere utilizzati per impedire l'attivazione della piastrina; Tuttavia, questo potrebbe influire sulla alcune vie di segnalazione all'interno delle piastrine. Per la preparazione di pellet della piastrina, aggiungiamo ACD per le sospensioni della piastrina e utilizzare centrifugazio...

Le piastrine sono piccole cellule a forma di disco frammenti derivate dai megacariociti che sono fondamentali per la coagulazione del sangue. La cascata di coagulazione è iniziata da varie molecole bioattive (come collagene o ADP), pubblicati dopo la ferita della parete vascolare. Processo di coagulazione del sangue può essere modificato, tra vari effettori dall'ossido nitrico (NO). NO, prodotta naturalmente dalle cellule di mammiferi, è uno dei più versatili segnali fisiologici. Esso agisce come un potente vasodilatatore, neurotrasmettitore e modulatore immunitario, per citarne alcune delle sue numerose funzioni. Nel sangue, NO anche aiuta a regolare l'entità della coagulazione del sangue inibendo l'aggregazione della piastrina. Una delle fonti più probabile di NO nel sangue è nitrito, un ione inorganico che ha dimostrato di servire come un precursore del No. Reagendo con globuli rossi (RBCs), nitrito è ridotto a n e deoxyHb è ossidato a metaemoglobina (metHb)1. NO rilasciato da globuli rossi è vasoattivi e provoca vasodilatazione2. Questo percorso di riduzione di nitriti non è un supplente nessun percorso di generazione, agire insieme con e non integrare la classica nessun percorso di generazione mediante endoteliale di ossido nitrico sintasi in condizioni di ipossia.
Le piastrine se stessi non sono in grado di ridurre il nitrito in NO ma sono molto sensibili alla sua presenza. In piastrine intatte, non nel nanomolari gamma aumenta cGMP (CE50 = 10 nM) e fosforilazione della VASP (CE50 = 0.5 nM)3. Di conseguenza, le piastrine possono servire come un ottimo sensore di riduzione di nitrito di RBCs e nessun rilascio nel sangue. Ci sono diversi metodi che possono misurare direttamente il grado di attivazione piastrinica - come aggregometria e tromboelastografia (TEG)4,5. Tuttavia, questi metodi richiedono strumentazione specializzata costosi e piuttosto grandi quantità di materiale. È inoltre possibile monitorare gli eventi a valle, dopo NO viene rilasciato da globuli rossi, utilizzando i cambiamenti nell'espressione di proteina di superficie delle piastrine – ad esempio P-selectin6. NON è noto anche per aumentare la quantità di cGMP in piastrine7. In precedenza, abbiamo usato cGMP per non controllare nessun rilascio nel sangue dopo la riduzione del nitrito di deossigenata RBC8. Ciò rivelata per essere un metodo molto sensibile; Tuttavia, cGMP è una molecola di breve durata e la relativa rilevazione coinvolge vasto lavoro. Un'altra possibilità, descritta nel protocollo presentato, utilizza la fosforilazione del phospho vasodilatatore-stimolata (VASP)-proteina per rilevare la presenza di NO nel sangue. VASP è un substrato di attivazione della proteina chinasi G, che è fosforilata sull'interazione con NO attraverso la via sGC/cGMP9. Fosforilazione VASP rilevabile si verifica molto basso senza concentrazioni, che potrebbero rendere le piastrine un rivelatore molto sensibile di nessuna presenza nel sangue. VASP è altamente espresso in piastrine, ma non in altre cellule del sangue, che permette di seguire in modo selettivo gli eventi che coinvolgono le piastrine10.
L'obiettivo principale del presente protocollo è di descrivere il metodo in dettaglio per la rilevazione di nessun rilascio nel sangue intero utilizzando la sua interazione con le piastrine monitorando VASP fosforilazione11,12. Il metodo descritto non consente di individuazione tempestiva di basso vi erano concentrazioni - teoricamente in gamma nanomolar che rende più sensibile di determinazione di cGMP, dovute all'uso di tecniche standard Western blot realizzabili in laboratorio la maggior parte del presente protocollo Impostazioni.

