Name: Saggio di microfluidic per la valutazione di adesione del leucocita alle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-ECs) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Impara un saggio microfluidico per valutare l'adesione dei leucociti alle cellule endoteliali derivate da hiPSC. Questo metodo consente di studiare le risposte infiammatorie in tempo reale con imaging live.

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Gli autori si desidera ringraziare le seguenti sovvenzioni: Consiglio europeo della ricerca (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); Paesi Bassi organo-on-Chip iniziativa, un progetto di gravitazione NWO finanziato dal Ministero dell'istruzione, della cultura e della scienza del governo dei Paesi Bassi (024.003.001).

1. preparazione di soluzioni e reagenti
<ol><li>Preparare completo supporto di Human Endothelial-SFM (CE-SFM pieno) con l'aggiunta di siero plasma-derivato della piastrina-poveri (1%), fattore di crescita di base del fibroblasto (bFGF, 20 ng/mL) e fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF, 50 ng/mL) a Human Endothelial-SFM (Vedi tabella di Materiali). Filtrare il mezzo attraverso un filtro da 0,22 µm a poro e conservarla a 4 ° C fino a 2 settimane.</li>
	<li>Preparare il terreno RPMI completo con l'aggiunta di siero bovino fetale (10%), 2-mercaptoetanolo (0,05 nM), L-Glutammina (1%), penicillina-streptomicina (25 U/mL) per medium RPMI (Vedi Tabella materiali). Conservare a 4 ° C fino a 3 settimane.</li>
</ol>2. rivestimento di Microfluidic chip
<ol><li>Inserire un biochip sterile in una capsula di Petri sterile 10cm.</li>
	<li>Preparare soluzione di lavoro di fibronectina mediante ricostituzione la soluzione di riserva in tampone fosfato salino (PBS) senza Ca2 +/Mg2 + a una concentrazione finale di 50 µ g/mL. Stima 80 µ l di soluzione di lavoro per biochip.</li>
	<li>Iniettare 10 µ l di soluzione di lavoro di fibronectina in ciascun canale del biochip. Utilizzare una pipetta con piccole punte di 10 µ l e assicurarsi che formare un contatto stretto tra l'imbocco del canale e la punta della pipetta (Figura 1, sinistra).</li>
	<li>Chiudere il coperchio del piatto Petri contenente il biochip e posizionarlo in una camera umidificata (Figura 2B). Conservare la camera a 4 ° C durante la notte. Umidificare la camera, mettere una velina pulita nella parte inferiore della camera umidificata e aggiungere 5 mL di sterile H2O.</li>
	<li>Giorno successivo, prima del saggio, pre-riscaldare il biochip a 37 ° C nell'incubatore.</li>
</ol>3. preparazione del hiPSC-ECs
Nota: Nel protocollo descritto qui, hiPSC-ECs erano differenziati, purificata, crioconservati e scongelato come descritto in precedenza8.
<ol><li>Disgelo e piastra hiPSC-ECs in completa CE-SFM pieno in uno 0,1% rivestite con gelatina T75 matraccio, tre o quattro giorni prima del dosaggio.</li>
	<li>La notte prima del dosaggio, stimolare hiPSC-ECs con TNFα aggiungendo CE-SFM pieno addizionata di 10 ng/mL TNFα e incubare pernottamento (~ 12 h) a 37 ° C, come descritto in precedenza 7.</li>
</ol>4. hiPSC-ECs dissociazione e il Seeding in Chip microfluidico
<ol><li>Il giorno del test, è necessario prendere la fiaschetta di hiPSC-ECs dall'incubatrice ed esaminare le cellule sotto il microscopio. Assicurarsi che hiPSC-ECs sono 80 – 100% confluenti e hanno una morfologia tipica di CE-come.</li>
	<li>Trasferire il pallone nel cofano cultura cellulare.</li>
	<li>Aspirare il mezzo dal pallone di hiPSC-ECs.</li>
	<li>Lavare brevemente la coltura delle cellule con l'aggiunta di 10 mL di PBS senza Ca2 +/Mg2 +. Aspirare il PBS.</li>
	<li>Aggiungere 4 mL per fiaschetta di enzima di dissociazione di 1x. Incubare per 5 min a temperatura ambiente (TA) (Figura 1B).</li>
	<li>Fermare la reazione di dissociazione aggiungendo 8 mL di terreno di Human Endothelial-SFM per fiaschetta. Delicatamente staccare e raccogliere la hiPSC-ECs in sospensione in una provetta conica da 15 mL utilizzando una pipetta da 5 mL.</li>
	<li>Contare il numero totale delle cellule in sospensione.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 300 x g per 3 minuti a TA.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in CE-SFM pieno a una concentrazione finale di 1.5 x 107 cellule/mL.</li>
	<li>Togliere la capsula di Petri con il biochip dall'incubatrice e trasferirlo alla cappa di cultura cellulare.</li>
	<li>Aspirare la soluzione di fibronectina da tutti i canali del chip microfluidici.</li>
	<li>Iniettare 6 µ l di sospensione cellulare in ogni canale utilizzando una pipetta con una punta piccola e 10 µ l (Figura 1, medio). Assicurarsi che la sospensione cellulare viene mescolata bene prima dell'iniezione ed evitare la precipitazione di cella.</li>
	<li>Esaminare il biochip sotto il microscopio e assicurarsi che le celle sono distribuite uniformemente, e la densità cellulare è alta (Figura 2).</li>
	<li>Incubare il biochip per 15 min a 37 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 40 µ l di CE-SFM pieno nei serbatoi medi da entrambi i lati di ogni canale.</li>
	<li>Incubare il biochip per 1h a 37 ° C (Figura 1, destra).</li>
	<li>Aggiungere un altro 50 µ l di CE-SFM pieno nei serbatoi da entrambi i lati di ogni canale.</li>
</ol>5. preparazione dei leucociti umani
Nota: Nel protocollo descritto qui, una linea cellulare monocytic commercialmente disponibile (THP-1) è stata utilizzata. In alternativa, possono essere utilizzati cellule mononucleari del sangue periferico o neutrofili. Isolamento dei monociti del sangue periferico e dei neutrofili può essere eseguita utilizzando la procedura standard11. Eseguire tutti i passaggi descritti in questo paragrafo in una cappa di cultura cellulare.
