Preparazione di ritmicamente-attivo In Vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile

Questo metodo facilita la dissezione riproducibile e l'affezione dei cervelli dei roditori per l'analisi catturata della rete respiratoria midollare miriana. Questa tecnica offre una grande flessibilità sperimentale, che consente di preparare uno sblocco in vitro o una preparazione a fette per la registrazione. Questo metodo può essere utilizzato per esperimenti di elettrofisiologia per esplorare il circuito di controllo neurale che genera ritmi respiratori e per comprendere la patologia e la disregolazione della respirazione nei roditori geneticamente modificati.

Dopo la dissezione della neuraxis, trasferire rapidamente il tronco isolato dell'animale in una camera di dissezione aerata sotto un microscopio a dissezione e posizionare il tessuto dorsale verso l'alto, con l'estremità rostrale rivolta verso la parte anteriore della camera. Inchiodare il tessuto alle spalle e l'estremità più caudale del midollo spinale e fare un'incisione mesagittale attraverso il cranio seguendo la sutura parietale per evitare di danneggiare la corteccia e il tronco encefalico sottostante il cranio. A partire dalla sutura sagittale e lavorando lateralmente, tagliare le suture occipitali del cranio per creare lembi di osso che possono essere riflessi e appuntati per ancorare e stabilizzare la parte rostrale del cranio.

Dopo aver riflettuto entrambi i lembi craschi, asportare il resto della corteccia cerebrale, lasciando la porzione caudale del cervelletto relativamente intatta per eseguire una laminectomia dorsale. Utilizzare micro forbici a molla e forcep per rimuovere la muscolatura che circonda il cranio e la colonna vertebrale. Rimuovere il tessuto lungo il lato dorsale della gabbia toracica, lasciando intatte le costole e tagliando con cura i processi laterali della lamina vertebrale.

Dopo aver tagliato via qualsiasi tessuto che sovrascriva i pon e il midollo, i vermi, il cervelletto, i pons e l'inizio del midollo spinale, saranno chiaramente visibili. Per eseguire una laminectomia ventrale, posizionare il tessuto dorsale verso il basso e pin alla gabbia toracica e all'estremità più caudale della colonna vertebrale. Utilizzare i lembi del cranio per fissare il lato rostrale del tessuto e rimuovere la metà ventrale della gabbia toracica, incluso lo sterno e tutti gli organi addominali.

Sezionare il tessuto molle attaccato alla gabbia toracica per esporre le costole e il midollo spinale e rimuovere la lingua, l'esofago, la trachea, la laringe e tutti gli altri tessuti molli e la muscolatura sovrascrivono la base del cranio e della colonna vertebrale. Al fine di identificare il pallet duro, sezionare il tessuto sovrascritto questa piastra rettangolare di osso alla base del cranio, che include un'indentazione a forma di V. Quindi tagliare lungo la linea mediana del pallet, sollevando attentamente il tessuto verso l'alto ed eseguire un taglio trasversale per rimuoverlo.

Per iniziare una laminectomia ventrale, rimuovere la lamina, esponendo la superficie ventrale del tronco encefalico e del midollo spinale dalla prima vertebra cervicale approssimativamente alla vertebra toracica sette e tagliare da cinque a 10 millimetri lungo entrambi i lati della colonna vertebrale alla lamina. Quando il midollo spinale è stato esposto, tagliare le radichettazioni di circa 20-25 millimetri bilateralmente, lungo la colonna vertebrale a circa T7 e sollevare con cura il bordo rostrale di C1, C2 e C3 con forcende unte o piegate per consentire lo snipping sotto l'osso per la rimozione delle tre vertebre. Quando la lunghezza desiderata del midollo spinale è stata isolata dalla colonna vertebrale, effettuare un taglio trasversale per rimuovere il tessuto del midollo spinale.

Dopo aver rimosso la dura, posizionare il tronco encefalico al centro della piattaforma di paraffina sul blocco di taglio di plastica e utilizzare perni di insetti fini, tagliati a non più di un centimetro di lunghezza per fissare l'estremità caudale del tronco encefalico attraverso il midollo spinale distale. Quindi allineare il blocco di taglio coperto di paraffina con il tronco encefalico appuntato nel supporto del blocco Vibratone, in modo che la lama tagli perpendicolarmente alla faccia rostrale del tronco encefalico. Successivamente, fare una fetta iniziale per rimuovere da 200 a 300 micrometri di tessuto estraneo irregolare sull'estremità più rostrale del tessuto, apportando piccole regolazioni se necessario per garantire linearità PARP e piccoli tagli per rimuovere qualsiasi tessuto irregolare.

Le radichettazioni glossofaringe diventeranno visibili sul bordo laterale del tronco encefalico, taglieranno una fetta di tronco encefalico da 300 a 500 micrometri da questi marcatori neuroanatomici rostrali per catturare il complesso pre-Botzinger e i circuiti di trasmissione associati. Tutte le fasi della procedura di affettare sono fondamentali per creare una fetta riproducibile e praticabile, con tutti i circuiti neuronali necessari nell'orientamento corretto per produrre un ritmo robusto. Tutti gli elementi del circuito neurale minimamente necessari per generare e trasmettere il ritmo inspiratorio possono essere catturati in una fetta sottile usando questo metodo.

Compreso il complesso pre-Botzinger, i pre-motoneuroni che si proiettano ai motoneuroni ipoglossici e alle radichettazioni nervose ipoglossali. Il complesso pre-Botzinger, l'ipoglossiale o la dodicesima radice nervosa cranico e le radichettazioni nervose C4 possono quindi essere utilizzati per la registrazione inspiratoria. L'aspetto chiave di questa procedura è l'attento isolamento dei radichette e la conferma che il tronco encefalico non è danneggiato prima di tagliare la fetta finale.

Seguendo questa procedura, le registrazioni di elettrofisiologia possono essere effettuate utilizzando metodi di patch clamp, registrazioni cellulari extra o elettrodi di aspirazione per registrare l'attività elettrica prodotta dalla rete. I protocolli pubblicati in precedenza hanno fornito pochi dettagli passo-passo, rendendo difficile per i nuovi ricercatori utilizzare questo metodo senza recarsi in un altro laboratorio e trascorrere del tempo con un investigatore edito.