Name: Indagine di bio-energetica di Candida albicans utilizzando extracellulare Flux analisi Real-Time (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Scopri come misurare la respirazione mitocondriale e la glicolisi in Candida albicans senza purificazione, utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare. Questo metodo semplifica lo studio del metabolismo fungino.

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Ricerca nel laboratorio di NC è sostenuta da una sovvenzione del National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 e una sovvenzione di New Jersey Health Foundation (NJHF), n #PC40-18.

Nota: Il protocollo dettagliato e graduale del dosaggio è descritto di seguito, e il protocollo schematico è illustrato nella Figura 1.
1. ceppi di c. albicans e le condizioni di crescita
<ol><li>Crescono i ceppi di c. albicans in terreno liquido di lievito estratto-Peptone-destrosio (YPD) a 30 °C in un agitatore incubatore durante la notte. Nota: Mantenere ceppi di Candida come gli stock congelati e crescono sull'agar YPD (1% di Estratto di lievito, 2% di peptone, destrosio di 2% e 2% agar).</li>
</ol>2. preparazione dei reagenti
<ol><li>Preparare il supporto di test come segue:<ol>
<li>Per l'analisi di funzione mitocondriale, sciogliere la polvere di 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1,04 g e 2 g di glucosio (2%) in 90 mL di acqua sterile e caldo i media a 37 ° C. Regolare il pH a 7.4 utilizzo 5 M NaOH e portare il volume a 100 mL con acqua sterile.</li>
		<li>Per l'analisi di stress glicolitico, sciogliere 1,04 g polvere di RPMI 1640 sola in 90 mL di acqua sterile, caldo i media a 37 ° C e regolare il pH a 7,4. Portare il volume a 100 mL con acqua sterile. Polvere di RPMI 1640 non ha nessun bicarbonato, che è fondamentale per monitorare il cambiamento di pH come misura della glicolisi durante il dosaggio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Composti di iniezione.<ol>
<li>Preparare 1 M brodo di glucosio in acqua sterile e conservare a-20 ° C.</li>
		<li>Preparare 100 mM oligomycin stock in dimetilsolfossido (DMSO), aliquota in piccoli volumi e conservare a-20 ° C.</li>
		<li>100 mM antimycin A stock in DMSO, aliquota in piccoli volumi di preparare e conservare a-20 ° C.</li>
		<li>Preparare 100 mM SHAM (acido salicylhydroxamic) magazzino in etanolo il giorno del test.</li>
		<li>Preparare 1 M KCN in acqua sterile il giorno del test.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. rivestimento della piastra dosaggio con poli-D-lisina (PDL)
Nota: Eseguire tutti i passaggi in una cappa laminare qui sotto.
<ol><li>Sciogliere Poly-D lisina in acqua di grado di coltura del tessuto per ottenere la concentrazione finale di 50 µ g/mL. Mescolare bene e aliquota in una microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a-20 ° C per il lungo termine. Nota: 50 µ l per pozzetto è necessaria, e per 24 pozzetti, sono necessari 1,2 mL. Di conseguenza, aliquota almeno 1.3 mL / tubo del microcentrifuge.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l per pozzetto e incubare a temperatura ambiente con il coperchio coperto per 1-2 h.</li>
	<li>Aspirare la soluzione e sciacquare una volta con acqua grado di 500 µ l sterili per coltura.</li>
	<li>Aprire il coperchio e lasciare asciugare i pozzetti per aria. Utilizzare la piastra sullo stesso giorno o conservare a 4 ° C per un massimo di 2-3 giorni.</li>
</ol>4. idratazione della cartuccia sensore
Nota: Eseguire questo passaggio un giorno prima dell'esperimento.
<ol><li>Aprire il flusso supplementare Assay Kit e rimuovere il contenuto. Posizionare la cartuccia sensore testa in giù accanto alla piastra di utilità (Figura 2).</li>
	<li>Riempire ciascun pozzetto della piastra utilità con 1 mL di calibratore ed inserire la cartuccia sensore indietro. Assicurarsi che i sensori contenenti fluorofori (per misurare l'ossigeno e pH) sono sommerse nel calibratore.</li>
	<li>Incubare la cartuccia sensore durante la notte in un non-CO2 in incubatore a 37 ° C.</li>
</ol>5. la coltivazione e semina di cellule nelle piastre rivestite con PDL
<ol><li>Inoculare i albicans del c. nel brodo YPD e crescere durante la notte a 30 ° C in un agitatore a 200 giri/min. Nota: In base alla progettazione di dosaggio e l'interesse, albicans del c. possono anche essere coltivate in YPG o terreno minimo.</li>