<ol><li>Raccogliere i leucociti in una provetta conica da 50 mL.</li>
	<li>Lavare i leucociti con 10 mL di PBS senza Ca2 +/Mg2 +. Centrifugare le cellule a 300 x g per 3 min a RT (Figura 1).</li>
	<li>Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS con tintura DiOC6 (λex = 485 nm, λem = 501 nm) (1:5, 000). Incubare le cellule al buio per 10 minuti a TA.</li>
	<li>Lavare i leucociti con 10 mL di PBS senza Ca2 +/Mg2 +. Centrifugare le cellule a 300 x g per 3 min a RT. Ripetere la fase di lavaggio ancora una volta.</li>
	<li>Contare il numero totale delle cellule in sospensione.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in terreno RPMI completo a una concentrazione finale di 2,5 x 106 cellule/mL.</li>
</ol>6. preparazione della pompa microfluidica
<ol><li>Montare la pompa di microfluidica con il collettore di 8 canali.</li>
	<li>Collegare la pompa ad un PC con il software di gestione installato.</li>
	<li>Avviare il software di microfluidica e caricare il protocollo cliccando Open Protocol e navigare sul PC per selezionare il protocollo di microfluidica.</li>
	<li>Collegare la pompa e il software selezionando la cartella di installazione e facendo clic su Esegui analisi passo.</li>
	<li>Per definire la geometria dei canali per il controllo della corretta portata: selezionare la Geometria di aggiornamento nella cartella di Installazione di geometria e fare clic su Esegui analisi passo. Nota: Assicurarsi che i dettagli di geometria corrispondano la siringa e canali da utilizzare (geometria ID = 1, numero di canali = 8, larghezza del canale = 800.0 µm, profondità del canale = 120.0 µm, volume della siringa = 250 µ l) e la viscosità del campione (viscosità del liquido = 1.0).</li>
	<li>Lavare la pompa inserendo il cavo di ingresso (arancione) nella provetta conica 50 mL contenente etanolo di 80%. Posizionare il cavo di uscita (verde) nel tubo vuoto conica 50 mL (contenitore per rifiuti).</li>
	<li>Selezionare la cartella di Washout di Washout/pompa e fare clic su Esegui analisi passo (lavare volume = 2000 µ l, passaggio di volume di lavaggio = 250 µ l, direzione di Washout = Output). Ripetere ancora una volta la fase di lavaggio.</li>
	<li>Ripetere la pompa lavaggio passaggi (6.6-6.7) con acqua di grado di coltura delle cellule e terreno di coltura umana Endothelial-SFM.</li>
	<li>Continuare con la fase di lavaggio del collettore.</li>
	<li>Aprire manualmente la valvola tra la siringa e il collettore inserendo l'adattatore 3VIE nella posizione corretta (indicatore OFF è girata a sinistra).</li>
	<li>Selezionare Set Current Channel/Apri passo nella cartella Colori attenuati con collettore Wash e fare clic su Esegui analisi passo per aprire tutte le valvole del gruppo manometrico.</li>
	<li>Lavare il collettore manualmente premendo 5 mL di etanolo 80% dalla siringa, seguita da 5 mL di acqua di grado di cultura cellulare.</li>
	<li>Lavare il collettore premendo 5 mL di terreno di coltura umana Endothelial-SFM dalla siringa.</li>
	<li>Rimuovere tutte le bolle di aria di grandi dimensioni che sono intrappolate nel collettore. Per effettuare questa operazione, inserire l'adattatore di pin di 8 pozzetti i 10 cm di Petri con il mezzo ed eseguire spingere/tirare con la siringa fino a quando tutte le bolle d'aria grandi sono andate (piccole bolle non sono un problema).</li>
	<li>Selezionare Set Current Channel/chiusura passaggio nella cartella Colori attenuati con collettore Wash e fare clic su Esegui analisi passo per chiudere tutte le valvole del gruppo manometrico.</li>
	<li>Collegare il cavo di uscita verde dalla pompa alla scheda di collettore.</li>
	<li>La valvola a 3 vie tornare sulla posizione OFF per chiudere la siringa.</li>
	<li>Selezionare cartella di Washout di Washout (via cavo) e fare clic su Eseguire analisi passo per lavare ogni porta con medium RPMI individualmente, assicurando che tutte le bolle vengono rimossi da ogni cavo (erogazione volume = 100 µ l). Nota: Ogni valvola del collettore è aperto uno-ad-uno, mentre gli altri canali chiusi, 1 a 8 e 100 μL del mezzo viene erogata attraverso ogni singolo canale. Assicurarsi che il liquido viene eseguito da ogni pin. Se non c'è nessun liquido che esce, è un'indicazione di una bolla d'aria o uno zoccolo.</li>
</ol>7. preparazione del Chip microfluidici per Live Imaging
<ol><li>Assicurarsi che le configurazioni di microfluidica sono pronte e la camera dal vivo di formazione immagine è pre-equilibrata a 37 ° C e il livello di CO2 raggiunge il 5% (Figura 3A, B).</li>
