Name: Preparazione di ritmicamente-attivo In Vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Impara a preparare fette ritmicamente attive di tronco encefalico-spinale neonatale di roditore per studiare i circuiti neurali respiratori. Questo metodo consente registrazioni elettrofisiologiche riproducibili del complesso pre-Botzinger.

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S.B.P è un destinatario di un assegno di ricerca di Loma Linda University Summer Undergraduate.

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<li>Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+dysfunctions+induced+by+prenatal+nicotine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Adattare il protocollo presentato qui in un blocco di it o fetta flusso di lavoro è vantaggiosa per i laboratori e studi che vorrebbero utilizzare entrambi del blocco dell'en del tronco cerebrale-spinale cavo e/o sottile fetta preparativi per registrazioni di elettrofisiologia. Il metodo di dissezione e fetta presentato, combinati con metodi precedentemente segnalati da altri17,18,19, permetterà la preparazione riproducibile di ...

La rete neurale respiratoria del tronco cerebrale fornisce un dominio fertile per comprendere le caratteristiche generali delle reti neurali ritmiche. In particolare, l'interesse è lo sviluppo di roditore neonatale respirazione e comprendere come si sviluppa il ritmo del respiro. Questo può essere fatto utilizzando un approccio multi-livello, tra cui in vivo animale intero pletismografia, in vitro del blocco dell'en del nervo registrazioni e in vitro affettare le registrazioni che contengono il generatore di ritmo di respirazione. Riduzionista in vitro en bloc e fetta registrazioni sono un metodo vantaggioso usare quando interrogare i meccanismi dietro rhythmogenesis respiratoria e circuiti neurali nella regione del tronco cerebrale-spinale del cavo di sviluppo di roditori. Lo sviluppo del sistema respiratorio comprende circa 40 tipi di cellule, caratterizzati da sparo modello, compresi quelli del centro respiratorio1,2. La rete respiratoria centrale comprende un gruppo di neuroni ritmicamente attivi che si trova in rostral midollo ventrolateral1,3. Rhythmogenesis respiratorio dei mammiferi è generato da un autorhythmic Interneurone rete soprannominato il preBötzinger complesso (pBC), che è stato localizzato sperimentalmente tramite sia fetta ed en bloc preparazioni a base di mammiferi neonatali tronco cerebrale-spinale cavi3,4,5,6,7,8. Questa regione serve una funzione simile al nodo senoatriale (SA) nel cuore e genera un sistema di cronometraggio inspiratori alla respirazione in auto. Da pBC, il ritmo inspiratorio è trasportato ad altre regioni del tronco cerebrale (tra cui il nucleo motore hypoglossal) e spinale motore piscine (come i motoneuroni frenici che guidano il diaframma)9.
L'attività ritmica può essere ottenuta utilizzando del tronco cerebrale del midollo spinale en bloc preparati o fette da una varietà di popolazioni di cellule, tra cui radichette nervo di C3-C5, radichette del nervo XII, nucleo motore hypoglossal (XII MN), neuroni premotoria hypoglossal (XII pMN), e il pBC3,10,11,12. Mentre questi metodi di raccolta dei dati hanno avuto successo attraverso una manciata di laboratori, molti dei protocolli non sono presentati in un modo che è completamente riproducibile per nuovi ricercatori entrano nel campo. Ottenere praticabile e ritmicamente attivo en bloc e fetta preparazioni richiede un'acuta attenzione al dettaglio attraverso tutte le fasi della dissezione e protocollo di taglio fetta. Precedenti protocolli ampiamente descrivere le varie procedure di registrazione ed elettrofisiologia, ancora prive di dettagli nella parte più critica di ottenere una preparazione di tessuto vitale: eseguire la procedura di dissezione e fetta di tronco cerebrale-spinale.
In modo efficiente ottenere una preparazione di blocco o fetta ritmicamente-attivi e vitali en registrazioni di elettrofisiologia del tronco cerebrale-spinale richiede che essere effettuati tutti i passaggi correttamente, accuratamente e rapidamente (in genere, l'intera procedura relative qui può essere eseguita in circa 30 min). Punti critici del protocollo elettrofisiologia del tronco cerebrale-spinale che precedentemente non sono stati ben descritti includono la dissezione delle radichette del nervo e la procedura per affettare il del vibratome. Questo protocollo è il primo a graduale comunicare visivamente la dissezione del tronco cerebrale-spinale per nuovi ricercatori ed esperti nel campo. Questo protocollo spiega anche accuratamente le tecniche chirurgiche, monumenti e altre procedure per assistere i futuri ricercatori nella standardizzazione fette e del blocco dell'en preparati per contenere il circuito esatto desiderato in ogni esperimento. Le procedure qui presentate possono essere utilizzatoin cuccioli neonatali mouse e del ratto.