	<li>Il giorno del test, diluire un numero adeguato di cellule in medium di analisi per ottenere una concentrazione finale di 100.000 cellule per 100 µ l.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l delle cellule diluite in ciascun pozzetto della piastra saggio tranne che nei pozzetti A1, B4, C3 e D6, in cui aggiungere solo 100 µ l di medium di analisi per la correzione del fondo (Figura 3).</li>
	<li>Il piano di trasferimento per un non-CO2 incubatore a 37 ° C ed incubare per 60 min, che vi permetterà le cellule di aderire alla superficie della placca.</li>
</ol>6. protocollo di analisi
Nota: Il protocollo descritto qui è per il formato a 24 pozzetti dello strumento. Volumi dovranno essere corretti se viene utilizzato un altro formato.
<ol><li>Analisi della funzione mitocondriale<ol>
<li>Preparazione di composti<ol>
<li>Preparare composti alla concentrazione di 10 x per l'analisi di funzione mitocondriale: preparare 20 mM SHAM, 100 µM Oligomycin, 100mm KCN e 20 µM Antimycin A nel medium di analisi corrispondente.</li>
			<li>Aggiungere 50 µ l SHAM in porta A, 55 µ l Oligomycin nella porta B, 62 µ l KCN in porta C e 68 µ l Antimycin A porta D (Figura 4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi di stress glicolitico<ol>
<li>Preparazione di composti<ol>
<li>Preparare composti alla concentrazione di 10 x per l'analisi di stress glicolitico. Preparare 100 mM glucosio, 100 µM Oligomycin, 500 mM 2-deossi glucosio (2DG) e 20 µM Antimycin A nel medium di analisi corrispondente.</li>
			<li>Aggiungere il glucosio di 50 µ l in porta A, 55 µ l Oligomycin nella porta B, 62 µ l 2-DG in porta C e 68 µ l Antimycin A porta D.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impiegano analizzatore di flusso supplementare, che misura il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) di cellule vive in un formato di piastra a 24 pozzetti. Impostare il protocollo di dosaggio in anticipo.</li>
	<li>Aprire l'analizzatore di flusso supplementare e impostare il modello di analisi utilizzando la scheda di analisi guidata e seguire passo per passo le istruzioni per compilare tutte le informazioni che fuoriesce durante l'installazione. Generare il layout del gruppo come simile a illustrato nella Figura 5. Impostare il protocollo, come illustrato nella tabella 1. Impostare questi layout ben in anticipo prima del dosaggio e salvare nel computer. Al momento dell'analisi, è necessario ripristinare il protocollo salvato aprendo il file corrispondente nell'opzione Apri file nella scheda di creazione guidata di dosaggio (Figura 5).</li>
	<li>I composti di 10 volte le rispettive porte della cartuccia sensore idrata contenente il calibratore di caricare e caricare nel vassoio portante dell'analizzatore flusso supplementare. Avviare la calibrazione premendo il tasto Start sullo schermo.</li>
	<li>Aggiungere 350 µ l di medium di analisi delicatamente alla piastra cellulare lungo il lato dei pozzetti per ridurre al minimo la dispersione delle cellule per portare il volume finale a 450 µ l.</li>
	<li>Sostituire la piastra di utilità che contiene il calibratore con la piastra di dosaggio e continuare.</li>
	<li>Rimuovere la cartuccia del sensore e la piastra una volta completato il test. Salvare il file nella cartella di destinazione appropriata.</li>
</ol>7. analisi dei dati
<ol><li>Utilizzare l'area sotto la curva - analisi della varianza (AUC-ANOVA) scheda analisi del software per calcolare la differenza significativa tra i gruppi selezionando i rispettivi parametri (OCR o ECAR) come mostrato nella Figura 6.</li>
	<li>Selezionare i gruppi che devono essere confrontati.</li>
	<li>Aggiungere ai gruppi di analisi per ANOVA e fare clic su Ok. Nota: Questa analisi ANOVA AUC aggiungerà un nuovo foglio del file in cui l'AUC è calcolato per ogni gruppo e rispetto tra di loro mediante ANOVA. Questo vi darà una tabella di valori di p per mostrare il significato.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+killers%3A+human+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li>
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<li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li>
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<li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