	<li>Prendere il biochip dall'incubatrice e posizionarlo sul supporto di chip di microscopio. Montare il supporto di chip sul microscopio imaging fase (Figura 3).</li>
	<li>Al fine di collegare il biochip alla pompa tramite il collettore, posizionare l'adattatore 8 pin vicino i bacini di uscita del chip e approfondire tutti i perni nel medium (ma non collegare completamente).</li>
	<li>Selezionare l'interruzione di | Connettersi a Chip cartella e fare clic su Esegui analisi passo per erogare medium RPMI prima di collegare il chip (erogazione volume = 30 mL). Una volta che il mezzo viene erogato, inserire l'adattatore 8 pin nella presa del biochip. Nota: Durante questo passaggio, tutti i canali sono impostati su (Apri) e 30 µ l del mezzo viene erogata attraverso ogni canale e a seguire i canali sono impostati su Off (chiuso). Questo garantisce che nessun aria bolle saranno introdotti nei canali del chip microfluidici.</li>
	<li>Manualmente e aspirare il mezzo da tutti i serbatoi di ingresso del biochip con una pipetta.</li>
	<li>Selezionare l'interruzione di | Washout di chip cartella e fare clic su Esegui analisi passo per irrorare 40 mL di mezzo di CE-SFM pieno attraverso ognuno dei canali-uno per sbarazzarsi dei morti cellule/detriti dal canale (volume di Washout = 40 µ l, taglio di washout di massimo = 40 dynes/cm2).</li>
</ol>8. flusso di analisi di adesione e acquisizione immagini
<ol><li>Manualmente e aspirare il mezzo dal bacino dell'ingresso del canale di interesse con una pipetta.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di leucociti da passo 5.6 al serbatoio di ingresso del canale di interesse. Nota: Mescolare delicatamente le cellule per fare una sospensione unicellulare.</li>
	<li>Nell'analisi della cella | Passaggio Descrizione cartella, selezionare Descrizione Set Current Channel/passo e, nell'elenco dei canali, selezionare solo il canale corrente di interesse e impostato su On (aperta) e impostare tutti gli altri sette canali Off (chiuso).</li>
	<li>Selezionare l'analisi delle cellule di | Passaggio Descrizione cartella e fare clic su Esegui analisi passo. Nota: Assicurarsi che l'Erogazione di tasso di flusso variabile applicata costante pressione negativa per tirare la sospensione del leucocita del serbatoio di aspirazione attraverso il canale per 5 min (insieme di taglio = costante, Shear stress =-0,50 dyne/cm2, durata = 00:05:00, Ritardo Scan = 00:00:00). Il valore negativo di sollecitazione di taglio garantisce la corretta direzione del flusso.</li>
	<li>Aspirare i leucociti rimanenti dal bacino dell'ingresso.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di terreno RPMI completo il serbatoio di aspirazione. Selezionare cella analisi/passo Descrizione cartella e fare clic su Eseguire analisi passo per irrorare il canale per 5 min con medium RPMI al fine di lavare tutti i leucociti non aderenti (insieme di taglio = costante, Shear stress =-0,50 dyne/cm2, durata = 00:05 00, ritardo di scansione = 00:00:00).</li>
	<li>Acquisire immagini da almeno tre o quattro diverse posizioni del canale all'immagine i leucociti aderiti (per assicurare che sono acquisite in aree rappresentative).</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 8.1 – 8,7 per la valutazione funzionale di tutto il resto dei canali. Nota: È possibile eseguire contemporaneamente più canali. A tale scopo, aprire tutti i canali di interesse durante il passaggio 8.3. ed eseguire tutti i suddetti passaggi 8.4 –8.7 per più canali di interesse.</li>
</ol>9. completare il test e pulizia della pompa di microfluidica
<ol><li>Dopo aver completato l'esperimento, esportare e salvare tutte le immagini in formato RAW.</li>
	<li>Risparmiando i risultati, eseguire la pompa di microfluidica e il collettore di protocollo di pulizia.</li>
	<li>Per la pompa di microfluidica, eseguire prima la cartella di Washout/pompa Washout irrorando 4 mL di acqua di grado di cultura cellulare, seguita da 4 mL di 80% etanolo come descritto nei passaggi 6.6 – 6.7 a secco la pompa facendo girare l'aria per alcuni minuti.</li>
	<li>Al fine di pulire il collettore, è necessario eseguire il passaggio di Washout/collettore Wash con la siringa. La procedura per aprire la siringa e le valvole del collettore come descritto nella procedura 6.10 – 6,11 lavata prima con 80% di etanolo e successivo con acqua di grado di cultura cellulare. Asciugare il collettore spingendo l'aria tramite la siringa. Chiudere la valvola di siringa e le valvole del collettore come descritto nella procedura 6.10 e 6.15.</li>
