Name: Un approccio imparziale di campionamento TEM sezioni in neuroscienze (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Scopri un metodo di microscopia elettronica imparziale per l'analisi del tessuto cerebrale in neuroscienze. Questo protocollo automatizzato consente il campionamento casuale delle sinapsi con intervento minimo dell'utente.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il flusso di lavoro qui presentato consente al ricercatore di ottenere dati sulle caratteristiche ultrastrutturali in modo imparziale. Questo è molto meno tempo rispetto a indagini di volume da sezioni di serie. Varie applicazioni vengono utilizzate per raggiungere questo obiettivo. In un primo momento, il nostro software su misura di RPS (per dettagli sulla disponibilità, contattare l'autore corrispondente) viene utilizzato per introdurre una fase casuale-MAIUSC per selezionare le coordinate dell'area di campionamento. Questo consente un campionamento casuale uniforme sistematico del ROI. Successivamente, per il conteggio delle strutture specifiche, abbiamo adattato il metodo di disector, dove vengono confrontati 2 sezioni consecutive con distanza nota, in modo inedito rispetto a precedenti studi13,14,15 , come abbiamo usato il nostro software su misura di RPS per campionamento casuale uniforme sistematico. Ciò consente di risparmiare tempo rispetto a 3D-ricostruire interi volumi da sezioni di serie. Il software su misura di RPS è progettato appositamente per un tipo di microscopio, che è un fattore limitante per la riproduzione del flusso di lavoro. Un'alternativa da questo software specifico sarebbe un'applicazione che permette la creazione di script ed è compatibile con altri modelli di microscopio.
Abbiamo utilizzato con successo questo approccio per i nostri studi comparativi4,5. Ultra-sottili sezioni di tessuto neuronale, l'area di interesse è stata delineata e immagini sono state scattate da sistematici di campionamento casuali uniformi all'interno dell'area. Deve essere notato che l'area di interesse, lo strato polimorfo della circonvoluzione dentata, è una zona piuttosto piccola per indagare che potrebbe essere utile per il nostro approccio. All'interno di un disector posizionati in modo casuale, abbiamo valutato il numero di DCV e diverse caratteristiche ultrastrutturali delle sinapsi in DGpl di topi adulti ospitato in SE ed EE nonché adulto WT topi contro adulti topi knockout NPY. Utilizzando il nostro approccio, i dati raccolti hanno mostrato i cambiamenti in alcuni dei parametri studiati. Questi risultati hanno confermato quelli di altri studi simili in animali giovani2.
Uno svantaggio dell'uso sperimentale di questo flusso di lavoro potrebbe essere che questo approccio multi-applicazione non è l'ideale in termini di facilità d'uso, come gli utenti hanno bisogno ottenere confortevole con diverse interfacce di utente (nel nostro caso, l'interfaccia utente, sezione seriale TEM il software RPS e SerialEM). Imparare a gestire tutte le applicazioni in modo efficiente richiede tempo e dovrebbero essere presi in considerazione. Tuttavia, investendo il tempo ad imparare a utilizzare questo flusso di lavoro è ancora chiaramente favorevole nel corso del tempo che è necessario analizzare interi volumi con sezione di serie TEM. Il metodo di usare un disector posizionato di campionamento casuale uniforme sistematico nella zona di interesse è sufficiente presentare dati affidabili1 senza la necessità di indagare una quantità elevata di sezioni/volume.
Per massimizzare il risultato nei nostri studi, era fondamentale prendersi cura durante la preparazione del campione, come la conservazione del tessuto e le strutture non è solo fondamentale per valutare le caratteristiche strutturali, ma anche per identificare la zona di interesse senza ambiguità. Un fattore fondamentale e forse un altro svantaggio di questo metodo, è che un'alta qualità delle coppie ultra-sottili sezioni è necessario: non ci deve essere nessun fori o rughe che coprono la zona sotto inchiesta in entrambe le parti, e lo spessore di sezione deve essere mantenuta omogenea. Il ricercatore deve essere ben addestrato in ultramicrotomia. Cura deve anche essere presa quando le sezioni in TEM, di imaging, come le sezioni sono sensibili ai danni del fascio di elettroni e possono lacerare facilmente. Inoltre, è importante scegliere il giusto numero di aree di campionamento nel ROI. A seconda l'obiettivo sperimentale, l'ingrandimento dei micrografi elettronici deve essere impostata accuratamente. Per i nostri esperimenti specificamente, contiamo le sinapsi nel sistema nervoso centrale, 20 aree di interesse su una sezione con l'area di 30.25 µm2 sono ottimali. Si consiglia di formare il personale anche nel riconoscere le caratteristiche in questione (nel nostro case sinapsi, funzionalità sinaptica e DCV) per ottenere risultati affidabili. Al fine di identificare le sinapsi, le vescicole sinaptiche devono essere identificabili e ciò richiede una risoluzione di almeno 10 nm. Per questo, un ingrandimento di 5000 X era ottimo, ma deve essere notato che l'ingrandimento dipende da parametri hardware quali il tipo e la posizione delle telecamere e avrebbe bisogno di essere adattato per altri tipi di microscopio e/o videocamera. Ha inoltre deve essere notato che il protocollo utilizza applicazioni specifiche per un TEM e che gli utenti con altri modelli dovranno considerare le differenze nell'impostazione.
Crediamo che il nostro flusso di lavoro può essere adattato per molte altre applicazioni non solo nell'ambito delle neuroscienze, ma in un ampio campo di scienza biologica e anche scienza dei materiali (quando è necessaria l'alta risoluzione di un TEM) ogni volta che la domanda di ricerca richiede una sistematica uniforme campionamento casuale e la quantità di campioni da esaminare chiede un modo efficiente di tempo di analisi. Ad esempio, siamo attualmente interessati nella localizzazione di depositi di ferro nel cervello umano. Per questo, recentemente abbiamo adattato il nostro flusso di lavoro, per consentire analisi elementare sulle sezioni ultrasottili in aree selezionate in modo casuale. Al fine di ridurre al minimo il numero di applicazioni che sono necessari per il flusso di lavoro, abbiamo mirato a applicare utilizzando il software di SerialEM solo, perché può essere programmato per spostare la fase di pre-impostare punti che possono essere selezionati in modo casuale. Abbiamo creato script personalizzati per controllare il TEM, con l'obiettivo di automatizzando il flusso di lavoro interamente. Ciò è risultato fattibile tranne che per la messa a fuoco automatica in modalità di imaging filtrata, che non ha dato risultati soddisfacenti. Abbiamo quindi utilizzato software di DM per messa a fuoco e per ottenere le immagini di energia-filtrata.
In sintesi, vi presentiamo soluzioni software che aiutano ad ottenere i micrografi elettronici in modo imparziale.