La bioenergetica analisi flusso supplementare serve come un ottimo strumento per leggere la funzione mitocondriale misurando la fosforilazione ossidativa (OXPHOS)-consumo di ossigeno dipendenti in tempo reale. Inoltre, una funzione glicolitica che viene misurata come un tasso di acidificazione extracellulare (cambiamento del pH extracellulare) può anche essere studiata allo stesso tempo nell'analisi in tempo reale.
Placcatura successo di c. albicans nella piastra di dosaggio è uno dei...

Infezioni fungine invasive uccidono oltre 1,5 milioni di persone ogni anno in tutto il mondo. Questo numero è in aumento a causa di un aumento del numero di persone che vivono con immunità compromessa, inclusi i neonati prematuri, anziani, destinatari del trapianto e cancro pazienti1. C. albicans è un patogeno opportunista di fungo umano che fa parte della microflora umana. Abita anche le superfici mucose e il tratto gastrointestinale come un organismo commensale. C. albicans produce malattia sistemica grave in persone che hanno deficit immunitari, che hanno subito la chirurgia, o che sono state trattate con lunghi cicli di antibiotici. Il rango di specie di Candida tra le tre cause principali di malattie infettive nosocomiali (NID) in esseri umani2,3,4,5,6,7. Il numero globale annuale delle infezioni da Candida flusso sanguigno è stimata intorno a ~ 400.000 casi, con mortalità associata di 46-75%1. La mortalità annua a causa della candidosi è all'incirca 10.000 negli Stati Uniti da solo. Nella misura del NID causate da funghi si riflette anche nella astronomico spese paziente5. Negli Stati Uniti, la spesa annua per il trattamento di infezioni fungine invasive supera $ 2 miliardi, l'aggiunta di uno sforzo enorme per sistema sanitario già oberati di lavoro. Attualmente, le terapie antifungine standard disponibili sono limitate a causa di tossicità, sempre più diffuso di farmacoresistenza e interazioni farmaco-farmaco. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di identificare nuovi bersagli di farmaco antifungino che si tradurrà in migliori opzioni di trattamento per pazienti ad alto rischio. Tuttavia, la scoperta di nuovi farmaci che agiscono su bersagli fungine è complicata perché i funghi sono eucarioti. Questo limita notevolmente il numero di bersagli farmacologici specifici fungine.
Recenti studi hanno indicato che i mitocondri sono un contributo critico alla virulenza fungina e la tolleranza alle droghe antifungose poiché i mitocondri sono importanti per la respirazione cellulare, il metabolismo ossidativo, trasduzione del segnale e apoptosi8 ,9,10,11. Metabolismo glicolitico sia non-glicolitico sono essenziali per la sopravvivenza dei albicans del c. nel mammifero ospite12,13,14,15,16. Inoltre, diversi mutanti di c. albicans carente di proteine mitocondriali, come Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 ecc. sono stati indicati per essere difettoso in filamentazione, un fattore di virulenza importante di albicans del c.17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Inoltre, questi mutanti inoltre sono stati indicati per essere attenuato per virulenza in un modello murino di diffusi candidosi17,18,19,20,21 ,22. Così, i mitocondri fungini rappresentano un obiettivo attraente per la scoperta di nuovi farmaci. Tuttavia, lo studio della funzione mitocondriale in c. albicans è impegnativo, perché c. albicans è petite negativo23, che significa che essa non può sopravvivere senza il genoma mitocondriale.
Qui, descriviamo un protocollo che può essere utilizzato per studiare la funzione mitocondriale e glicolitica a albicans del c. senza la necessità di purificare i mitocondri. Questo metodo può anche essere ottimizzato per studiare l'effetto della manipolazione genetica o modulatori chimici sulle vie mitocondriale e glicolitiche in c. albicans.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>MT50020PB</td><td></td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit stress Mito</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Calbiochem</td><td>495455</td><td></td></tr><tr><td>pHmetro</td><td>Accumet</td><td>AR20</td><td></td></tr><tr><td>Rosso fenolo</td><td>Sigma</td><td>P5530</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Santa cruz</td><td>203242</td><td></td></tr><tr><td>cavalluccio marino XF24 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>SHAM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Amresco&nbsp;</td><td>241</td><td></td></tr><tr><td>Pellet di idrossido di sodio</td><td>J.T Baker</td><td>3722</td><td></td></tr><tr><td>Acqua per colture tissutali</td><td>Gibco</td><td>1523-0147</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione calibrante per test XF</td><td>Agilent</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito Peptone Destrosio</td><td>Fisher scientific,</td> <td>BP2469</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito Peptone Destrosio Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito Peptone Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr></tbody></table>

