In Vivo Mirati espressione delle proteine di optogenetica utilizzando seta/AAV film

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze dei sistemi. Come come l'attività degli insiemi neuronali supporta l'elaborazione sensoriale e cognitiva nel cervello. Il principale vantaggio di questa tecnica è che facilita il targeting accurato di proteine optogenetiche come la rodopsina Chan e la GCaMP alle regioni cerebrali di interesse, senza richiedere una procedura di iniezione del virus separata.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, in quanto la deposizione di seta e virus a piccoli impianti ottici può richiedere una certa pratica per ottenere risultati riproducibili. In primo luogo, mescolare l'AAV scongelato e la fibroina di seta acquosa da cinque a sette punti in un rapporto uno a uno in un tubo PCR da 200 microliter. Pipettare delicatamente la soluzione in uscita e uscire più volte per mescolare accuratamente l'AAV e la fibroina.

Per depositare la seta / AAV, caricare una pipetta di iniezione con la quantità di soluzione necessaria per il numero di impianti in fibra realizzati, più circa il 30% in più per adattarsi alle perdite dovute all'intasamento delle pipette. Successivamente, montare un portaferrule in un apparato stereotassico dotato di un microiniettore. Posizionare il portaregola sopra il microiniettore e applicare la miscela seta/AAV dal basso.

Manovra la pipetta di iniezione fino a quando non tocca o quasi tocca il centro della superficie della fibra ottica ed espelle da 10 a 20 nanolitri di seta / soluzione AAV. Quindi, ritira la pipetta. Successivamente, osserva il bolo di seta / AAV sulla superficie piana che appare come una cupola liquida che si asciuga a un film piatto entro circa un minuto.

Ripetere i passaggi precedenti fino a depositare la quantità desiderata di seta / AAV. Quando si preparano più impianti, applicare la soluzione seta / AAV su un impianto e quindi passare a rivestire altri impianti, prima di tornare al primo. Dopo un'ora di asciugatura, posizionare l'intero portaferrule in una camera a vuoto e essiccare sottovuoto durante la notte a circa 125 torr e quattro gradi Celsius.

Il giorno seguente, valuta la forma e la posizione del film di seta risultante al microscopio ad alta potenza. Assicurarsi che le pellicole siano confinate alla punta della superficie della fibra ottica, relativamente sottili e simmetriche. Per il rivestimento di fibre ottiche affusolata, posizionare la pipetta di iniezione seta/AAV sul lato della fibra ottica all'inizio della conio, assicurandosi che la pipetta tocchi la fibra ottica.

Espellere 20 nanolitri di seta /AAV per avviare il processo di rivestimento, assicurando che la goccia aderisca alla fibra ottica e rimanga all'interfaccia della fibra e della pipetta. Assorbire delicatamente la goccia verso l'estremità della punta della fibra mentre la seta / AAV si asciuga e mantenere la pipetta di iniezione a contatto con la goccia di essiccazione per evitare di intasare la punta della pipetta. Quando il primo bolo si è quasi completamente asciugato, espellere altri 20 nanolitri e continuare a assorbire la goccia lungo il cono.

Ripetere il passaggio precedente espellendo piccole quantità di seta / AAV e asciugando gradualmente la soluzione sul lato del cono. Dopo l'asciugatura, valutare la forma e la posizione del film di seta risultante al microscopio ad alta potenza. Per il rivestimento degli impianti dell'obiettivo GRIN, depositare seta / AAV in una singola iniezione su un impianto di lenti GRIN.

Dopo l'asciugatura, valutare la forma e la posizione del film di seta risultante al microscopio ad alta potenza per assicurarsi che il film copra la superficie dell'obiettivo. Per il rivestimento di finestre cranici in vetro, pipettare a mano una goccia di seta /AAV a cinque microlitri sulla superficie di uno scivolo di copertura rotonda di tre millimetri in modo che la goccia si diffonda per coprire l'intera superficie del vetro. Dopo l'essiccazione, conservare le fibre ottiche rivestite in seta /AAV in un essiccatore sottovuoto raffreddato a 125 torr e quattro gradi Celsius prima di impiantare i dispositivi.

Le immagini a fluorescenza delle proteine optogenetiche taggate al fluoroforo fornivano una misura dell'estensione dell'espressione delle pellicole di seta / AAV, e le tipiche fibre ottiche possono facilmente ospitare 200 nanolitri di seta / AAV. Con la pratica, gli sperimentatori possono ottenere un'espressione altamente affidabile intorno alla punta delle fibre impiantate. Due possibili problemi con le finestre cranici rivestite sono espressione insufficiente e pellicole di seta che non riescono a dissolversi e oscurano il campo visivo.

Per aumentare l'espressione, è possibile eseguire una durectomia prima di impiantare la finestra e /o aumentare la quantità di virus nel film. La migliore espressione è stata ottenuta utilizzando rispettivamente una miscela da uno a quattro di seta e AAV stock-titer. La quantità di seta nelle finestre rivestite è da 10 a 100 volte superiore rispetto agli impianti in fibra, e il film è meno incorporato nei tessuti, e quindi potrebbe non essere esposto agli stessi livelli di attività proteolitica che possono sciogliere le pellicole di seta.

Tuttavia, la presenza di un po 'di seta è essenziale per raggiungere la tua espressione sotto le finestre, probabilmente perché un film fatto di virus da solo viene lavato via dal liquido interstiziale durante l'intervento chirurgico. Durante il tentativo di questa procedura, è importante preparare e conservare impianti rivestiti di seta nel modo che descriviamo. Una conservazione impropria può cambiare le proprietà delle pellicole di seta o diminuire l'efficacia dei vettori di espressione virale.

Questa tecnica può essere di grande utilità per i ricercatori nel campo delle neuroscienze dei sistemi per esplorare come l'attività neurale guida l'elaborazione sensoriale e cognitiva nel cervello di mammiferi come topi, ratti o persino primati non umani. Non dimenticare che lavorare con vettori di espressione virale può essere pericoloso e i dispositivi di protezione individuale, come guanti, occhiali e cappotti da laboratorio, dovrebbero sempre essere indossati mentre si lavora con il virus associato ad Adeno.