In microscopia elettronica, spesso risulta difficile a campione rappresentative regioni all'interno delle sezioni. Ci, come osservatore, sono spesso distorte a guardare la pagina di specifiche regioni disegnate alla nostra attenzione da cospicue caratteristiche del campione, impedendo un campionamento ben distribuito, imparziale. Bias di campionamento può essere evitato solo se ogni parte della regione di interesse ottiene la stessa probabilità di finire in un Micrografo elettronico1. È possibile evitare bias di campionamento senza una soluzione software, ad esempio, premendo la trackball del microscopio manualmente senza guardare l'immagine, in modo da selezionare le regioni di campionamento ovunque la fase si arresta. Ma non si tratta propriamente di una procedura casuale, perché, consciamente o inconsciamente, l'utente può avere un'influenza sul movimento del palco, e, inoltre, questo non è un modo sofisticato di selezionare le regioni di campionamento. Campionamento casuale diventa particolarmente importante se vengono utilizzate coppie di sezioni per valutare il numero di strutture in un certo volume, ad esempio, per stereology1, che richiede coppie di sezioni, una distanza nota apart. Sarebbe anche possibile guardare solo a una singola sezione e stimare il numero di strutture specifiche2, ma con questo approccio gli investigatori tendono a sovrastimare la densità numerica di strutture più grandi, a meno che le strutture sono molto piccole in confronto allo spessore della sezione. Approcci alternativi sono a ricostruire volumi di tessuto da sezioni di serie e quindi ottenere i dati desiderati3. Questo però richiede molto tempo e non un approccio fattibile per studi comparativi (più grandi).
Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro che consente al ricercatore di selezionare automaticamente i campioni per ottenere i micrografi elettronici a spaziatura regolare all'interno delle sezioni ultrasottili. La posizione dei micrografi elettronici è casuale, permettendo di campionamento imparziale. L'approccio è adatto sia per determinazione densità numerica di strutture (ad esempio, sinapsi all'interno di un certo neuropil volume4,5) e le dimensioni delle caratteristiche strutturali (ad esempio, la larghezza della fessura sinaptica, o il diametro delle densità postsinaptica4,5).
Il flusso di lavoro utilizza un punto casuale su misura (RPS) software (scritto in Java script utilizzando script software fornito con il nostro microscopio) che calcola automaticamente le posizioni in griglia all'interno di una zona predefinita di interesse in una sezione ultrasottile di campionamento. Il software RPS si muove la fase del microscopio elettronico questi punti predefiniti, affinché un Micrografo elettronico può essere fatta in ogni punto. In primo luogo, l'utente definisce un'area di interesse all'interno della sezione sottile. Successivamente, il software RPS calcola posizioni in griglia all'interno di questa regione. X / y coordinate della prima posizione vengono create in modo casuale, e le restanti posizioni sono collocate a intervalli regolari griglia rispetto alla prima posizione. Perché ogni parte della regione di interesse ha la stessa probabilità di essere esaminati, questo consente la raccolta minima dei dati. Questo approccio di campionamento viene anche chiamato sistematici di campionamento casuali uniformi (vedi riferimenti6,7 per maggiori dettagli).
Per determinare la densità numerica delle strutture, lavoriamo con coppie di sezioni che sono una distanza conosciuta. Dopo aver ottenuto un Micrografo elettronico della prima sezione in una delle posizioni predeterminate, TEM seriale sezione software (parte del pacchetto software fornito con il nostro microscopio elettronico) si muove il punto corrispondente nella seconda sezione, al fine di ottenere un Micrografo elettronico di posizione corrispondente. Questo si ripete per ogni posizione nella griglia predeterminata. Nel nostro approccio, un disector è usato per contare il numero di particelle in ogni coppia di micrografi elettronici8,9. Un disector è costituito da una coppia di conteggio frame, uno per ogni sezione8,9. La densità numerica degli oggetti è determinata contando solo gli oggetti visibili sulla prima sezione (o sezione di riferimento), ma non sulla seconda sezione (o sezione ricerca). Questo permette di valutare la densità numerica degli oggetti in un modo rapido ed efficiente8,9. Inoltre sulle singole sezioni, caratteristiche strutturali bidimensionale possono essere misurate.
Abbiamo applicato questo flusso di lavoro con successo per valutare le differenze nel numero di sinapsi nell'ippocampo di topi esposti ad ambiente arricchito (EE) rispetto al ambiente standard (SE) alloggiamento condizioni4,5, condizioni abitative e anche per valutare le differenze ultrastrutturali tra topi wild type (WT) e il neuropeptide Y (NPY) KO topi tenuti sotto SE ed EE5. Il nostro obiettivo era di guardare specificamente alle caratteristiche strutturali dei neuroni, come ad esempio la densità sinaptica numerica, le lunghezze della zona attiva in sezioni trasversali e di densità postsinaptica, la larghezza della fessura sinaptica e il numero di vescicole sinaptiche, al fine di valutare i cambiamenti nella connettività di un neurone e attivazione tra diverse condizioni sperimentali. Inoltre, eravamo interessati alla densità numerica delle vescicole denso-centro (DCV) nei neuroni per determinare la quantità di neuropeptidi stored in una certa area del cervello.
Sulla base del successo del nostro approccio per gli studi descritti sopra, nel nostro prossimo passo, abbiamo adattato il nostro flusso di lavoro per selezionare aree per imparziale analisi elementale all'interno di campioni di cervello umano. Questo è stato fatto a immagine di ferro, che viene memorizzato in molecole di ferritina in sia i neuroni e cellule gliali. Per questo, abbiamo compilato un script che ci ha permesso di automatizzare la maggior parte delle operazioni per un processo di selezione casuale delle sezioni di cervello in un'area definita.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>SigmaAldrich</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td>1kg</td></tr><tr><td>Glutardialdeide</td><td>Servizi scientifici</td><td>E 16210</td><td>25%; 100ml; </td></tr><tr><td>tampone cacodilato</td> di grado EM <td>Merck</td><td>C4945</td><td>250g; Acido dimetilarsinico triidrato di sodio</td></tr><tr><td>Acetato di tionina/Ceristaina</td><td>Merck</td><td>861340</td><td></td></tr> acido <tr><td>acetico</td><td>Merck</td><td>1000631000</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Merck</td><td>1064951000</td><td>1 kg, pellet</td></tr><tr><td>tetraossido di osmio</td> Servizi <td>scientifici</td><td>E 19110</td><td>10x1g</td></tr><tr><td>Resina da inclusione TAAB</td><td>Servizi scientifici</td><td>TAT001</td><td>500g</td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Science Services</td><td>TAD024</td><td>100g</td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Science Services</td><td>TAD025</td><td>500g</td></tr><tr><td>Acetato di uranile diidrato</td><td>Plano GmbH</td><td>19481</td><td>impoverito, 25g</td></tr><tr><td>Ultrastain 2</td><td>Leica</td><td>16707235</td><td>Citrato di piombo</td></tr><tr><td>Soluzione blu di toluidina</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1727</td><td>10g</td></tr><tr><td>Pioloform</td><td>Plano GmbH</td><td>R1275</td><td>10g Polvere</td></tr><tr><td>Proylenoxide</td><td>SigmaAldrich</td><td>82320-1L</td><td>1L</td></tr><tr><td>DPX terreno di inclusione</td><td>Plano GmbH</td><td>R1320</td><td>terreno di inclusione per sezioni semisottili su vetrino, 50 ml</td></tr><tr><td>Vibratome, Leica VT 1000</td><td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Ultracut UCT, ultramicrotom</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 20</td><td>FEI,Eindhoven, Paesi Bassi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera grandangolare Megaview</td><td>Soluzione di imaging morbido Olympus, M&uuml; nster, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stati Uniti 1000 fotocamera digitale</td><td>Gatan, Pleasanton, Stati Uniti d'America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Imaging Analysis Software</td><td>FEI, Eindhoven, Paesi Bassi</td><td></td><td></td>,</tr><tr><td>FEI Sezione seriale Software</td><td>FEI, Eindhoven, Paesi Bassi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Figi, ImageJ 1.52e</td><td>National Institute of Health, Stati Uniti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPSS 20.0</td><td>SPSS Inc., Chicago, IL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SerialEM</td><td>Regents dell'Università del Colorado</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPS (campionamento casuale di punti) software 0.9a</td><td>su misura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disector v1.0.2 (ImageJ macro)</td><td>su misura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EFTEMSerialEM (script SerialEM)</td><td>su misura</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un approccio imparziale di campionamento tem sezioni in neuroscienze

