Identificazione dei Mouse e dei repertori di anticorpo umano mediante sequenziamento di nuova generazione

In questo video descriviamo un metodo semplice ed efficiente per visualizzare e analizzare un repertorio di anticorpi a livello globale. È possibile descrivere interi repertori cellulari B negli individui e i loro cambiamenti dinamici in risposta alla stimolazione immunitaria. Questo metodo può essere applicato per analizzare campioni patologici da pazienti di infezioni virali emergenti e per ottenere i dati con una visione senza precedenti della patogenesi dell'infezione.

Una delle aree più eccitanti per l'applicazione è un controllo del vaccino. L'efficacia del vaccino può essere valutata analizzando la dinamica del repertorio anticorpale globale negli individui somministrati con vaccino. L'individuo è nuovo a questo metodo potrebbe aver bisogno di ottimizzare le condizioni PCR perché l'efficienza dell'amplificazione genica degli anticorpi dipende dai tipi di materie prime.

Fla-cher per l'identificazione degli ampliconi di immunoglobulina. È importante dimostrare visivamente queste azioni. A dimostrare la procedura saranno miss Sayuri Yamaguchi e il signor Hanbing Xue, tecnico e studente laureato del mio laboratorio.

Per iniziare questa procedura, sezionare il tessuto da un topo C57 nero di otto settimane e passarlo attraverso una rete in acciaio inossidabile con due millilitri di PBS per ottenere cellule disperse. Trasferire la sospensione cellulare su un tubo di microcentrifugo a due millilitri e centrifugare a 600 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e aggiungere 800 microlitri di tampone di lisciviamento ACK al pellet.

Incubare sul ghiaccio per due minuti per liscire i globuli rossi nel tessuto. Successivamente, lavare le cellule tissutali tre volte utilizzando tre millilitri di PBS per ogni lavaggio. Centrifugare di nuovo a 600 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Scartare il supernatante e aggiungere accuratamente al pellet e al vortice 800 microlitri di isotiocianato di fenolo/guanidina. Incubare a 25 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, aggiungere 200 microlitri di cloroformio e agitare manualmente per 15 secondi.

Incubare a 25 gradi Celsius per due minuti. Centrifuga a 12.000 volte g e a 25 gradi Celsius per separare le fasi. Trasferire la fase acquosa superiore in un tubo fresco.

Aggiungere un volume di 70% di etanolo. Vortice brevemente e applicare questa miscela sulla colonna di spin di silice. Elute l'RNA con da 30 a 100 microlitri di acqua.

Dopo questo, utilizzare un fluorometro per quantificare la concentrazione iniziale di RNA. Conservare l'RNA purificato a meno 80 gradi Celsius. In primo luogo, sintetizzare il cDNA a primo filamento da due a 10 microgrammi di modello di RNA totale utilizzando il primer CDS 5'RACE e l'oligonucleotide SMART-PCR secondo le istruzioni del produttore.

Per l'immunoglobulina del topo, la PCR amplifica il cDNA con DNA polimerasi ad alta fedeltà, utilizzando il primer in avanti universale e i primer inversi specifici della classe immunoglobulina, come delineato nel protocollo di testo. Per l'immunoglobulina umana, eseguire la prima PCR utilizzando il primer in avanti universale e i primer inversi specifici della classe di immunoglobulina con sequenze di tag. Includere le sequenze di indice per ogni campione per secondo PCR utilizzando primer di sequenza di indici.

Successivamente, elettroforesi uno dei prodotti PCR su un gel di agarosio al 2%. Visualizza le bande di DNA su un transilluminatore UV e asporta la fetta di gel contenente l'ampia banda tra 600 e 800 coppie di basi. Aggiungere 10 microlitri di soluzione legante a membrana per 10 milligrammi di fetta di gel.

Mescolare e incubare a 50-65 gradi Celsius fino a quando le fette di gel si dissolvono completamente. Quindi, trasferire la soluzione di gel sulla colonna di rotazione della membrana di silice. Lavare la colonna una volta con tampone di lavaggio ed elutare il DNA con 50 microlitri di acqua priva di nucleasi.