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-1</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 &; H2O</td><td>Sigma Aldrch</td><td>S9638-25G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7774-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente di luce fredda Lampada alogena 150 W</td><td>AmScope</td><td>H2L50-AY</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio di dissezione</td><td>Leica</td><td>M-60</td><td></td></tr><tr><td>Vibratomo 1000 Plus</td><td>Vibratomo</td><td>W3 69-0353</td><td></td></tr><tr><td>Base magnetica</td><td>Kanetic</td><td>MB-B-DG6C</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Patterson Veterinario</td><td>NDC 14043-704-06</td><td></td></tr><tr><td>Spada Classic Double Edge Lame</td><td>Wilkinson</td><td>97573</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2779</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td> fini <td>Strumenti per scienze fini</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forcipe</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Lame per bisturi #10</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi Händel #3</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla dritte&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinza a modello stretto Seghettato/dritto</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Micro Forbici a molla per dissezione; Forbici</td><td>Roboz</td><td>RS-5650</td><td></td>Vannas dritte</tr><tr><td>3" Curvo</td><td>Roboz</td><td>RS-5621</td><td></td></tr><tr><td>Perni per insetti, 0</td><td>Strumenti di Fine Science/8840604</td><td>26000-35&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spille per insetti, 0, SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-35</td><td></td></tr><tr><td>Spille per insetti, 00</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-30</td><td></td></tr><tr><td>Spille per insetti, 00, SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-30</td><td></td></tr><tr><td>Spille per insetti, 000</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>Spille per insetti, 000, SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-25</td><td></td></tr><tr><td>Minutien perni, 0,10 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>perni Minutien, 0,15 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>Perni Minutien, 0,2 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Preparazione dei tessuti Parafin&nbsp;</td><td>fisher</td><td>T56-5</td><td></td></tr><tr><td>Grafite&nbsp;</td><td>pescatore&nbsp;</td><td>G67-500</td><td></td></tr><tr><td>Delrin Plastica&nbsp;</td><td>Grainger</td><td>3HMT2</td><td></td></tr><tr><td>Ago ipodermico calibro 18</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione di ritmicamente-attivo in vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammiferi ritmo inspiratorio è generata da una rete di un neurone in una regione del midollo chiamato il preBötzinger complex (pBC), che produce un segnale guida la contrazione ritmica dei muscoli inspiratori. Attività neurale ritmica il PBC e ha trasportato ad altre piscine neuronale per la muscolatura della respirazione può essere studiata utilizzando vari approcci, tra cui del blocco dell'en del nervo registrazioni e registrazioni di sezione trasversale in auto. Tuttavia, metodi precedentemente pubblicati non sono ampiamente descritti il processo di dissezione del tronco cerebrale-spinale del cavo in modo trasparente e riproducibile per gli studi futuri. Qui, presentiamo una panoramica completa di un metodo utilizzato riproducibile taglio fette ritmicamente-attivo del tronco cerebrale che contiene la circuiteria neuronale necessaria e sufficiente per la generazione e trasmissione inspiratori in auto. Questo lavoro si basa su protocolli di elettrofisiologia del tronco cerebrale-spinale del cavo precedente per migliorare la probabilità di ottenere in modo affidabile fette praticabile e ritmicamente-attivo per la registrazione di un neurone uscita da pBC, neuroni premotoria hypoglossal (XII pMN), e motoneuroni hypoglossal (XII MN). Il lavoro presentato si espande sulla precedenti metodi pubblicati fornendo illustrazioni dettagliate della dissezione, da cucciolo di ratto intera, fetta in vitro contenenti le radichette XII.