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Le indagini delle caratteristiche ultrastrutturali dei neuroni e le sinapsi sono possibili solo con microscopia elettronica. Soprattutto per gli studi comparativi dei cambiamenti nella densità e distribuzioni di tali caratteristiche, un protocollo di campionamento imparziale è fondamentale per ottenere risultati affidabili. Qui, presentiamo un flusso di lavoro per l'acquisizione di immagini di campioni del cervello. Il flusso di lavoro consente di sistematici di campionamento casuali uniformi all'interno di una regione definita del cervello, e le immagini possono essere analizzate usando un disector. Questa tecnica è molto più veloce di un esame approfondito delle sezioni di serie ma ancora presenta un approccio fattibile per stimare la densità e le distribuzioni delle caratteristiche ultrastruttura. Prima di incorporare, macchiato vibratome sezioni sono state usate come riferimento per identificare la regione del cervello sotto inchiesta, che ha contribuito a velocizzare la preparazione del campione globale di processo. Questo approccio è stato utilizzato per studi comparativi che studia l'effetto di un ambiente arricchito-alloggiamento su parecchi parametri ultrastrutturali nel cervello del topo. Basato sul riuscito uso del flusso di lavoro, abbiamo adattato ai fini dell'analisi elementare dei campioni del cervello. Abbiamo ottimizzato il protocollo in termini di tempo di interazione dell'utente. Automatizzare tutti i passaggi che richiede tempo di compilazione di uno script per il software open source SerialEM aiuta l'utente a concentrarsi sul lavoro principale di acquisire le mappe elementali. Come il flusso di lavoro originale, abbiamo prestato attenzione all'approccio imparziale campionamento per garantire risultati affidabili.

