Name: Cellule di Merkel Polyomavirus infezione e rilevamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Impara a isolare fibroblasti dermici umani e infettarli con Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV). Questo protocollo utilizza immunofluorescenza e ibridazione in situ per studiare il ciclo virale senza artefatti da sovraespressione.

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Gli autori vorrei ringraziare il Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) e Dr. M. Celeste Simon (University of Pennsylvania) per la fornitura di reagenti e supporto tecnico. Ringraziamo anche i membri dei nostri laboratori di discussione utile. Questo lavoro è stato supportato dalle borse di studio del National Institutes of Health (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 e R01CA142723), il NCI Cancer Center Support Grant (NCI P30 CA016520) e il premio di Penn CFAR (P30 AI 045008).

Prepuzi neonatale umane sono stati ottenuti da Penn pelle malattia Research Center. Fibroblasti umani adulti sono stati ottenuti da pelle normale scartata dopo la chirurgia. Tutti i protocolli sono stati approvati dall'Università della Pennsylvania Institutional Review Board.
1. isolamento dei fibroblasti cutanei umani
<ol><li>Utilizzare un paio di forbici per tagliare il grasso e del tessuto sottocutaneo dal prepuzio umano neonatale e tagliare il campione di pelle in metà o in quarti.</li>
	<li>Incubare il tessuto in 5 mL di dispase 10mg/mL II in PBS completati con antibiotico antimicotico a 4 ° C durante la notte.</li>
	<li>In un piatto sterile 10cm, separare con cura l'epidermide dagli strati cutanei mediante microdissezione forcipe.</li>
	<li>Trasferimento il tessuto cutaneo risultante in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di collagenasi di 2 mg/mL tipo IV in FBS-libero supplementato con antibiotico antimicotico.</li>
	<li>Incubare il campione a 37 ° C in 5% CO2 per 4-6 h con agitazione periodica fino a quando rimangono solo pochi aggregati macroscopici del tessuto.</li>
	<li>Rilasciare singole cellule dal derma pipettando su e giù (triturazione) vigorosamente dieci volte con una pipetta da 10 mL.</li>
	<li>Centrifugare a 180 x g per 5 min e scartare il surnatante.</li>
	<li>Piastra le cellule dissociate in medium DMEM completate con 10% siero fetale del vitello, gli aminoacidi non essenziali di 1% e 1% L-glutammina a 37 ° C in 5% CO2.</li>
</ol>2. preparazione di virion ricombinante MCPyV
<ol><li>Digest 50 µ g di plasmide pR17b (che trasportano MCPyV genoma) con 250 U di BamHI-HF in un volume di 200 µ l (4 h a 37 ° C) per separare il genoma virale dalla spina dorsale vettoriale (Figura 2).</li>
	<li>Aggiungere 1200 µ l di tampone PB (supplementato con 10 µ l di 3 M Pierantonio, pH 5.2) al DNA digerito e purificare oltre 2 colonne di spin miniprep (capacità del DNA di 20 µ g). Eluire il plasmide pR17b digeriti da ogni colonna con 200 µ l di buffer di TE (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Preparare la reazione di legatura in una provetta da centrifuga 50 mL. Aggiungere 400 µ l di DNA plasmidico purificato dal passaggio 2.2, 8,6 mL di tampone di ligasi x T4 1.05 e 6 µ l della ligasi di alta concentrazione di T4. Incubare a 16 ° C durante la notte.</li>
	<li>Aggiungere 45 mL di tampone PB (supplementato con 10 µ l di 3 M Pierantonio, pH 5.2) per la legatura e utilizzare un collettore ad aspirazione per caricare attraverso 2 colonne di spin miniprep. Eluire ogni colonna con 50 µ l di buffer di TE. Aspettatevi una resa di circa 30 µ g di DNA.</li>