indagine di bio-energetica di candida albicans utilizzando extracellulare flux analisi real-time

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

I mitocondri sono organelli essenziali per il metabolismo cellulare e la sopravvivenza. Una varietà di eventi chiave si svolgono nei mitocondri, come la respirazione cellulare, il metabolismo ossidativo, trasduzione del segnale e apoptosi. Di conseguenza, la disfunzione mitocondriale è segnalata per svolgere un ruolo importante nella tolleranza al farmaco antifungino e virulenza dei patogeni fungini. Dati recenti hanno anche portato al riconoscimento dell'importanza dei mitocondri come un importante contributo alla patogenesi fungine. Nonostante l'importanza dei mitocondri in biologia fungina, sono scarsamente sviluppati metodi standardizzati per capire la sua funzione. Qui, presentiamo una procedura per studiare il tasso di consumo di ossigeno basale (OCR), una misura della respirazione mitocondriale e tassi di acidificazione extracellulare (ECAR), una misura della funzione glicolitica in ceppi di c. albicans . Il metodo descritto qui può essere applicato per eventuali ceppi Candidaspp. senza la necessità di purificare i mitocondri da cellule fungine intatte. Inoltre, questo protocollo può anche essere personalizzato alla schermata per inibitori della funzione mitocondriale in ceppi di c. albicans .

Il fuoco di questo protocollo è quello di determinare le funzioni bioenergetiche di albicans del c. valutata dall'analizzatore di flusso supplementare. Un mutante di albicans del c. che mancano della proteina mitocondriale Mam33 inoltre è incluso insieme al relativo sforzo di complemento, mam33Δ/Δ::MAM33 per studiare gli effetti dell'eliminazione di una proteina mitocondriale su OCR ed ECAR. MAM33 codifica per una proteina di matrice silicea mitocondria...

Qui, presentiamo un protocollo graduale per studiare la respirazione mitocondriale e la funzione glicolitica in Candida Albicans utilizzando un analizzatore di flusso supplementare.