Qui, descriviamo un flusso di lavoro per selezionare le aree per TEM in maniera automatica e imparziale. L'utente seleziona l'area di interesse all'interno di una sezione ultra-sottile sotto il TEM e utilizza diverse soluzioni software per il flusso di lavoro compreso il nostro software RPS che calcola automaticamente le coordinate di 20 aree di campionamento all'interno dell'area di interesse. Quindi, la fase TEM viene spostata per ogni area di campionamento per la fotografia. Questo è possibile sia per l'analisi di singole sezioni e per analizzare coppie di sezioni, una distanza nota a parte, che permette di selezionare aree per l'imaging senza pregiudizi dell'investigatore.
Questo flusso di lavoro si è rivelato prezioso quando documentare le caratteristiche ultrastrutturali in mouse cervello sezioni4,5. In questi studi, lo strato di cellule polimorfo della circonvoluzione dentata (DGpl) è stato esaminato come un'area di interesse. Il nostro metodo si è rivelato adatto per l'esame della DG, perché una sezione coronale della DG dorsale (Bregma −1.3) si inserisce in una sezione ultrasottile e i contorni sono riconosciuti prontamente a basso ingrandimento. Se altre regioni del cervello erano per essere esaminato, sarebbe importante verificare le loro dimensioni e caratteristiche distintive prima di pianificare gli esperimenti.
L'applicazione del flusso di lavoro descritto qui ha mostrato che EE custodia aumenta la larghezza della fessura sinaptica significativamente in DGpl4, rispetto alle condizioni standard di alloggio. Inoltre, il numero delle vescicole nucleo denso è stato diminuito significativamente in animali stabulati in EE4, che indica i cambiamenti nella famiglia dei neuropeptidi. Quando topi WT e NPY erano tenuti in condizioni di EE, il numero di neuroni/µm³ alla DGpl aumentato mentre la densità di DCV è diminuito rispetto al SE-alloggiamento5. Al contrario, knockout NPY ha provocato un aumento significativo delle vescicole sinaptiche nel pool di riserva (vescicole sinaptiche non ancorate) indipendente di alloggiamento condizioni5. L'effetto dell'EE sulla larghezza della fessura sinaptica è stato invertito nel gruppo NPY KO conseguente una differenza significativa tra EE-ospitato WT e NPY KO topi5. Preso insieme a studi comportamentali di WT e NPY knockout animali detenuti sotto entrambi i tipi di condizioni di alloggio, questo indica un ruolo cruciale di NPY per gli effetti neurobiologici della EE5.
Per visualizzare il ferro immagazzinato nel cervello umano, uno script è stato compilato per SerialEM software di scegliere in modo casuale i punti di acquisizione all'interno di una sezione tutta ultrasottile, con lo scopo di ottenere un'energia filtrata Micrografo elettronico in ciascuno di questi punti . Dopo aver caricato la sezione nel microscopio elettronico, eseguito lo script la stabilizzazione della sezione (i. e., la routine 'esemplare-cucina') durante la notte. Lo script quindi selezionato in modo casuale un numero di punti predefiniti dall'utente da quelli contrassegnati con una grata nella Figura 3. Di produrre una microfotografia di prova e controllare i suoi livelli di grigio, lo script controllato se nei punti prescelti sono stati situati su una parte visibile della sezione, respingendo i punti che sbarcati sulle sbarre. La maggior parte del flusso di lavoro è stato gestito dallo script con un'interazione minima dell'utente. Tuttavia, non era possibile registrare automaticamente energia filtrata micrografie (con questa configurazione), come c'era troppa poca luce per la routine di autofocus di SerialEM. Pertanto, siamo passati al DM software appena lo script aveva spostato la fase in ogni punto, regolato il fuoco a mano e fatto un immagine EFTEM di ferro. Nella Figura 4è riportato un esempio di un'immagine di ferro EFTEM da post mortem del cervello umano.