</ol>10. conteggio dei leucociti aderenti
<ol><li>Scaricare e installare software14 dal http://cellprofiler.org di elaborazione delle immagini. Nota: Immagine di elaborazione in questo studio è stato effettuato utilizzando il software versione 2.1.1. Se si utilizza una versione più recente, la pipeline potrebbe richiedere minor adattamento.</li>
	<li>Scarica la pipeline Count_leukocytes.cpipe. Fare clic su File | Importazione | Pipeline di dal file e navigare sul PC per scegliere la pipeline Count_leukocytes.cpipe.</li>
	<li>Drag-and-drop una cartella con immagini RAW acquisite dei leucociti aderenti alla finestra elenco File nei moduli Input | Immagini sezione per l'analisi.</li>
	<li>Specificare le dimensioni tipiche dei leucociti via analisi moduli | IdentifyPrimaryObjects. Specificare il diametro minimo e massimo dei leucociti aderenti in pixel.</li>
	<li>Selezionare i criteri di filtro tramite moduli analisi | FilterObjects. Specificare l'area come minimo accettato di oggetti in pixel.</li>
	<li>Avviare l'analisi premendo sul pulsante Analyze images . Nota: Tutte le immagini RAW saranno trasformate, e i risultati verranno salvati in una cartella di destinazione predefinita. Il file di output Image.txt contiene i numeri dei leucociti aderenti in ogni immagine elaborata (ogni numero corrisponde ad una sola immagine, cioè, ogni campo di vista acquistata).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive la caratterizzazione del trattamento hiPSC-CE con stimoli pro-infiammatori, come TNFα, valutazione funzionale di adesione del leucocita hiPSC-ECS nell'analisi di flusso utilizzando live imaging e conteggio automatizzato dei leucociti aderenti.
Durante la notte stimolazione dei hiPSC-ECs con TNFα risultati nell'aspetto allungato che in genere indica un fenotipo pro-infiammatorio attivato in ECs. Durante la fase di ottimizzazione, espressione livelli di E-selettina, ICAM-1, VCAM-1 dovrebbero essere verificati da FACs7,8e la vena ombelicale umana primaria ECs (HUVECs) sono consigliabili da includere come controlli positivi.
Densità di semina e di dissociazione hiPSC-ECs ottimale dovrebbe essere raggiunto per realizzare un monostrato confluente senza formare grumi di cellule e zoccoli di canale. È fondamentale per risospendere davanti ai leucociti aspersione al fine di evitare la precipitazione di cella e mantenere una concentrazione costante quando Diluire ogni canale. Leucociti del sangue periferico umano, come i monociti e neutrofili possono essere utilizzati, o stabilito linee cellulare monocytic, come THP-1 o HL-60 potrebbe essere usato come alternativa.
Durante l'assemblaggio dell'apparato microfluidico e durante il dosaggio del flusso, è fondamentale per evitare bolle d'aria da essere intrappolati nella tubazione di microfluidica e canali come possono causare il distacco della hiPSC-ECs e/o leucociti aderenti. Interfaccia liquido--liquido o incorporazione dei passaggi aggiuntivi lavaggio durante la preparazione dell'installazione microfluidici potrebbe contribuire a evitare bolle d'aria.
È consigliabile che il protocollo è gestito da due operatori dove uno si prepara le celle e la seconda prepara il test di sistema e flusso di microfluidica. In questo modo ECs sono placcati in chip microfluidici entro un intervallo di tempo costante prima dell'elaborazione e migliora la precisione e la riproducibilità dei risultati. Inoltre, questo inoltre consente di impostare esperimenti accecati evitare distorsioni nei risultati.
Per il rilevamento di riuscito della cellula con pipeline di elaborazione delle immagini automatizzata, è importante per acquisire immagini a fuoco con un elevato rapporto segnale-rumore ed evitare autofluorescence di oggetti non specifici, come grumi di cellule. Di fondamentale importanza è la corretta specificazione dei limiti minimi e massimi delle dimensioni tipiche dei leucociti aderenti che devono essere identificati. Si possono stimare le dimensioni tipiche dei leucociti utilizzando uno strumento di misurazione di linea in ImageJ. Per esempio, nella nostra analisi, abbiamo utilizzato l'intervallo di pixel 9 – 15 che corrisponde alla dimensione fisica del µm 10.3 – 17,1 (Figura 4). Quando si utilizza un intervallo sbagliato, per esempio, 3 – 15 pixel (3.4 – 17,1 µm), un singolo leucocita è identificato non come una cella, ma piuttosto la sua sottoparti sono identificati come oggetti separati (Figura 4). Questo porta al falso numero di oggetti da identificare.