Indagine di bio-energetica di Candida albicans utilizzando extracellulare Flux analisi Real-Time

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

Questo protocollo è significativo per determinare la funzione glicolitica e la respirazione mitocondriale in Candida albicans. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di misurare la funzione mitocondriale senza la necessità di purificare i mitocondri dagli albicani di Candida. Questo metodo può essere ottimizzato per indagare gli effetti della manipolazione genetica o dei modulatori chimici sulle vie mitocondriali e glicolitiche negli albicani Candida o in altri agenti patogeni fungini.Questa tecnica è relativamente semplice. O a seconda dell'organismo, il loro uso può aiutare a ottimizzare il numero di cellule e la concentrazione di inibitori mitocondriali nel loro saggio. In una cappa di flusso laminare, sciogliere la poli-D-lisina nell'acqua della griglia tissutale fino a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro.Mescolare bene la soluzione e aliquotarla in tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri assicurandosi di aliquota di almeno 1,3 millilitri per tubo. Aggiungere 50 microlitri di questa miscela a ciascun pozzo della piastra di dosaggio, coprire il coperchio e incubare a temperatura ambiente per una o due ore. Quindi aspirare la soluzione.Risciacquare i pozzi della piastra di dosaggio una volta con 500 microlitri di acqua sterile di coltura tissutale, aprire il coperchio e lasciare asciugare all'aria i pozzi. Se non si utilizza il piatto il giorno in cui viene preparato, conservarlo a quattro gradi Celsius per un massimo di due o tre giorni. Il giorno prima dell'esperimento, aprire il kit di dosaggio del flusso extra e rimuovere il contenuto.Posizionare la cartuccia del sensore capovolta accanto alla piastra di utilità. Riempire ogni pozzo della piastra di utilità con un millilitro di calibrant e quindi riposizionare la cartuccia del sensore. Assicurarsi che i sensori che contengono fluorofori siano immersi nel calibante.Incubare la cartuccia del sensore a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica durante la notte. Il giorno prima del saggio, inoculare gli albicani C preparati nel brodo YPD e crescere durante la notte a 30 gradi Celsius in uno shaker a 200 giri/min. Il giorno del saggio, diluire un numero appropriato di cellule nel mezzo di dosaggio per produrre una concentrazione finale di 100.000 cellule per 100 microlitri.Aggiungere 100 microlitri delle cellule diluite in ogni pozzo della piastra di dosaggio ad eccezione dei pozzi A1, B4, C3 e D6. A questi pozzi, aggiungere solo 100 microlitri di mezzo di dosaggio per la correzione dello sfondo. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica per 60 minuti per lasciare che le cellule aderiscano alla superficie della piastra. Preparare i composti per il saggio della funzione mitocondriale a concentrazione 10X nel mezzo di dosaggio corrispondente come delineato nel protocollo di testo.Aggiungere 50 microlitri di SHAM nella porta A, 50 microlitri di Oligomicina nella porta B, 62 microlitri di cianuro di potassio nella porta C e 68 microlitri di antimicina A nella porta D.Successivamente, preparare i composti per il saggio di stress glicolitico a concentrazione 10X nel mezzo di dosaggio corrispondente come delineato nel protocollo di testo. Aggiungere 50 microlitri di glucosio alla porta A, 55 microlitri di Oligomicina nella porta B, 62 microlitri di 2-DG nella porta C e 68 microlitri di Antimicina A nella porta D.Prima del test, aprire l'analizzatore di flusso aggiuntivo e impostare il modello di saggio utilizzando la scheda della procedura