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig1.jpg"> Figura 1. Illustrazione del flusso di lavoro. (A) le fasi principali della preparazione del campione sono mostrate (in direzione della freccia): sezioni del vibratome (i), embedding(ii), taglio di profili semi-sottile e ultra-sottile (iii) e coppie di sezioni ultrasottili su rame griglie (iv) la cattura. (B) l'utilizzo del software del fornitore microscopio e software su misura di RPS per creare le coordinate dell'area di campionamento che determinano i siti di registrazione. I punti d'angolo delle sezioni vengono memorizzati nel software microscopia e il ROI è delineato (identificato con l'aiuto delle sezioni semi-sottile) (i); una griglia di aree di campionamento viene generata sopra il ROI, uno spostamento casuale (freccia rossa) è stato introdotto in x e y. Lo spostamento è inferiore alla distanza tra le aree di campionamento, (frecce nere), in modo che anziché i quadrati neri, che non hanno nessuna svolta, i quadrati blu, che sono spostati casualmente, sono utilizzati per determinare i siti di registrazione (ii); solo aree di campionamento all'interno dei bordi del ROI (disegnata come un quadrato nero e blu) vengono utilizzate per la registrazione. Micrografie sono realizzati sia nella sezione di riferimento (quadrati neri) e nelle posizioni corrispondenti nella sezione ricerca (quadrati blu) (iii). (C) un Micrografo fatta presso ogni area di campionamento ad un ingrandimento sufficiente; un montaggio composto da diverse immagini unite fatta se necessario (in questo caso, 2 x 2 immagini sono state unite) (i); una cornice di conteggio è generata e mostrata come una sovrapposizione dell'immagine, strutture all'interno della cornice e sulle 'linee di accettazione' (cornice tratteggiata linee) verranno conteggiate, ma non quelli sulle 'linee' (linee solido telaio) (ii). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig2.jpg"> Figura 2 . Misurazione dei parametri ultrastrutturali su un paio di sezioni ultrasottili con un telaio di counting imparziale. (A) Panoramica delle finestre ImageJ utilizzato per il conteggio e l'analisi di strutture cellulari. Sul lato sinistro mostra il Micrografo elettronico con il telaio di conteggio come un overlay. Sul lato destro: l'interfaccia di utente di ImageJ (rettangolo blu) con il menu a discesa (in alto) e la barra degli strumenti (in basso); l' editor di oggetti ObjectJ (rettangolo verde); la finestra di Strumenti ObjectJ (rettangolo arancione) dove possono essere selezionati gli strumenti per la misurazione e la finestra di ObjectJ risultati (rettangolo nero) dove sono documentate tutte le misurazioni. (B) dettaglio da un mostrando le sinapsi contrassegnate sul Micrografo elettronico (sinapsi su entrambe le sezioni - frecce; sinapsi solo sulla ricerca sezione-punte di freccia). Quelli sono contrassegnati mediante lo strumento-Multipoint (cerchio rosso) dalla barra degli strumenti in ImageJ. (C) i nomi e i parametri di misurazione delle caratteristiche sinaptiche vengono definiti utilizzando gli Strumenti di ObjectJ. Il Marcatore-Tool e la funzione di interesse vengono selezionati e il contorno disegnato nell'immagine di sinistra-clic del mouse lungo la struttura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig3.jpg"> Nella figura 3. Selezione aree per elemental mapping all'interno di un ROI per microscopia elettronica di trasmissione di energia filtrata di campionamento. SerialEM viene utilizzato per selezionare una regione di interesse e di suggerire un elevato numero di aree di campionamento ad una spaziatura regolare (rosa croci nelle immagini A e B). Uno script quindi seleziona casualmente aree di campionamento (da queste coordinate predefinite) per l'acquisizione. Aree di campionamento con scarsa illuminazione vengono rifiutati per evitare le sbarre e le fermate di script appena 20 aree di campionamento ben illuminati sono stati selezionati entro il ROI. (A) Panoramica di tutta l'area di interesse, delineato da un poligono, con un elevato numero di aree di campionamento possibile contrassegnato con x. (B) dettaglio di A che mostra le aree di campionamento prima selezione casuale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig4.jpg"> Nella figura 4. Esempio di acquisizione di mappa Elementale (EFTEM). (A) Micrografo TEM campo luminoso della zona attorno al punto di acquisizione. Un'area selezionata in modo casuale utilizzata per ottenere una mappa Elementale ed è contrassegnata da un rettangolo nero. (B) EFTEM pre-bordo immagine finestra fatta nell'area selezionata in modo casuale. (C) EFTEM post-bordo immagine finestra fatta nella stessa zona. (D) mappa Elementale di ferro della stessa area (M-edge). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Introduciamo un romanzo del flusso di lavoro per le indagini di microscopia elettronica del tessuto cerebrale. Il metodo consente all'utente di esaminare le caratteristiche di un neurone in modo imparziale. Per analisi elementare, presentiamo anche uno script che automatizza la maggior parte del flusso di lavoro per il campionamento randomizzato.

