Isolamento e caratterizzazione di umani cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale-derivato da prematuri e neonati a termine

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella deliberazione dell'UCMSC, come la migliore fonte di USMSC per la terapia cellulare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un isolamento costante e una vigorosa proliferazione dell'UCMSC dai neonati pre-termine e a termine. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia delle malattie intrattabili.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla deliberazione dell'UCMSC, può essere applicato anche ad altre fonti MSC, come tessuto adiposo, sinovio, pelle, polpa dentale e così via. Generalmente, un individuo nuovo a questo metodo avrà difficoltà perché ci sono così tante variazioni nei passaggi della dissezione ombelicale e dell'isolamento delle cellule staminali mesenchimali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto questi passaggi sono difficili da apprendere perché ci sono diversi punti inclini a essere trascurati.

Per iniziare a sezionare il cordone ombelicale, preparare prima un vassoio metallico, forbici sterilizzate e forcep, pipette da dieci millilitri, pipette da 25 millilitri e due piatti di coltura tissutale da 60 millimetri. Riscaldare le miscele enzimatica purificata PBS, un 500 millilitro di mezzo siero ridotto e mezzo di coltura, a temperatura ambiente. Rimuovere il cordone ombelicale precedentemente isolato da un tubo da 50 millilitri in alpha MEM e posizionarlo nel vassoio di plastica.

Pesare il cordone ombelicale e quindi utilizzare forbici sterilizzate per sezionare cinque grammi del cavo. Per sterilizzare il cordone ombelicale, utilizzare una pipetta da dieci millilitri per versare dieci millilitri di 70% di etanolo su di esso. Quindi lavare il cavo due volte aggiungendo dieci millilitri di PBS con pipetta da dieci millilitri.

Posizionare il cordone ombelicale lavato nel piatto sterilizzato di coltura tissutale da 60 millimetri e aggiungere dieci millilitri ridotti mezzo siebro e miscele enzimatiche purificate da 0,5 millilitri. Utilizzare forbici sterilizzate e forcette per tagliare il cavo in pezzi da due a tre millimetri. Mettere il piatto in un incubatore di anidride carbonica al cinque per cento e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Quindi tagliare i pezzi parzialmente digeriti in pezzi più piccoli e incubarli a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica del cinque per cento fino a quando l'omogeneato diventa viscoso. Infine, assicurarsi che l'omogeneato fluisca facilmente attraverso una pipetta da 25 millilitri. Preparare prima quattro tubi di plastica da 50 millilitri in una bottiglia da 500 millilitri di terreno di coltura.

Utilizzare una pipetta da 25 millilitri per dividere l'omogeneo del cordone ombelicale in due tubi di plastica da 50 millilitri con circa 7,5 millilitri in ogni tubo. Quindi aggiungere 20 millilitri di mezzo di coltura in ogni tubo e mescolare bene. Raccogliere ogni omogeneato con pipetta da 25 millilitri e filtrare attraverso un colino a celle da 100 micrometri posizionato sopra un nuovo tubo di raccolta da 50 millilitri.

Centrifugare due tubi con filtrati a 1000g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver terminato la centrifugazione, aspirare attentamente il supernatante e scartarlo. Aggiungere cinque millilitri di mezzo di coltura a ciascun tubo e sospendere di nuovo i pellet cellulari.

Trasferire la sospensione cellulare in una nuova piastra e coltura di 60 millimetri a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al cinque%. Per coltura dell'UCMSC, riscaldare il PBS, l'EDTA della tripina e il mezzo di coltura, a temperatura ambiente. Quando le cellule sono attaccate alla piastra, rimuovere il mezzo e lavare due volte con cinque millilitri di PBS per rimuovere detriti e globuli rossi.

Aggiungere il mezzo di coltura e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al cinque%. Sostituire il mezzo due volte a settimana e colturare le celle fino a raggiungere la confluenza dal 90 al 100%. Quindi lavare le cellule due volte con cinque millilitri di PBS, aggiungere 0,5 millilitri di tripside EDTA e incubare a 37 gradi Celsius per cinque o dieci minuti.

Quando le celle vengono arrotondate e staccate, aggiungere nove millilitri di mezzo di coltura e mescolare bene per inattivare la tripina. Aggiungere la sospensione cellulare in una nuova piastra da 100 millimetri. Far crescere le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica del 5% fino a raggiungere la confluenza dal 90 al 100%.

Ripetere la tripinazione e dividersi in due nuove piastre, fino al decimo passaggio. L'espressione marcatore di superficie degli UCMSC è stata usata come criterio per la loro caratterizzazione. Quando incubati con anticorpi appropriati e analizzati dalla citometria del flusso, sono stati trovati positivi per i marcatori distintivi di MSC, ma negativi per il macrofago monocitario, negativi per le cellule staminali ematapoietiche e la cellula ephiteliale, negativi per la cellula B, negativi per i leucociti pan e negativi per marcatori complessi di istocompatibilità maggiore.

Per valutare la capacità di differenziazione trilineare degli USCMSC dai neonati pretermine e a termine, le cellule sono state indotte a differenziarsi in adipociti, osteociti e condrociti. L'UCMSC si è differenziato con successo in tutti e tre i tipi di cellule mesodermiche confermando la loro capacità di differenziazione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che ci sono quattro passaggi critici.

Tagliare il cavo in pezzi da due a tre centimetri, tagliando in pezzi più piccoli, assicurandosi che l'omogeneato fluisca facilmente attraverso una pipetta da 25 millilitri e filtrando l'omogeneato attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri.