Rilevazione basata su piastrine di ossido nitrico nel sangue misurando VASP fosforilazione

Questo protocollo affronta il potenziale uso delle piastrine come sensore di ossido nitrico altamente sensibile sia in vitro che in vivo all'interno del sangue. L'aumento della fosforilato vasodilatatore-fosfoproteina stimolata o della serina P-VASP 239 nelle piastrine l'ossido nitrico ha alcuni vantaggi, tra cui la capacità di rilevare la presenza di ossido nitrico nei lignaggi nanomolari. Entro due ore dalla raccolta da 30 a 50 millilitri di sangue intero da un donatore sano, aggiungere cinque aliquote millilitri del sangue nel numero appropriato di tubi conici da 15 millilitri per la centrifugazione.

Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per raccogliere con cura il plasma ricco di piastrine dalla parte superiore dei supernatanti. Pellet le piastrine ricche di plasma con una seconda centrifugazione e lavare delicatamente i pellet in cinque millilitri di tampone CGS. Centrifuga a 400 g per 10 minuti a temperatura ambiente.

Al termine della centrifugazione, resuspend i pellet in tre millilitri di tampone Tyrode modificato. Utilizzare un emocitometro per il conteggio e regolare la densità delle sospensioni piastrine a tre volte 10 all'ottava cellule per millilitro nel tampone tyrode fresco. Quindi incubare le sospensioni piastrine per un'ora a 37 gradi Celsius.

Nel frattempo, raccogliere i globuli rossi dagli strati plasmatici senza piastre dei campioni di sangue intero per centrifugazione seguiti da quattro lavaggi in cinque millilitri di PBS per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, scartare i supernaganti e mescolare i globuli rossi con un millilitro delle piastrine ricche di plasma presso l'appropriato ematocrito sperimentale in bottiglie di polipropilene chiuse con tappi di gomma. Inserire un ago collegato a un serbatoio di gas elio in ogni setto e inserire aghi calibro 26 per realizzare prese di gas.

Quindi ruotare lentamente le bottiglie a temperatura ambiente e utilizzare un ossimetro per misurare la pressione parziale dell'ossigeno per il monitoraggio del processo di deossigenazione. La velocità di diminuzione dell'ossigeno dipende dalla portata dell'elio e dalla velocità di agitazione. Pertanto, il tempo di ossigenazione deve essere ottimizzato prima di iniziare un esperimento in quanto questo dipende fortemente dalla geometria della configurazione sperimentale.

Per la riduzione del nitrito dei globuli rossi, utilizzare un microsiringe per iniettare nitrito attraverso il setto nei campioni deossigenati di PRP e RBC in modo da ottenere una concentrazione finale di 10 micromolari. Incubare i campioni per almeno 10 minuti a 37 gradi Celsius e trasferire un millilitro di ciascun campione in un tubo di microcentrifugo per la centrifugazione. Trasferire 300 microlitri di sospensione piastrinica dalla parte superiore dei supernaganti in nuovi tubi a microcentrifugo e aggiungere il destrosio di citrato acido a ciascun tubo con un rapporto uno-nove.

Centrifugare nuovamente le piastrine e rimescolare i pellet in 80 microlitri di tampone di lisi ghiacciata contenente cocktail inibitore della proteasi tre per ogni tubo. Successivamente, caricare 15 microgrammi di proteine da ogni campione a due gel separati 10%SDS-PAGE. Eseguire i gel a 120 volt per 1,3 ore.

Alla fine della corsa, trasferire i gel su singole membrane di cellulosa nitrosa e bloccare qualsiasi legame non specifico con un volume appropriato di latte secco non grasso al 5%. Incubare le membrane con gli anticorpi primari appropriati durante la notte a quattro gradi Celsius, seguita dall'etichettatura con un anticorpo perossidasi del ravanello secondario appropriato per 45 minuti a temperatura ambiente. Quindi esporre le membrane con un imager per quantificare la densità della banda con un programma di analisi delle immagini appropriato.

Campioni di sangue venoso sano hanno valori parziali di pressione dell'ossigeno tra 50 e 80 millimetri di mercurio. La disossazione per elio riduce rapidamente la pressione parziale dell'ossigeno a 25 millimetri di mercurio entro 10 minuti. Un'ulteriore diminuzione della pressione parziale dell'ossigeno può essere ottenuta con un aumento del tempo di deossigenazione.

L'aumento della deossigenazione porta ad un aumento dei livelli di emolisi, come indicato dal plasma di colore sempre più rosso. Questo è un effetto della deossigenazione e non è causato dall'agitazione stessa come indicato dalla mancanza di emolisi in campioni mescolati senza elio. Sia la fosfoproteina stimolata dal vasodilatatore che i livelli di espressione VASP e fosforilato-VASP nelle piastrine sono diminuiti con l'aumento dell'ematocrito nei campioni deossigenati rilevati dalla macchia occidentale.

Il trattamento con un donatore di ossido nitrico di breve durata aumenta l'espressione di fosfoproteina stimolata dal vasodilatatore fosforilato nelle piastrine entro 10 secondi dal trattamento. Inoltre, i livelli di Phosphorylated-VASP o P-VASP sono rimasti stabili fino a 10 minuti dopo l'incubazione del donatore di NO con plasma ricco di piastrine, indicando che c'è tempo sufficiente per separare gli RBC dalle piastrine senza influire sui livelli di P-VASP esistenti. Il nitrito aumenta anche i livelli di P-VASP della piastrinica in presenza di RBC deossigenati.

Qui il rapporto tra P-VASP e VASP totale dipende dal livello di ematocrito. VASP è altamente espresso in piastrine ed è rapidamente fosforilato in presenza di ossido nitrico. Pertanto, questo protocollo fornisce un metodo per studiare l'induzione dell'ossido nitrico da vari stimoli fisiologici.

Con questo metodo, abbiamo utilizzato con successo l'aumento del P-VASP nella piastrine come marcatore di stimolazione dell'ossido nitrico da nitrito inalato in vivo. Non dimenticare che lavorare con la piastrina con un campione biologico deve sempre essere eseguito utilizzando l'attrezzatura di protezione individuale appropriata.