Un approccio imparziale di campionamento TEM sezioni in neuroscienze

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

Un protocollo di campionamento imparziale è vitale per la microscopia elettronica. Se si desidera quantificarlo sulla densità numerica delle sinapsi o di altre strutture in una determinata area cerebrale, il vantaggio principale della nostra tecnica è che è imparziale e consente di produrre automaticamente micrografie di elettroni con un intervento minimo da parte dell'utente. Questa tecnica è preziosa anche in altre aree di ricerca, come le neuroscienze, dove può essere utilizzata per valutare la forza di una rete neurale.Per applicare il nostro protocollo, è necessario avere esperienza nelle tecniche microscopiche degli elettroni, come la preparazione del campione e il funzionamento di un microscopio elettronico di transizione. A dimostrare la nostra procedura sarà il dottor Stefan Wernitznig, un post-doc del mio laboratorio. Questo protocollo consiste nella preparazione di campioni cerebrali per la microscopia elettronica, tagliando coppie di sezioni sottili.Successivamente, descriverà come produrre automaticamente un numero definito di micrografie di elettroni in un'area di interesse. Quindi, utilizzerà un frame di conteggio per valutare la densità numerica delle caratteristiche strutturali. Per iniziare, sezionare, correggere, post-correggere e incorporare campioni di interesse nell'incorporamento della resina seguendo insieme al protocollo di testo di accompagnamento.Quindi, posizionare il campione su un ultramicrotomo e produrre sezioni seriali ultra sottili da 55 nanometri. Posizionare le sezioni su una griglia di slot con le dimensioni di un millimetro per due millimetri, rivestite con forma di piola. Quindi, controsostenere le sezioni ultra sottili sulle griglie degli slot usando acetato di 2%uranil per 30 minuti, seguito da citrato di piombo per 30 secondi a temperatura ambiente.Posizionare la griglia nel TEM ed esaminare le sezioni sulla griglia con il TEM utilizzando un ingrandimento basso per orientare e valutare la qualità delle sezioni. Avviare quindi il software TEM Serial Section, selezionare Sezione e scegliere Inserisci per aggiungere i punti d'angolo per la sezione di riferimento e ricerca. Seguire le istruzioni della finestra popup.Iniziare con la sezione di riferimento e quindi continuare con la sezione di ricerca. Assicuratevi che gli spigoli della sezione siano paralleli alla sezione successiva, man mano che vengono immessi i punti uno e due. Visualizzare quindi la sezione di riferimento con un ingrandimento basso per identificare l'area di interesse.Spostare lo stadio del microscopio utilizzando l'analisi delle immagini TEM nella sezione di riferimento in più punti d'angolo del ROI per creare un contorno del ROI. Registrare le coordinate del poligono risultante utilizzando il software di campionamento casuale dei punti. Per questo motivo, premere Aggiungi coordinate nella finestra di dialogo del software di campionamento a punti casuali in ogni punto del poligono necessario per delineare il ROI nella sezione.Successivamente definire e inserire una dimensione adatta per le aree di campionamento e le distanze tra le aree nel software di campionamento casuale dei punti. Quindi, premete Calcola raster per generare coordinate in modo sistematico, uniforme e casuale per le posizioni della micrografia all'interno del poligono. Conservare i punti di campionamento nelle sezioni di riferimento e di ricerca, utilizzando il software Random Point Sampling e il software TEM Serial Section.Queste sono le coordinate dei montaggi che vengono registrate in seguito. Nel software random point sampling, premere vai nella posizione successiva per spostare lo stadio del microscopio sulle coordinate x, y di ogni area di campionamento nella sezione di riferimento. Quindi, selezionate Posizione (Location) e scegliete Inserisci (Insert) per importare queste coordinate nel software TEM Serial Section nella sezione di riferimento.Ripetere questa situazione per tutte le coordinate. Per specchiare le coordinate della sezione di riferimento nella sezione di ricerca, selezionate Sezione (Section) e scegliete Vai a sezione (Go to Section). Immettere il numero della sezione di ricerca nella finestra di dialogo.Per la registrazione dei montaggi, passare dalla sezione di riferimento a una sezione di ricerca, come descritto in precedenza, e modificare la posizione nella sezione di riferimento con la posizione e passare al numero. Scegliete la coordinata successiva nella finestra di dialogo. Per i montaggi SerialEM, ad ogni coordinata di campionamento, andate su File e scegliete Nuovo montaggio dal menu a discesa.Selezionare il numero di riquadri destro e la percentuale di sovrapposizione nella finestra di dialogo. Per il presente studio, un ingrandimento di 5000 è sufficiente per riconoscere le caratteristiche sinaptiche dello studio. Ma il campo visivo limitato della telecamera CCD richiedeva la realizzazione di montaggi di due per due immagini.I montaggi sono fatti per SerialEM. Prima di registrare ogni montaggio, riregolare lo stato attivo o attivare l'opzione di messa a fuoco automatica nel software di registrazione. Scegliete la cartella per salvare il file di montaggio e iniziate la registrazione del montaggio premendo Start nel sottoprogramma di montaggio, a sinistra in SerialEM.Avviare la microdissettrice e definire le dimensioni del frame di