Utilizzando un fluorometro, quantificare gli ampliconi purificati e mettere in comune gli ampliconi di ogni classe di immunoglobulina in quantità uguali per il sequenziamento NGS. Successivamente, utilizzare un'elettroforesi a base microcapillare con chip di dimensionamento del DNA per determinare le dimensioni e la concentrazione delle librerie. Archiviare le librerie a meno 20 gradi Celsius.

Innanzitutto, generare un foglio di calcolo di esempio dell'esecuzione della sequenza come descritto nel protocollo di testo. Quindi, scongelare una cartuccia di reagente e le librerie. Fare una soluzione normale 0.2 di idrossido di sodio e diluire le librerie per ottenere le concentrazioni molare desiderate.

Quindi sciacquare e asciugare la cella di flusso e aggiungere 600 microlitri della soluzione libreria diluita e denaturata nel pozzo della cartuccia del reagente e avviare la corsa di sequenziamento. Una prospettiva di un repertorio di anticorpi murini nel suo complesso può essere ottenuta da cellule o tessuti come milza, midollo osseo, linfonodo o sangue. Qui vengono mostrati i risultati rappresentativi dei repertori della catena luminosa IgM, IgG1, IgG2c e immunoglobulina di una milza ingenua del topo.

Nel riarrangiamento V(D)J per 3D V(D)J plot, la dimensione di ogni palla rappresenta il numero relativo di letture. In altre parole, rappresenta il numero di mRNA anticorpali nelle cellule B intere. La rete 3D è costituita da 110 geni V a catena pesante di immunoglobulina, 12 geni della catena pesante D dell'immunoglobulina e quattro geni J a catena pesante di immunoglobulina, che sono allineati per riflettere il loro ordine sul cromosoma.

La trama 2D VJ mostra il profilo del riarrangiamento VJ nel repertorio IGL. La lunghezza di ogni barra rappresenta il numero relativo di letture. L'asse X rappresenta 101 geni V-kappa a catena luminosa immunoglobulina, e tre geni V-lambda della catena luminosa dell'immunoglobulina, e l'asse Y rappresenta quattro geni J-kappa della catena luminosa di immunoglobulina e tre geni J-lambda a catena luminosa di immunoglobulina.

Una prospettiva di repertorio di anticorpi umani nel suo complesso può essere analizzata da vari tessuti tra cui cellule mononucleari del sangue periferico o tessuti patologici. I risultati rappresentativi dei repertori IgM, total IgG, total IgA, IgD, IgE e IgL delle normali cellule mononucleari del sangue periferico sono mostrati qui. Come il modello murino, il profilo di repertorio del riarrangiamento V(D)J è mostrato sulla trama 3D V(D)J in cui la dimensione di ogni palla rappresenta il numero relativo di letture.

La rete 3D è costituita da 56 geni V a catena pesante di immunoglobulina, 27 geni della catena D pesante dell'immunoglobulina e sei geni J a catena pesante di immunoglobulina, allineati nell'ordine in cui appaiono sul cromosoma. Il profilo del riarrangiamento VJ nel repertorio IgL è raffigurato nella trama VJ 2D in cui la lunghezza di ogni barra rappresenta il numero relativo di letture. L'asse X rappresenta 41 geni V-kappa a catena luminosa immunoglobulina, e 32 geni V-lambda della catena luminosa di immunoglobulina, e l'asse Y rappresenta cinque geni J-kappa della catena luminosa di immunoglobulina e cinque geni J-lambda a catena leggera di immunoglobulina.

Nel materiale di studio di questo protocollo, un piccolo numero di cellule ordinate per citometria del flusso o anche criosezioni di campioni patologici sono utilizzabili. Tuttavia, sarà necessaria un'attenta ottimizzazione delle condizioni della PCR. Poiché le informazioni sull'output di questo protocollo sono enormi, l'alfabetizzazione bioinformatica aiuterebbe a trovare la struttura della rete di anticorpi.

Ciò porterebbe senza pretese a una profonda comprensione del sistema immunitario.