<table><tbody><tr><td>Citrato trisodico</td><td>Fornitura da parte della banca</td><td></td><td></td>del sangue NIH</tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Fornitura da parte della banca</td><td></td><td></td>del sangue NIH</tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl; cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S-7653 1kg</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4; fosfato di sodio monobasico, monoidrato</td><td>Mallinckrodt Chemical</td><td>7892-04</td><td></td></tr><tr><td>KCl; cloruro di potassio</td><td>Mallinckrodt Chemical</td><td>6858</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3; bicarbonato di sodio</td><td>Mallinckrodt Chemical</td><td>7412-12</td><td></td></tr><tr><td>HEPES; Acido N-[2-idrossietil]piperazina-N'-[-etansolfonico]</td><td>Sigma</td><td>H3375-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (1 M); cloruro di magnesio</td><td>Qualità Biologia</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2; cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Bottiglie economiche in HDPE a bocca stretta</td><td>Nalgene</td><td>2089-0001</td><td></td></tr><tr><td>Setto rosso tappo NO.29</td><td>Fisherbrand</td><td>FB57877</td><td></td></tr><tr><td>NaNO2-; nitrito di sodio</td><td>Sigma</td><td>S2252-500G</td><td></td></tr><tr><td>TRIZMA Base; Tris[idrossimetil]amminometano</td><td>Sigma</td><td>T8524-250G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-Nonilfenil-polietilenglicole</td><td>Sigma</td><td>74385-1L</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail set di inibitori della proteasi III</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Fosfo-VASP (Ser239)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>3114</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo VASP</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>3112</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Coniglio mAb</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M-6250-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Perossidasi AffiniPura capra Anti-coniglio IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrato</td><td>BIO-RAD</td><td>1705060-200ml</td><td></td></tr><tr><td>CO-ossimetro (ABL 90 flex)</td><td>Radiometro</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rilevazione basata su piastrine di ossido nitrico nel sangue misurando vasp fosforilazione

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Le piastrine sono le componenti del sangue responsabili della coagulazione sanguigna corretta. Loro funzione altamente è regolata da varie vie. Uno dei più potenti agenti vasoattivi, ossido nitrico (NO), può anche agire come un potente inibitore dell'aggregazione piastrinica. Diretto nessun rilevamento nel sangue è molto impegnativo a causa della sua alta reattività con emoglobina senza cellula che non limita Half-Life per la gamma di millisecondo. Attualmente, nessun cambiamento dopo gli interventi sono solo stimati basato sui cambiamenti misurati di nitriti e nitrati (membri del pathway metabolici di nitrato-nitrito-NO). Tuttavia precisa, queste misure sono piuttosto difficili da non interpretare vis à vis effettivo modifiche, a causa del nitrito naturalmente elevato della linea di base e livelli che sono diversi ordini di grandezza superiori a cambiamenti attesi non sé di nitrati. Di conseguenza, lo sviluppo di metodi diretti e semplici che permetterebbero di individuare direttamente NO è attesa da tempo. Questo protocollo non risolve un potenziale impiego delle piastrine come un altamente sensibili sensore nel sangue. Descrive come nessun generatori di plasma ricco di piastrine iniziale (PRP) e delle piastrine lavate i preparativi e l'uso di nitrito e di cellule rosse del sangue deossigenate. Fosforilazione della VASP a serina 239 (P-VASPSer239) viene utilizzata per rilevare la presenza di NO. Il fatto che la proteina VASP è altamente espressa in piastrine e che esso viene rapidamente fosforilata quando nessuno è presente conduce a un'occasione unica per utilizzare questa via per non rilevare direttamente la presenza nel sangue.

I campioni di sangue venoso hanno pO2 valori tra 50-80 mmHg. Deossigenazione di elio diminuisce velocemente pO2 a 25 mmHg entro 10 min. Increased deossigenazione tempo leggermente maggiori diminuzioni pO2. Tuttavia, tempo aumentato di deossigenazione inoltre conduce ai livelli significativamente aumentati di emoglobina senza cellula (determinato dal Co-ossimetro, visivamente visto in Figura 2 come colorazione sempre più rossa ...

Qui, presentiamo un protocollo per affrontare l'uso potenziale delle piastrine come un sensore molto sensibile dell'ossido di azoto nel sangue. Esso descrive la preparazione iniziale della piastrina e l'uso di nitrito e di cellule rosse del sangue deossigenate come generatori di ossido nitrico.