conteggio e il numero di segmenti in base alle esigenze. Contare la densità della sinapsi utilizzando la macro dissector. Utilizzando lo strumento multi-punto situato sulla barra degli strumenti, limitare le sinapsi che si intersecano con le due linee proibite del dissector, ma contano le sinapsi sulle linee di accettazione opposte.Contrassegnare ogni sinapsi all'interno del frame di conteggio visibile nella sezione di riferimento, ma non visibile nella sezione di ricerca, con una selezione ovale. Per misurare i parametri della sinapsi, selezionare solo le sinapsi con una fessura sinaptica orientata nella sezione trasversale che si trova nella sezione di riferimento. Questo dovrebbe essere all'interno degli stessi fotogrammi immagine utilizzati per il dissector.Quindi, vai a Plugins e quindi ad Analizza e avvia il plugin ObjectJ dal menu a discesa. Aprire un nuovo progetto dalla finestra di dialogo a discesa ObjectJ che aprirà una finestra che consente all'utente di delineare e contrassegnare le strutture con lo strumento marcatore. In primo luogo, utilizzare lo strumento marcatore per misurare la lunghezza della membrana pre-sinaptica e la lunghezza della densità post-sinaptica disegnando una linea lungo la struttura.Quindi, ottenere la larghezza media della fessura sinaptica disegnando un poligono, coprendo sia la membrana pre che post-sinaptica. Per determinare il numero di vescicole ancorate, contare tutte le vescicole che hanno una distanza massima dalla membrana presinaptica di un diametro vescicolare o inferiore. Quindi, determinare il numero di vescicole non ancorate contando le vescicole con una distanza massima di un diametro vesicolare dalle vescicole ancorate o da altre vescicole non ancorate nella stessa sinapsi.Una versione adattata del protocollo consente analisi elementali in luoghi ottenuti in modo imparziale all'interno della sezione ultra sottile. Per questo, in modalità di imaging TEM, avviare SerialEM e aprire un nuovo progetto. Quindi, apri il Navigatore e controlla le impostazioni della fotocamera nei controlli della fotocamera e dello script per visualizzare, registrare e avviare la visualizzazione.Per creare una mappa d'angolo della sezione ultra sottile, scegliete Aggiungi punti nella finestra Navigatore. Quindi, impostare i punti d'angolo ai bordi di una sezione ultra sottile. Spostare il palco in un punto d'angolo tenendo premuto il tasto destro del mouse.Quando viene raggiunto un angolo della sezione, aggiungere un punto d'angolo con un clic sinistro del mouse. Ripetere la procedura per aggiungere altri tre punti d'angolo. Assicurarsi che nella finestra Navigatore la casella C per i punti d'angolo sia spuntata per i punti memorizzati.Per avviare il montaggio ad angolo, passare a Navigatore nella barra dei menu SerialEM e scegliere Montaging Grids e Setup Corner Montage dal menu a discesa. Selezionate Aggiungi poligono (Add Polygon) nella finestra Navigatore (Navigator) e delineate l'area di interesse con più clic con il pulsante destro del mouse. Quindi, scegliete Aggiungi griglia di punti nel menu a discesa Navigatore e definite una distanza tra i punti.Avviare lo script EFTEMSerialEM, seguire i comandi di script, immettere il numero di punti griglia come mostrato nel Navigatore e immettere il numero di punti di acquisizione. Quindi, impostare la soglia di illuminazione in modo che lo script possa evitare le barre della griglia. Seguire i comandi dello script e spostare manualmente la fase per coprire il campo visivo di un quarto della barra della griglia.In base al valore visualizzato, immettere un valore di illuminazione di soglia superiore al valore visualizzato. Attendere che i punti per l'acquisizione siano selezionati e la routine di cottura sia terminata. Questo richiede molto tempo e può essere fatto durante la notte.Dopo la configurazione per l'analisi elementale TEM filtrata dall'energia, acquisire una mappa elementale con impostazioni specifiche dell'elemento. L'approccio di campionamento imparziale è utile per contare e analizzare le caratteristiche sinaptiche in specifiche regioni cerebrali. Inoltre, lo script EFTEMSerialEM per il software SerialEM consente di scegliere casualmente i punti di acquisizione all'interno di un'intera sezione ultra sottile, con l'obiettivo di ottenere una micrografia elettronica filtrata dall'energia in ciascuno di questi punti.Lo script ha selezionato casualmente un numero di punti, predefiniti dall'utente tra quelli contrassegnati con una scarpata. Producendo una micrografia di prova e controllandone i livelli di grado, lo script ha verificato se i punti scelti si trovavano su una parte visibile della sezione, rifiutando i punti che atterravano sulle barre della griglia. La maggior parte del flusso di lavoro è stata gestita dallo script, con un'interazione minima dell'utente.Tuttavia, con il campione mostrato qui, c'era troppa poca luce per la routine di messa a fuoco automatica di SerialEM. Pertanto, non appena lo script ha spostato lo stage in ogni punto, lo stato attivo è stato regolato e una mappa elementale è stata fatta di ferro. È importante selezionare attentamente la regione di interesse e garantire che lo stesso numero di punti di campionamento rientri in ogni area di interesse.Non dimenticare che molte delle sostanze chimiche utilizzate per la preparazione del campione sono tossiche. Quindi indossa un camice da laboratorio e guanti protettivi e lavora sotto una copertura di fumi.