Molti oggetti di un'intensità bassa e più piccola superficie di leucociti possono essere rilevati utilizzando il metodo di Sogliatura adattiva fornito. Questo potrebbe prendere posto a causa di autofluorescenza o tutti gli altri segnali fluorescenti non specifici. Tuttavia, questi oggetti non specifici, se la loro zona è inferiore la zona tipica di un singolo del leucocita, possono essere filtrati mediante la definizione della superficie come minimo accettata (Figura 4).
Consente l'analisi di flusso descritto qui tipi di valutazione diretta di adesione del leucocita di un monostrato di CE, chiarire l'interazione di queste due cellule, ma non prendere in considerazione altri cell tipi, come i periciti che sono presentano nella parete vascolare e potrebbe anche partecipano alla regolazione del leucocita stravaso15. L'integrazione di un microambiente di cultura 3D con altri tipi di cellule potrebbe migliorare la rilevanza fisiologica del sistema. Nonostante queste limitazioni, il dosaggio di flusso per la valutazione delle risposte infiammatorie descritto qui fornisce uno strumento prezioso per la malattia e la caratterizzazione di base applicazioni di modellazione di hiPSC-ECs.

L'infiammazione svolge un ruolo fondamentale in molte patologie, tra cui cardiovascolari e patologie neurodegenerative, sepsi e risposte avverse al farmaco (ADR). Le cellule endoteliali (ECs) svolgono un ruolo essenziale nella regolazione della risposta infiammatoria attraverso l'induzione di pro-adesivo recettori, quali E-selectina, intercellulare di adesione molecule-1 (ICAM-1) e vascolare delle cellule adesione molecule-1 (VCAM-1) sulla loro superficie 1 , 2. ECs microvascolare in tessuti differenti sono noti per presentano eterogeneità nelle risposte infiammatorie3,4. Inoltre, il background genetico o certe condizioni genetiche potrebbero comportare le differenze nelle risposte infiammatorie tra individui; Pertanto è importante avere accesso a ECs da individui diversi. Più recentemente, umane pluripotenti indotte cellule staminali (hiPSCs)5, che possono essere derivate da praticamente qualsiasi individuo, sono stati indicati per servire come una fonte affidabile e rinnovabile di ECs6,7,8, 9. Pertanto, la valutazione delle risposte infiammatorie e reclutamento leucocitario in hiPSC-ECs è preziosa, non solo per la modellazione di alcune malattie genetiche, ma anche a fornire indicazioni della variabilità inter-individuale e da utilizzare come uno strumento per in futuro la medicina personalizzata.
Analisi di flusso forniscono uno strumento utile per studiare l'interazione leucocita-endoteliali. Advances in dispositivi microfluidici consente la riproduzione di condizioni di flusso del fluido fisiologico con un controllo preciso dei livelli di sollecitazione di taglio specifiche del letto vascolare. Live imaging consente il monitoraggio della cascata di eventi di acquisizione del leucocita, rotolamento, strisciando, adesione e trasmigrazione. Sono stati sviluppati diversi saggi di flusso per studiare l'interazione leucocita-endoteliali, tuttavia, utilizzano primaria ECs10,11,12,13. Qui, descriviamo in dettaglio il test per la valutazione di adesione del leucocita umano hiPSC-ECS sotto flusso fisiologico. In questa procedura, si descrivono condizioni ottimizzate di stimolazione hiPSC-CE con stimoli pro-infiammatori, come il fattore di necrosi tumorale alfa (TNFα), dissociazione, semina in un chip microfluidico con otto canali paralleli. Descriviamo un protocollo passo-passo per la perfusione di hiPSC-ECs con la sospensione di leucociti fluorescente contrassegnati nel chip microfluidici, cella immagini dal vivo e automatizzato di conteggio dei leucociti aderenti.
Questo protocollo è utile per la valutazione delle risposte infiammatorie in hiPSC-ECs in screening di stupefacenti, modellazione di malattia e medicina rigenerativa personalizzata.