Il metodo presentato qui consente un ricercatore interessato ad ottenere fette ritmicamente attivi del tronco cerebrale in modo riproducibile e affidabile tagliare una fetta valida, robusta che permette la registrazione di uscita motore fittizia per molte ore. Tutti gli elementi del circuito neurale minimamente necessarie per la generazione e trasmissione di ritmo inspiratorio può essere catturati in una fetta sottile utilizzando questo metodo. Questi elementi includono: preBötzinger comp...

Questo protocollo sia visivamente comunica la preparazione del tronco cerebrale-spinale e chiarisce la preparazione di sezioni trasversali del tronco cerebrale in maniera completa e dettagliata. È stato progettato per aumentare la riproducibilità e aumentare la probabilità di ottenere fette praticabile, duraturi, ritmicamente-attivo per la registrazione di output neurali dalle regioni respiratori del tronco cerebrale.

Preparazione di ritmicamente-attivo In Vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Questo metodo facilita la dissezione riproducibile e l'affezione dei cervelli dei roditori per l'analisi catturata della rete respiratoria midollare miriana. Questa tecnica offre una grande flessibilità sperimentale, che consente di preparare uno sblocco in vitro o una preparazione a fette per la registrazione. Questo metodo può essere utilizzato per esperimenti di elettrofisiologia per esplorare il circuito di controllo neurale che genera ritmi respiratori e per comprendere la patologia e la disregolazione della respirazione nei roditori geneticamente modificati.Dopo la dissezione della neuraxis, trasferire rapidamente il tronco isolato dell'animale in una camera di dissezione aerata sotto un microscopio a dissezione e posizionare il tessuto dorsale verso l'alto, con l'estremità rostrale rivolta verso la parte anteriore della camera. Inchiodare il tessuto alle spalle e l'estremità più caudale del midollo spinale e fare un'incisione mesagittale attraverso il cranio seguendo la sutura parietale per evitare di danneggiare la corteccia e il tronco encefalico sottostante il cranio. A partire dalla sutura sagittale e lavorando lateralmente, tagliare le suture occipitali del cranio per c

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Slice Cultura organotipica di E18 cervello dei topi

Questo protocollo descrive un saggio organotipica fetta ottimizzato per il cervello postnatale e ad alta risoluzione time-lapse imaging di migrazione neuroblasti nel flusso migratorio rostrale.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Questo è un protocollo di preparare e mantenere una preparazione neocorticale fetta di cultura organotipica allo scopo di effettuare registrazioni elettrica da neuroni piramidali.

Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

Questa relazione dimostra una tecnica per isolamento meccanico di singoli neuroni vitali mantenendo attaccato boutons presinaptica. Vibrodissociated neuroni hanno il vantaggio di una produzione rapida, eccellente controllo farmacologico e migliorato lo spazio-clamp senza influenza dalle cellule vicine. Questo metodo può essere utilizzato per l'imaging di elementi sinaptica e di patch-clamp registrazione.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Un metodo per generare fette organotipica dal mesencefalo murino embrionale E12.5 è descritto. Le culture fetta organotipica può essere usato per osservare il comportamento dei neuroni dopaminergici o di altri neuroni del mesencefalo ventrale.

Culture Slice organotipica del mesencefalo ventrale embrionali: un sistema per studiare dopaminergici sviluppo neuronale In vitro</em

Questo video mostra registrazioni elettrofisiologiche di preparazioni isolate del tronco encefalico-midollo spinale da roditori appena nati. Il preparato viene posto in una camera di registrazione e le esplosioni inspiratorie dal tronco encefalico vengono registrate in condizioni di ossigenazione e privazione di ossigeno utilizzando la quarta radice nervosa ventrale nel midollo spinale.

Registrazioni elettrofisiologiche di preparazioni del tronco encefalico-midollo spinale da un roditore appena nato

L'unità respiratoria centrale si trova nel tronco encefalico. L'output motorio respiratorio spontaneo da un midollo encefalico isolato viene registrato posizionando un elettrodo sulla quarta radice ventrale. Questo approccio sperimentale è prezioso per indagini farmacologiche o per la valutazione di sfide respiratorie e manipolazioni genetiche sul comportamento motorio ritmico.

Elettrofisiologia su isolati tronco cerebrale, midollo spinale Ammassi di Newborn Roditore Consente Neural Network respiratoria registrazione Uscita

Mostriamo come preparare le fette oblique del midollo spinale nei topi giovani. Questa preparazione consente la stimolazione delle radici ventrali.

La preparazione di Oblique Spinal Cord Fette per ventrale Root Stimolazione

Qui, descriviamo i passi essenziali per le registrazioni di cellule intere patch-clamp fatta da neuroni di sostanza gelatinosa (SG) nella fetta di midollo spinale in vitro . Questo metodo consente la proprietà intrinseca della membrana, la trasmissione sinaptica e la caratterizzazione morfologica dei neuroni di SG per essere studiato.

Preparazione delle fette Acute del midollo spinale per la registrazione di cellule intere Patch-clamp in neuroni di sostanza Gelatinosa

L'integrazione di diversi input sinaptici ai neuroni è meglio misurata in una preparazione che preserva tutti i nuclei pre-sinaptici per la tempismo naturale e la plasticità del circuito, ma le fette cerebrali in genere tagliano molte connessioni. Abbiamo sviluppato una fetta cerebrale modificata per imitare l'attività del circuito in vivo mantenendo la capacità di sperimentazione in vitro.

Preparazione della fetta di cuneo in vitro per imitare la connettività del circuito neuronale in vivo

Qui presentiamo un protocollo per ottenere fette uditive non coronali del tronco cerebrale dell'embrione di pollo per lo studio delle proprietà tonotopiche e delle traiettorie di sviluppo all'interno di una fetta del tronco cerebrale. Queste sezioni includono sezioni sagittali, orizzontali e orizzontali/trasversali che comprendono regioni tonotopiche più grandi all'interno di un singolo piano di fette rispetto alle sezioni coronali tradizionali.

Affettare il tronco cerebrale uditivo embrionale del pollo per valutare gradienti tonotopici e microcircuiti

Impara a preparare fette ritmicamente attive di tronco encefalico-spinale neonatale di roditore per studiare i circuiti neurali respiratori. Questo metodo consente registrazioni elettrofisiologiche riproducibili del complesso pre-Botzinger.

Preparazione di ritmicamente-attivo In Vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile

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