	<li>Nel tardo pomeriggio/sera, cellule di seme 6 x 106 293TT28 in 10 cm piatto contenente DMEM supplementato con 10% siero fetale di vitello, gli aminoacidi non essenziali di 1% e 1% L-glutammina senza igromicina B.</li>
	<li>La mattina successiva, assicurarsi che le celle sono circa il 50% confluenti. Transfect utilizzando 66 µ l di reagente di transfezione (1,1 µ l/cm2), 12 µ g di re-legato MCPyV isolare R17b DNA dal punto 2.4, 8,4 µ g di ST espressione plasmide pMtB e 9,6 µ g di LT espressione plasmide pADL *29.</li>
	<li>Quando le cellule transfettate sono quasi confluenti, il giorno seguente, tripsinizzano le cellule e trasferirli su un piatto di 15 cm per la continua espansione.</li>
	<li>Eventualmente prendere un piccolo numero di cellule 293TT all'espansione ed eseguire se macchiatura per MCPyV LT (CM2B4) e VP1 (MCV VP1 coniglio30) per determinare l'efficienza di trasfezione. In questa fase, nucleare LT segnale potrebbe essere visibile, ma espressione di VP1 probabilmente non sarà rilevabile.</li>
	<li>Quando il piatto di 15cm diventa quasi confluenti (solitamente 5-6 giorni dopo trasfezione iniziale), trasferire le cellule in tre piatti di 15 cm. Raccogliere le cellule dai piatti 15cm quando diventano quasi confluenti e seguire il protocollo di raccolta virus qui sotto. Nota: Facoltativamente eseguire il controllo di qualità se come descritto al punto 2.8. La maggior parte delle cellule dovrebbe essere MCPyV LT sia VP1 positivo in questa fase.</li>
	<li>Per raccogliere il virus, tripsinizzano cellule, gira a 180 x g per 5 min a RT e rimuovere il surnatante. Aggiungere un volume di pellet cellulare di DPBS-Mg (DPBS con 9,5 mM MgCl2 e 1 x antibiotico antimicotico). Quindi aggiungere solfato di ammonio di 25 mM (da una soluzione madre 1 M a pH 9) seguita da 0,5% Triton X-100 (da una soluzione madre 10%), 0,1% Benzonase e 0,1% di una dnasi ATP-dipendente. Mescolare bene e incubare a 37 ° C durante la notte.</li>
	<li>Incubare la miscela per 15 min sul ghiaccio e poi aggiungere 0.17 volume di 5 M di NaCl. Miscelare e incubare in ghiaccio per un altro 15 min Spin per 10 min a 12.000 x g in una centrifuga di 4 ° C. Se non è chiaro il supernatante, delicatamente capovolgere la provetta e ripetere il passaggio di filatura. Trasferire il surnatante in una nuova provetta.</li>
	<li>Risospendere il pellet utilizzando un volume di DPBS completati con 0,8 M di NaCl e spin di nuovo, come descritto al punto 2.11.</li>
	<li>Combinare i surnatanti dal passo 2.11 e 2.12 e girare ancora una volta come descritto al punto 2.11.</li>
	<li>Via sottostante (27%, quindi 33%, quindi 39%) pour pendenze di iodixanol in tubi a parete sottile 5ml polyallomer ~0.7 passaggi di mL utilizzando una siringa da 3 mL muniti di un lungo ago o una pipetta p1000.</li>
	<li>Caricare 3 mL di surnatante chiarificato contenenti virus sul gradiente iodixanol preparati.</li>
	<li>Spin per 3,5 h a 234.000 x g e a 16 ° C in un rotore di SW55ti. Impostare l'accelerazione e la decelerazione per rallentare.</li>
	<li>Dopo ultracentrifugazione, raccogliere 12 frazioni in tubi siliconati (ogni frazione è ~ 400 µ l).</li>