guidata di dosaggio. Seguire le istruzioni dettagliate e compilare tutte le informazioni visualizzate durante l'installazione.Generare un layout di gruppo e impostare il protocollo come descritto nel protocollo di testo. Salvare questi layout prima del test. Al momento del test, ripristinare il protocollo salvato aprendo il file corrispondente nell'opzione open file nella scheda creazione guidata test.Quindi caricare i composti 10X nelle rispettive porte della cartuccia del sensore idratata contenente il calibrant. Caricare la cartuccia del sensore nel vassoio portante dell'analizzatore di flusso aggiuntivo. Avviare la calibrazione facendo clic sul pulsante start sullo schermo.Successivamente, aggiungere delicatamente 350 microlitri del mezzo di dosaggio alla piastra cellulare lungo il lato delle pareti per ridurre al minimo il disturbo cellulare portando il volume finale a 450 microlitri. Sostituire la piastra di utilità contenente il calibrant con la piastra di dosaggio e continuare il saggio. Una volta completato il test, rimuovere la cartuccia del sensore e la piastra.Salvare il file nella cartella di destinazione appropriata. In questo studio, le funzioni bio-energetiche degli albicani C sono valutate dall'analizzatore di flusso extra. Un mutante privo della proteina mitocondriale mam33 è anche incluso insieme al suo ceppo complementare per studiare gli effetti della cancellazione di una proteina mitocondriale sul tasso di consumo di ossigeno e sui tassi di acidificazione extracellulare.Il tipo selvatico C albicans mostra un tasso di consumo di ossigeno di 145 picomoli al minuto che è ben all'interno dell'intervallo ottimale per qualsiasi saggio di flusso extracellulare. Il tasso di consumo basale di ossigeno del tipo selvatico, i ceppi mutanti mam33 e mam33 non mostrano differenze. Allo stesso modo, non si vedono differenze significative nei tassi di acidificazione extracellulare basale tra i ceppi.Tuttavia, inibendo il complesso IV con cianuro di potassio, il tipo selvatico e il mutante mam33, i ceppi integrati mam33 mostrano uno spostamento significativo verso la glicolisi. Il ceppo mutante mam33 tuttavia non ha mostrato uno spostamento glicolitico compensativo che suggerisse che la via dipendente dal composto IV è compromessa in questo ceppo. Nella prova di stress glicolitico, le cellule sono affamate di glucosio per un'ora e viene misurato il tasso di consumo basale di ossigeno e il tasso di acidificazione extracellulare.Dopo la fame, il ceppo mutante mam33 mostra un consumo significativamente inferiore di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare rispetto agli altri ceppi. Ciò suggerisce un uso alterato del glucosio sia per la respirazione che per la glicolisi quando le cellule sono costrette alla condizione di fame. Dopo aver iniettato glucosio, tutti i ceppi mostrano stimolazione sia del loro tasso di consumo di ossigeno che del tasso di acidificazione extracellulare.Il rivestimento della piastra di dosaggio consente alle cellule di Candida albicans di aderire alla piastra. L'aderenza impropria delle cellule di Candida albicans influenzerà il risultato del test. Dopo lo sviluppo di questa tecnica, è stato impiegato in una vasta gamma di tipi cellulari e malattie affrontando come funzionano i mitocondri durante le condizioni fisiologiche e patologiche.Ad esempio, impiegando cellule derivate dal paziente e di controllo in questo saggio, è possibile affrontare le domande specifiche su come la funzione mitocondriale viene alterata. Prestare attenzione durante la preparazione di inibitori mitocondriali come cianuro di potassio e antimicina A perché questi composti sono estremamente velenosi.