<table><tbody><tr><td>Vena8 Endothelial+ biochip</td><td>Cellix Ltd</td><td>V8EP-800-120-02P10</td><td></td></tr><tr><td>Mirus Evo Nanopump</td><td>Cellix Ltd</td><td>MIRUS-EVO-PUMP</td><td>1 x pompa a siringa; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x kit di tubi; Alimentatore e cavi .</td></tr><tr><td>Collettore 8 canali MultiFlow8</td><td>Cellix Ltd</td><td>MIRUS-MULTIFLOW8</td><td></td></tr><tr><td>Scatola umidificata</td><td>Cellix Ltd</td><td>HUMID-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging a fluorescenza Leica AF6000</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di moltiplicazione elettronica ad accoppiamento di carica Fotocamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100</td><td></td></tr><tr><td>Cabina di sicurezza biologica/cappa a flusso laminare</td><td>Cleanair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUV</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Hitachi</td><td>himac-CT6EL</td><td></td></tr><tr><td>pipettatore portatile (P-10 (10 mL), P-200 (200 &; L), P-1000 (1.000 &micro; L)</td><td>Gilson international</td><td>4807 (10&micro; l), 4810 (200&micro; l), 4809 (1000&micro; l)</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sterile in plastica</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606180 (5ml), 607180 (10ml)</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>VWR/ Duran Group</td><td>391-0860</td><td></td></tr><tr><td>Palloni di coltura (75 cm2)</td><td>CELLSTAR</td><td>658,170</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga (15 mL)</td><td>CELLSTAR</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Gelatina da pelle suina, tipo A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina (plasma bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>Human Endothelial-SFM</td><td>Life Tecnologie</td><td>11111-044</td><td></td></tr><tr><td>VEGF umano 165 IS,</td><td>Miltenyi Biotec</td> di qualità premium <td>130-109-386</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2 umano,</td><td>Miltenyi Biotec</td> di qualità premium <td>130-093-842</td><td></td></tr><tr><td>Siero derivato dal plasma povero di piastrine, bovino</td><td>Biomedical Technologies</td><td>BT-214</td><td></td></tr><tr><td>TNF umano ricombinante-&alfa;</td><td>Tebu-bio</td><td>300-01A-A</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>Life Technologies</td><td>12563029</td><td></td></tr><tr><td>DiOC6(3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318426</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo (50 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina (5.000 U/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata</td><td>Life Technologies</td><td>15230-089</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>Merck</td><td>1.00983.2500</td><td></td></tr><tr><td>VCAM-1</td><td>R& Sistemi D</td><td>FAB5649P</td><td></td></tr><tr><td>E-Selectin</td><td>R& D systems</td><td>BBA21</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R& D systems</td><td>BBA20</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Versione software</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Cellrofiler</td><td>CellProfiler</td><td>2.1.1</td><td></td></tr><tr><td>VenaFluxAssay Software</td><td>Cellix Ltd</td><td>2.3.a</td><td></td></tr></tbody></table>

saggio di microfluidic per la valutazione di adesione del leucocita alle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hipsc-ecs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Le cellule endoteliali (ECs) sono essenziali per la regolazione delle risposte infiammatorie sia limitando o facilitare il reclutamento leucocitario in tessuti colpiti tramite una cascata ben caratterizzata dei recettori pro-adesivo che sono sovraregolati sul superficie di cellule leucocitarie al momento il grilletto infiammatoria. Le risposte infiammatorie differiscono tra gli individui nella popolazione e il background genetico può contribuire a queste differenze. Cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs) hanno dimostrate di essere una fonte affidabile di ECs (hiPSC-ECs), rappresentando così una fonte illimitata di cellule che catturano l'identità genetica ed eventuali varianti genetiche o mutazioni del donatore. hiPSC-ECs pertanto può essere utilizzato per modellare le risposte infiammatorie in cellule di donatore-specific. Le risposte infiammatorie possono essere modellate determinando l'adesione del leucocita hiPSC-ECS sotto flusso fisiologico. Questo protocollo dettagliato fornisce una descrizione dettagliata della messa a punto sperimentale e analisi dei dati per la valutazione delle risposte infiammatorie in hiPSC-ECs e l'analisi di adesione del leucocita sotto flusso fisiologico.

In primo luogo, la risposta di hiPSC-ECs alla stimolazione con agente pro-infiammatorio TNFα dovrebbero essere esaminati, come descritto in precedenza7. Trattamento di TNFα per 12 h innesca il upregulation di E-selectin con il picco a 6 h dopo l'inizio del trattamento. Inoltre, ICAM-1 è upregulated 6-12 h post-trattamento. Anche se non abbiamo osservato il upregulation previsto di VCAM-1, si osserva tipicamente in cellule endoteliali di vena ombelicale umana primaria (HUVECs). Abbiamo trovato il trattamento di TNFα (12 h) durante la notte per essere la più conveniente per l'analisi di adesione del leucocita.
Dissociazione hiPSC-ECs ottimale dovrebbe comportare una sospensione unicellulare gratuita dei cespi di cella. Figura 2 illustra la densità ottimale hiPSC-CE subito dopo l'iniezione. In genere, 15 minuti dopo l'iniezione, hiPSC-ECs fissare alla parte inferiore del canale e iniziare a diffondere (Figura 2D). 1 h dopo l'iniezione, hiPSC-ECs formano un monostrato ben diffuso lungo il canale e sarà pronto per iniziare l'analisi di flusso (Figura 2E).
Etichettatura dei leucociti con tracciante fluorescente è vantaggioso per fase immagini di contrasto in automatizzato quantificazione di immagine, in quanto facilita il passaggio di identificazione delle cellule, soprattutto perché i leucociti rispettano il monostrato di cellule endoteliali e spesso è difficile per software di distinguere diversi tipi di cellule.