	<li>Analizzare le frazioni per la presenza di virus dsDNA reagente e/o Western blot per VP1 (MCV VP1 coniglio30). Piscina gradiente frazioni con picco dsDNA e/o contenuti di VP1 e caratterizzano lo stock mediante PCR quantitativa per calcolare l' equivalente del genoma virale31. Negozio di stock di virion di MCPyV a-80 ° C.</li>
</ol>3. infezione
<ol><li>Mantenere i fibroblasti cutanei umani primari in DMEM con 10% siero fetale del vitello, gli aminoacidi non essenziali di 1% e 1% L-glutammina. Una volta raggiunta la confluenza, split fibroblasti 1:4 senza rotazione verso il basso. Nota: Per la massima efficienza di infezione MCPyV, utilizzare fibroblasti primari tra passaggi 5 e 12 che si dividono attivamente al momento della placcatura.</li>
	<li>Per infettare i fibroblasti cutanei umani, il mezzo di aspirare e lavare le cellule con DPBS.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di 0.05% tripsina-EDTA al piatto e incubare a 37 ° C per 5-10 min.</li>
	<li>Verifica sotto il microscopio per assicurarsi che le celle sono venuta fuori il piatto.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di terreno DMEM/F12 contenente 20 ng/mL EGF, bFGF di 20 ng/mL e 3 µM CHIR99021, i quali stimolano l'infezione MCPyV24, al piatto e trasferire la soluzione di cella in una provetta da 15 mL.</li>
	<li>Rotazione verso il basso le cellule a 180 x g per 2 min e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in DMEM/F12 medium contenente 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF e 3 µm CHIR99021 a 2-4 x 104 cellule per mL.</li>
	<li>Semi di 200 µ l della sospensione delle cellule completata con tipo di 1mg/mL collagenasi IV in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Scongelare il magazzino virione MCPyV su ghiaccio. Aggiungere 109 equivalenti di genoma virale dei virions MCPyV (calcolato nel passaggio 2.18) a 1 µ l di iodixanol per ogni 2.500 a 5000 cellule essere infettati.   Toccare delicatamente il lato della piastra e posizionare la piastra nell'incubatore.</li>
	<li>Dopo incubazione a 37 ° C in 5% CO2 per 48-72 h, aggiungere 20% FBS in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Permettere che l'infezione di procedere a 37 ° C in 5% CO2 per 72-96 h.</li>
</ol>4. immunofluorescenza colorazione
<ol><li>Difficoltà cellule ottenute nel passaggio 3.9 con paraformaldeide 3% in PBS per 20 min.</li>
	<li>Lavare le cellule con PBS due volte.</li>
	<li>Incubare le cellule nel buffer blocco/permeabilizzazione (0,5% Triton X-100, 3% BSA in PBS filtrata attraverso 0,22 µm) a temperatura ambiente per 1 h.</li>
	<li>Incubare le cellule con i seguenti anticorpi primari: mouse monoclonale anti-MCPyV LT (CM2B4) (1: 1000) e anticorpo policlonale anti-MCPyV (1: 2000), VP1 di coniglio al RT per 3 h.</li>
	<li>Lavare le cellule con PBS tre volte.</li>
	<li>Incubare le cellule con gli anticorpi secondari: 594 Fluor anti-topo di capra IgG (1: 1000) e Fluor 488 capra anti-coniglio IgG (1: 500) a temperatura ambiente per 1 h.</li>
	<li>Lavare le cellule con PBS tre volte.</li>
	<li>Colorante di contrasto le cellule con 0,5 µ g/mL DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, dicloridrato).</li>
	<li>Vetrini coprioggetto di montaggio su vetro scivola e analizzare utilizzando un microscopio di fluorescenza invertito.</li>
</ol>5. In situ del DNA-HCR
Nota: Questa tecnica richiede che le cellule seminate su vetrini coprioggetti. Per questo scopo, le condizioni di infezione descritte sopra (passaggio 3) possono essere scalate al formato piastra a 24 pozzetti.