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Questo protocollo fornisce un approccio biochimico per misurare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR) delle cellule leucemiche primarie con saggio del flusso extracellulare. La valutazione del profilo metabolico di queste cellule aiuta a caratterizzare le loro richieste, portando a una terapia personalizzata.

Saggio del flusso extracellulare: un metodo per misurare il profilo metabolico delle cellule

Questo video dimostra il metodo per analizzare il metabolismo energetico nelle cellule NK umane attivate utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Diversi inibitori dei complessi della catena di trasporto degli elettroni influenzano la sintesi di ATP, che viene misurata attraverso il tasso di consumo di ossigeno o OCR, fornendo informazioni sul metabolismo cellulare e sulla bioenergetica.

Monitoraggio in tempo reale del metabolismo energetico nelle cellule NK umane utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare

Questa tecnica viene descritto la registrazione in tempo reale del consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare nei tessuti retinici explanted del mouse utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare.

Misurazione del metabolismo energetico in tessuto retinico Explanted usando l'analisi di flusso extracellulare

Il metodo qui presentato riassume i protocolli ottimizzati per la valutazione della bioenergetica cellulare nelle cellule staminali ematopoietiche non aderenti del topo e nelle cellule progenitrici primitive (HSPC) utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare per misurare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR) degli HSPC in tempo reale.

Valutazione della bioenergetica cellulare in cellule staminali ematopoietiche di topo e progenitrici primitive utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare

Il saggio del flusso metabolico cellulare in tempo reale misura il tasso di consumo di ossigeno e il tasso di acidificazione extracellulare, che corrisponde alla produzione di adenosina trifosfato mitocondriale e glicolitica, utilizzando sensori di pH e ossigeno. Il manoscritto spiega un metodo per comprendere lo stato energetico degli osteoblasti e la caratterizzazione e l'interpretazione dello stato bioenergetico cellulare.

Utilizzo dell'analizzatore di flusso metabolico cellulare in tempo reale per monitorare la bioenergetica degli osteoblasti

Questi protocolli aiuteranno gli utenti a sondare il metabolismo energetico mitocondriale negli sferoidi derivati dalla linea cellulare del cancro 3D utilizzando l'analisi del flusso extracellulare di Cavalluccio marino.

Esplorazione del metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi microtessuati 3D utilizzando l'analisi del flusso extracellulare

Descriviamo protocolli graduali che misurano la respirazione mitocondriale di neutrofili di topo e umani e cellule HL60 utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare metabolico.

Misurazione in tempo reale del profilo bioenergetico mitocondriale dei neutrofili

L'abuso di alcol compromette l'immunità dei macrofagi alveolari (AM) a causa della soppressione della respirazione mitocondriale e della bioenergetica. Recentemente abbiamo dimostrato che l'esposizione all'etanolo (EtOH) aumenta la dipendenza dalla glutammina per la respirazione mitocondriale nelle AM. In questo articolo, vengono forniti metodi per determinare l'uso della glutammina per la respirazione mitocondriale nelle AM trattate con EtOH utilizzando un bioanalizzatore di flusso...

Valutazione della glutammina come fonte di combustibile per macrofagi alveolari esposti a etanolo cronico utilizzando un bioanalizzatore di flusso extracellulare

Qui, descriviamo in dettaglio i metodi per estrarre i macrofagi dal midollo osseo, dalla milza e dal cuore infartuato e successivamente valutare il flusso metabolico nelle cellule vive.

Analisi del flusso metabolico ex vivo nei macrofagi splenici e cardiaci e nei monociti del midollo osseo

Questo protocollo utilizza un reporter bioluminescente, che consente di misurare l'attività trascrizionale in Saccharomyces eubayanus per monitorare la transizione da glucosio a maltosio, consentendo l'analisi in tempo reale degli adattamenti metabolici e supportando l'ottimizzazione del ceppo per la fermentazione industriale in diverse condizioni.

In vivo Monitoraggio dell'attività trascrizionale durante la transizione metabolica mediante un reporter bioluminescente nel lievito

Questo protocollo descrive un modo conveniente per eseguire un test di sforzo per la glicolisi al fine di quantificare la riprogrammazione metabolica nella microglia primaria del topo. Dopo l'isolamento e la stimolazione infiammatoria, il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) viene misurato utilizzando reagenti appena preparati e regolati per il pH, seguiti dalla normalizzazione proteica per consentire una valutazione accurata e riproducibile degli spostamenti glicolitici.

Indagine della glicolisi nella microglia primaria tramite test di flusso extracellulare

Scopri come misurare la respirazione mitocondriale e la glicolisi in Candida albicans senza purificazione, utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare. Questo metodo semplifica lo studio del metabolismo fungino.

Indagine di bio-energetica di Candida albicans utilizzando extracellulare Flux analisi Real-Time

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