Gratis software di elaborazione di immagini open source sono molto utile per la quantificazione automatizzata dei leucociti aderenti. La pipeline descritta nel protocollo qui è basata sull'identificazione di oggetto primario utilizzando Sogliatura adattiva delle immagini fluorescenti dei leucociti (Figura 4A). Filtraggio di oggetti basati su un'area minima inoltre identificati Filtra oggetti falsamente identificati, come detriti cellulari, autofluorescenza o qualsiasi altro non-specifico segnale fluorescente (Figura 4 C, D).
Un chip microfluidico con otto canali paralleli permette il confronto di due gruppi indipendenti, per esempio, ECs differenziati da hiPSCs indipendente, come donatori sani o pazienti con i disordini genetici. Ulteriori controlli, ad esempio ECs non trattata o pre-trattamento con un anticorpo blocco di ICAM-1 possono essere inclusi come ben10,11. Due o tre chip microfluidici possono essere elaborati in un momento. Per la robustezza delle conclusioni, si consiglia un minimo di tre esperimenti biologici indipendenti eseguite su giorni indipendente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig1.jpg"> Figura 1 : Preparazione di hiPSC-ECs e leucociti per il dosaggio di flusso. (A) pre-trattamento di hiPSC-ECs con lo stimolo pro-infiammatorio (TNFα). (B) rappresentazione schematica della dissociazione enzimatica hiPSC-ECs, centrifugazione e risospensione. (C) rappresentazione schematica di rivestimento dei canali (C, a sinistra), iniezione della sospensione hiPSC-CE (C, medio) e aggiunta di terreno di coltura dopo hiPSC-ECs allegato nel chip microfluidici di cella. (D) rappresentazione schematica della fase di lavaggio del leucocita, etichettatura con colorante fluorescente DiOC6 e risospensione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig2.jpg"> Figura 2 : Chip microfluidico con hiPSC-ECs. (A) Microfluidic chip un 10cm di Petri. (B) la camera umidificata utilizzata per l'incubazione. (C, D, E) Immagini rappresentative di hiPSC-ECs nella microfluidica canale 0 min (C), 15 min (D), 1 h (E) dopo l'iniezione. Barra della scala = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig3.jpg"> Figura 3 : Messa a punto sperimentale del dosaggio live cell imaging e del leucocita aspersione. (A, B) Foto (A) e schematica rappresentazione (B) dell'apparato sperimentale del dosaggio live cell imaging e flusso: pompa di microfluidica - microscopio fluorescente invertito con montato dal vivo imaging camera (5% CO2, 37 ° C, umidificare), (2) - (1), (3) - 8 canali collettore, (4) - PC per l'acquisizione di controllo e immagine di microscopio, (5) - PC per controllo pompa microfluidica. (C) Microfluidic chip con il tubo inserito del collettore 8 canali fissi in un portatarga e montato nella fase motorizzata del microscopio. (D) rappresentazione schematica delle fasi principali dell'analisi di flusso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig4.jpg"> Figura 4 : Analisi dell'immagine e il rilevamento automatico dei leucociti aderenti. (A) la finestra di dialogo del software con le impostazioni specificate per l'identificazione dei leucociti di elaborazione delle immagini. (B), la finestra di dialogo del software di elaborazione immagine con i filtri specificati criteri di oggetti identificati sulla base minimamente accettano superficie (SAmin = 70 px). (C) esempio di corretta identificazione dei leucociti e filtraggio di oggetti non specifici della piccola superficie (SA) (diametro tipico pixel (Min, Max) = (9, 15); Filtraggio criteri SAmin = 70 px). Oggetti accettati sono raffigurati in verde e oggetti di scarto sono raffigurati in viola. (D) esempio di errata identificazione dei leucociti a causa della non corretta gamma di diametro tipico (diametro tipico pixel (Min, Max) = (3, 15); Filtraggio criteri SAmin = 70 px). Oggetti accettati sono raffigurati in verde e oggetti di scarto sono raffigurati in viola. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo dettagliato fornisce una descrizione dettagliata della messa a punto sperimentale e analisi dei dati per la valutazione delle risposte infiammatorie in hiPSC-ECs e l'analisi di adesione del leucocita sotto flusso fisiologico.