Rilevazione basata su piastrine di ossido nitrico nel sangue misurando VASP fosforilazione

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

Questo protocollo affronta il potenziale uso delle piastrine come sensore di ossido nitrico altamente sensibile sia in vitro che in vivo all'interno del sangue. L'aumento della fosforilato vasodilatatore-fosfoproteina stimolata o della serina P-VASP 239 nelle piastrine l'ossido nitrico ha alcuni vantaggi, tra cui la capacità di rilevare la presenza di ossido nitrico nei lignaggi nanomolari. Entro due ore dalla raccolta da 30 a 50 millilitri di sangue intero da un donatore sano, aggiungere cinque aliquote millilitri del sangue nel numero appropriato di tubi conici da 15 millilitri per la centrifugazione.Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per raccogliere con cura il plasma ricco di piastrine dalla parte superiore dei supernatanti. Pellet le piastrine ricche di plasma con una seconda centrifugazione e lavare delicatamente i pellet in cinque millilitri di tampone CGS. Centrifuga a 400 g per 10 minuti a temperatura ambiente.Al termine della centrifugazione, resuspend i pellet in tre millilitri di tampone Tyrode modificato. Utilizzare un emocitometro per il conteggio e regolare la densità delle sospensioni piastrine a tre volte 10 all'ottava cellule per millilitro nel ta

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Una procedura non invasiva per valutare la funzione endoteliale è dimostrata utilizzando il Endo-PAT 2000.

Valutazione della funzione endoteliale vasodilatatore con l&#39;Endo-PAT 2000

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Tecniche analitiche per il saggio Bioattività Ossido Nitrico

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Catturare i cambiamenti dinamici nell'attivazione proteica dei globuli rossi enucleati pone sfide metodologiche, come la conservazione dei cambiamenti dinamici agli stimoli acuti per una valutazione successiva. Il protocollo presentato descrive la preparazione del campione e le tecniche di colorazione che consentono la conservazione e l'analisi dei cambiamenti proteici rilevanti e la successiva rilevazione.

Rilevazione basata sull'immunocolorazione di alterazioni dinamiche nelle proteine dei globuli rossi

Descriviamo un protocollo per isolare e coltivare cellule endoteliali della vena safena umana (hSVEC). Forniamo anche metodi dettagliati per produrre stress di taglio e allungamento per studiare lo stress meccanico nelle hSVEC.

Vena safena umana Isolamento delle cellule endoteliali ed esposizione a livelli controllati di stress da taglio e allungamento

La generazione di anione superossido è essenziale per la stimolazione delle piastrine e, se disregolata, fondamentale per le malattie trombotiche. Qui, presentiamo tre protocolli per la rilevazione selettiva di anioni superossido e lo studio della regolazione piastrinica redox-dipendente.

Metodi alternativi per la rilevazione della generazione di anioni superossido nelle piastrine 

Viene fornito un protocollo dettagliato per l'imaging di singole piastrine in migrazione utilizzando cavi avidina-biotina funzionalizzati con RGD con densità regolabile, rivelando che le piastrine generano una forza sufficiente per rompere il legame avidina-biotina.

Un test in vitro per studiare la migrazione piastrinica utilizzando tethers avidina-biotina funzionalizzati con RGD

La formazione di piastrine procoagulanti è stata correlata con un aumentato rischio di trombosi. Di seguito viene presentato un preciso protocollo per l'isolamento delle piastrine lavate dal sangue umano, volto a quantificare l'esposizione alla fosfatidilserina e al rilascio di microvescicole, caratteristiche distintive delle piastrine procoagulanti.

Caratterizzazione piastrinica procoagulante mediante misurazione dell'esposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole da piastrine purificate umane

Questo protocollo descrive il saggio di emostasi di Nijmegen, che consente una misurazione simultanea e temporanea della generazione di trombonina e plasmina per fornire una valutazione integrata della coagulazione e della fibrinolisi. Il test mira a migliorare la caratterizzazione dell'equilibrio emostatico in ambito di ricerca e clinico oltre l'ambito dei test emostatici.

Il saggio sull'emostasi di Nijmegen: misurazione simultanea fluorogenica della generazione di trombina e plasmina in un singolo pozzo

Scopri come rilevare l'ossido nitrico nel sangue usando le piastrine come sensori sensibili attraverso la fosforilazione di VASP. Questo metodo permette di misurare concentrazioni nanomolari in vitro e in vivo.

Rilevazione basata su piastrine di ossido nitrico nel sangue misurando VASP fosforilazione

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