Saggio di microfluidic per la valutazione di adesione del leucocita alle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-ECs)

Questo protocollo dettagliato fornisce una descrizione dettagliata della messa a punto sperimentale e analisi dei dati per la valutazione delle risposte infiammatorie in hiPSC-ECs e l'analisi di adesione del leucocita sotto flusso fisiologico.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle cellule staminali pluripotenti umane sulla funzionalità e le risposte infiammatorie delle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce una descrizione dettagliata della configurazione sperimentale e dell'analisi dei dati per la valutazione dell'adesione dei leucociti alle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Per il rivestimento di chip microfluidici, posizionare un biochip sterile in una piastra di Petri sterile di 10 centimetri e utilizzare una punta di pipetta da 10 microlitri per iniettare 10 microlitri di soluzione di lavoro di fibronectina appena preparata in ogni canale del biochip.

Coprire la piastra di Petri e posizionare in una camera umidificata durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, preripidi il biochip in un incubatore Celsius di 37 gradi e riasspensi le cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo raccolte da una coltura cellulare confluente dell'80-100% alla concentrazione desiderata in un mezzo fresco privo di siero di cellule endoteliali. Successivamente, aspirare la soluzione di fibronectina da tutti i canali del chip microfluidico e mescolare accuratamente le cellule per ottenere una sospensione cellulare omogenea prima di utilizzare una punta di pipetta da 10 microlitri per iniettare sei microlitri di cellule in ogni canale.

Esaminare il biochip al microscopio per confermare che le cellule sono distribuite uniformemente con un'alta densità cellulare. Dopo 15 minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere 40 microlitri di mezzo privo di siero di cellule endoteliali FULL nei serbatoi medi su entrambi i lati di ciascun canale. E riportare il biochip nell'incubatrice per un'ora.

Quindi, aggiungere altri 50 microlitri di mezzo privo di siero di cellule endoteliali FULL nei serbatoi su entrambi i lati di ciascun canale. Per l'imaging dal vivo delle cellule sementi, confermare che le configurazioni microfluidiche sono pronte, che la camera di imaging dal vivo è equilibrata a 37 gradi Celsius e che il livello di CO2 ha raggiunto il 5%Posizionare il biochip nel supporto del chip del microscopio e montare il supporto del chip sullo stadio di imaging del microscopio. Per collegare il biochip alla pompa tramite il collettore, posizionare l'adattatore a otto pin vicino ai serbatoi di uscita del chip e approfondire tutti i perni nel mezzo senza collegare completamente i perni.

Nel software della pompa microfluidico, selezionate Washout/Connect al chip e fate clic su Esegui passo saggio (Run Assay Step) per erogare 30 microlitri di mezzo RPMI attraverso ogni pin. Quindi inserire l'adattatore a otto pin nella presa del biochip. Utilizzare una pipetta per aspirare manualmente il mezzo da tutti i serbatoi di ingresso del biochip e selezionare Washout /Chip Washout e Run Assay Step per perfondere un canale alla volta con 40 microlitri di mezzo privo di siero di cellule endoteliali Full per rimuovere eventuali cellule morte e detriti.

Quando tutti i canali sono stati lavati sostituire il mezzo dal serbatoio di ingresso del canale di interesse con 100 microlitri di leucociti umani diluiti a 2,5 per 10 alle sei cellule per concentrazione di millilitro nel mezzo RPMI. Fate clic su Descrizione test cella/passo (Cell Assay/Step description) e impostate la descrizione canale/passo corrente e impostate il canale di interesse su On e gli altri sette canali su Disattivato( Select Cell Assay Step description) e fate clic su Esegui passo saggio (Run Assay Step).

Sostituire i leucociti rimanenti nel serbatoio di ingresso con 100 microlitri di mezzo RPMI completo. Quindi, fare clic su Descrizione del passo del saggio delle celle e eseguire il passo di dosaggio per perfondere il canale per cinque minuti con il supporto RPMI per rimuovere eventuali leucociti non diversi. Quindi acquisire immagini da almeno tre a quattro diverse posizioni nel canale per visualizzare i leucociti aderenti.

Per quantificare i leucociti aderenti, aprire il software di elaborazione delle immagini CellProfiler e importare il file Count Leukocytes Pipeline. In Moduli di input selezionare Immagini e trascinare la cartella con le immagini non elaborati dei leucociti aderenti alla finestra dell'elenco File. In Moduli di analisi selezionare Identifica oggetti primari e indicare i diametri minimi e massimi dei leucociti aderenti in pixel.

In Moduli di analisi selezionare FilterObjects. Quindi selezionare i criteri di filtro e immettere l'area minimamente accettata degli oggetti in pixel e fare clic su Analizza immagini per iniziare l'analisi. La dissociazione ottimale delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo dovrebbe comportare una sospensione di una singola cellula priva di grumi cellulari.

In genere, 15 minuti dopo l'iniezione le cellule endoteliali si attaccano alla parte inferiore del canale e iniziano a diffondersi. Entro un'ora dall'iniezione le cellule endoteliali dovrebbero formare un monostrato ben diffuso attraverso il canale a quel punto sono pronte per l'uso nel saggio flow. L'utilizzo del software di elaborazione delle immagini open source gratuito come dimostrato consente il filtraggio di oggetti identificati in base a un'area minima e l'esclusione di oggetti falsamente identificati come detriti cellulari, autofluorescenza o qualsiasi altro segnale fluorescente non specifico.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare la stimolazione con citochine pro-infiammatorie e di includere le cellule endoteliali della vena ombelicale umana primaria come controllo positivo. Non dimenticare che lavorare con le linee cellulari e cellulari dei mammiferi primari può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come indossare cappotto da laboratorio, guanti e protezione degli occhi dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.