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Banche del cervello e campionatura sistematica di materiale biologico costituisce la base per stereologia imparziale e massimizza il potenziale dei dati ottenuti da ogni campione.

Cervello Banking: Utilizzare al meglio il vostro campioni di ricerca

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Conoscere ciò che conta: stereologia Tutti nel settore non umano cervello dei primati

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Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica

Usiamo magneto-e di elettroencefalografia (MEG / EEG), combinata con informazioni anatomiche catturato dalla risonanza magnetica per immagini (MRI), per mappare le dinamiche della rete corticale associata con attenzione uditiva.

Mappatura Dynamics corticali tramite MEG / EEG simultanee e anatomica vincolata minima norma-Stime: un esempio Attenzione Auditory

Questo protocollo descrive ricostruzioni su larga scala di popolazioni neuronali selettivi, etichettati dopo l'infezione retrograda con esprimendo un virus della rabbia modificato marcatori fluorescenti, e le analisi di cluster indipendente, imparziale che consentono la caratterizzazione completa delle metriche morfologiche tra sottoclassi neuronali distinti.

Ricostruzioni su larga scala e indipendente, imparziale Clustering Sulla base morfologici metrica per classificare i neuroni in selettivi Popolazioni

Qui presentiamo un metodo stereologico, il frazionatore ottico, usato per quantificare la formazione di nuovi neuroni e la loro sopravvivenza nell'ippocampo del ratto dopo la stimolazione elettro-convulsiva. Quando viene correttamente implementata, la sensibilità e l'efficienza dei metodi stereologici garantiscono accurati stimi con una precisione fissa e predeterminata.

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Questo articolo viene descritto un metodo semplice per preparare piccoli cervelli animali per l'imaging di micro-CT, in quale le lesioni possono essere quantificate ed elettrodi che si trova con alta precisione nel contesto dell'intero cervello.

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Viene descritto in dettaglio come condurre una meta-analisi di studi di neuroimaging basati su voxel utilizzando seed-based d Mapping with Permutation of Subject Images (SDM-PSI).

Meta-analisi degli studi di neuroimaging basati su Voxel utilizzando la mappatura d basata su semi con permutazione delle immagini soggetto (SDM-PSI)

Qui è descritta una procedura stereotassica che può colpire regioni cerebrali impegnative e difficili da raggiungere (a causa di limitazioni spaziali) utilizzando un approccio coronale angolato. Questo protocollo è adattabile sia a modelli murini che di ratto e può essere applicato a diverse applicazioni neuroscientifiche, tra cui l'impianto di cannule e microiniezioni di costrutti virali.

Approccio stereotassico angolato adattabile per tecniche di neuroscienze versatili

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