Saggio di microfluidic per la valutazione di adesione del leucocita alle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle cellule staminali pluripotenti umane sulla funzionalità e le risposte infiammatorie delle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce una descrizione dettagliata della configurazione sperimentale e dell'analisi dei dati per la valutazione dell'adesione dei leucociti alle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Per il rivestimento di chip microfluidici, posizionare un biochip sterile in una piastra di Petri sterile di 10 centimetri e utilizzare una punta di pipetta da 10 microlitri per iniettare 10 microlitri di soluzione di lavoro di fibronectina appena preparata in ogni canale del biochip.Coprire la piastra di Petri e posizionare in una camera umidificata durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, preripidi il biochip in un incubatore Celsius di 37 gradi e riasspensi le cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo raccolte da una coltura cellulare confluente dell'80-100% alla concentrazione desiderata in un mezzo fresco privo di siero di cellule endoteliali. Successivamente, aspirare la soluzione di fibronectina da tutti i canali del chip microfluidico e mescolare accuratamente le cellule per ottenere una sospensione cellulare omogenea prima di utilizzare una punta di pipetta da 10 microlitri per iniettare sei microlitri di cellule in ogni canale.Esaminare il biochip al microscopio per confermare che le cellule sono distribuite uniformemente con un'alta densità cellulare. Dopo 15 minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere 40 microlitri di mezzo privo di siero di cellule endoteliali FULL nei serbatoi medi su entrambi i lati di ciascun canale. E riportare il biochip nell'incubatrice per un'ora.Quindi, aggiungere altri 50 microlitri di mezzo privo di siero di cellule endoteliali FULL nei serbatoi su entrambi i lati di ciascun canale. Per l'imaging dal vivo delle cellule sementi, confermare che le configurazioni microfluidiche sono pronte, che la camera di imaging dal vivo è equilibrata a 37 gradi Celsius e che il livello di CO2 ha raggiunto il 5%Posizionare il biochip nel supporto del chip del microscopio e montare il supporto del chip sullo stadio di imaging del microscopio. Per collegare il biochip alla pompa tramite il collettore, posizionare l'adattatore a otto pin vicino ai serbatoi di uscita del chip e approfondire tutti i perni nel mezzo senza collegare completamente i perni.Nel software della pompa microfluidico, selezionate Washout/Connect al chip e fate clic su Esegui passo saggio (Run Assay Step) per erogare 30 microlitri di mezzo RPMI attraverso ogni pin. Quindi inserire l'adattatore a otto pin nella presa del biochip. Utilizzare una pipetta per aspirare manualmente il mezzo da tutti i serbatoi di ingresso del biochip e selezionare Washout /Chip Washout e Run Assay Step per perfondere un canale alla volta con 40 microlitri di mezzo privo di siero di cellule endoteliali Full per rimuovere eventuali cellule morte e detriti.Quando tutti i canali sono stati lavati sostituire il mezzo dal serbatoio di ingresso del canale di interesse con 100 microlitri di leucociti umani diluiti a 2,5 per 10 alle sei cellule per concentrazione di millilitro nel mezzo RPMI. Fate clic su Descrizione test cella/passo (Cell Assay/Step description) e impostate la descrizione canale/passo corrente e impostate il canale di interesse su On e gli altri sette canali su Disattivato( Select Cell Assay Step description) e fate clic su Esegui passo saggio (Run Assay Step).Sostituire i leucociti rimanenti nel serbatoio di ingresso con 100 microlitri di mezzo RPMI completo. Quindi, fare clic su Descrizione del passo del saggio delle celle e eseguire il passo di dosaggio per perfondere il canale per cinque minuti con il supporto RPMI per rimuovere eventuali leucociti non diversi. Quindi acquisire immagini da almeno tre a quattro diverse posizioni nel canale per visualizzare i leucociti aderenti.Per quantificare i leucociti aderenti, aprire il software di elaborazione delle immagini CellProfiler e importare il file Count Leukocytes Pipeline. In Moduli di input selezionare Immagini e trascinare la cartella con le immagini non elaborati dei leucociti aderenti alla finestra dell'elenco File. In Moduli di analisi selezionare Identifica oggetti primari e indicare i diametri minimi e massimi dei leucociti aderenti in pixel.In Moduli di analisi selezionare FilterObjects. Quindi selezionare i criteri di filtro e immettere l'area minimamente accettata degli oggetti in pixel e fare clic su Analizza immagini per iniziare l'analisi. La dissociazione ottimale delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo dovrebbe comportare una sospensione di una singola cellula priva di grumi cellulari.In genere, 15 minuti dopo l'iniezione le cellule endoteliali si attaccano alla parte inferiore del canale e iniziano a diffondersi. Entro un'ora dall'iniezione le cellule endoteliali dovrebbero formare un monostrato ben diffuso attraverso il canale a quel punto sono pronte per l'uso nel saggio flow. L'utilizzo del software di elaborazione delle immagini open source gratuito come dimostrato consente il filtraggio di oggetti identificati in base a un'area minima e l'esclusione di oggetti falsamente identificati come detriti cellulari, autofluorescenza o qualsiasi altro segnale fluorescente non specifico.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare la stimolazione con citochine pro-infiammatorie e di includere le cellule endoteliali della vena ombelicale umana primaria come controllo positivo. Non dimenticare che lavorare con le linee cellulari e cellulari dei mammiferi primari può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come indossare cappotto da laboratorio, guanti e protezione degli occhi dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

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Impara un saggio microfluidico per valutare l'adesione dei leucociti alle cellule endoteliali derivate da hiPSC. Questo metodo consente di studiare le risposte infiammatorie in tempo reale con imaging live.

Saggio di microfluidic per la valutazione di adesione del leucocita alle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-ECs) (Video) | JoVE Journal

Saggio di microfluidic per la valutazione di adesione del leucocita alle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-ECs)

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