<ol><li>Difficoltà cellule coltivate sulle lamelle con 4% PFA in PBS per 10 min. lavare i vetrini coprioggetti due volte con PBS, poi trattarli con etanolo al 70% per permeabilize le cellule a 4 ° C durante la notte. Nota: I campioni fissati possono rimanere in questo stato per diversi giorni.</li>
	<li>Pre-ibridare campioni sostituendo l'etanolo con tampone di ibridazione della sonda e incubare per 60 minuti a TA.</li>
	<li>Diluire il sonde (1 µM) (tabella 1) ibridazione della sonda in soluzione tampone diluizione 1: 500 30 min prima della fine della fase di pre-ibridazione e incubare a 45 ° C.</li>
	<li>Alla fine delle incubazioni, Pipettare ~ 10 μL del mix di sonde diluito per coprire i vetrini su vetrini da microscopio. Posto i coprioggetti, cella-lato verso il basso, il loro rispettive goccioline della sonda di ibridazione mescolare. Sigillare i bordi e le parti posteriori delle lamelle per le diapositive con una quantità generosa di cemento di gomma.</li>
	<li>Impostando le diapositive sul lato piatto di un blocco di calore di calore le diapositive con le sonde aggiunto a 94 ° C per 3 min. Trasferire i vetrini in una camera umidificata e incubare a 45 ° C durante la notte. Per rendere una semplice camera umidificata, inumidire leggermente i tovaglioli di carta sterile con dH2O e posto nella parte inferiore di un contenitore di plastica che sigilla con una guarnizione in gomma. Nota: Durante il riscaldamento il cemento di gomma può bolla brevemente. Tuttavia, assicurarsi che la guarnizione non si rompe.</li>
	<li>Attentamente staccarsi il cemento di gomma con il forcipe e posizionare il coprioggetti cella-lato posteriore nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Lavare i vetrini coprioggetti con tampone di lavaggio di sonda a RT tre volte.</li>
	<li>Incubare il vetrino coprioggetto nel buffer da amplificazione (200 µ l in piastre da 24 pozzetti) RT 30-60 min.</li>
	<li>Nel frattempo, tempri ciascuno dei due tornanti del oligonucleotide con etichetta riconoscendo le sonde (tabella 1) in provette PCR separate da riscaldamento a 94 ° C per 90 s e raffreddamento a RT per 30 min, proteggendo dalla luce. Mescolare le due forcine nel buffer di amplificazione, ciascuno ad una diluizione di 01:50.</li>
	<li>Fare una superficie per la reazione di amplificazione da stretching paraffina pellicola sopra il viso aperto di un coperchio piastra a 24 pozzetti. Pipettare 50-100 µ l gocce della miscela tampone tornante/amplificazione sulla pellicola paraffina per ogni vetrino coprioggetti. Utilizzare pinze per rimuovere con attenzione il coprioggetto dalla soluzione di pre-amplificazione. Asciugare il vetrino coprioggetto toccando il bordo di un panno monouso poroso e fissarlo cella-lato giù alla goccia di amplificazione.</li>
	<li>Posizionare il coperchio della piastra che tiene i coprioggetti in una camera umidificata e incubare per una notte a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Tornare i coprioggetti pozzi ancora una volta. Incubare i campioni con 5 x SSCT [5x di cloruro di sodio citrato di sodio (SSC) 0.1% Tween 20 filtrata attraverso un filtro da 0,22 µm] contenente 0,5 µ g/mL DAPI per 1 h a TA. lavare due volte con 5 i campioni x SSCT a TA.</li>
	<li>Montare i vetrini coprioggetti su vetrini da microscopio. Analizzare le cellule e i campioni utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito di immagine.</li>
</ol>

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<li>Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merkel+Cell+Polyomavirus+Infection+of+Animal+Dermal+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts.</a> Journal of Virology. 92 (4), (2018).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRD4+regulates+Nanog+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).</li>
<li>Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction%3A+higher+gain%2C+lower+cost%2C+greater+durability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability.</a> ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).</li>
<li>Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+intracellular+assembly+of+papillomaviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors.</a> Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).</li>
<li>ccr.cancer.gov. , Available from: 
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 <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</a> (2018).</li>
<li>ccr.cancer.gov. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm</a> (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I metodi descritti sopra, compreso isolamento dei fibroblasti cutanei dal tessuto di pelle umana, la preparazione dei virions MCPyV ricombinante, infezione di cellule coltivate, macchiatura immunofluorescente e un metodo sensibile di pesce adattato dalla tecnologia HCR, che dovrebbe consentire ai ricercatori di analizzare MCPyV infezione27. Una delle fasi più critiche al raggiungimento MCPyV infezione in vitro è la produzione di preparazioni di alto-titolo virione. Utilizzando il protocollo per la...

Polyomavirus delle cellule di Merkel (MCPyV) è un piccolo, double-stranded virus a DNA che è stato associato con un tumore di pelle raro ma aggressivo, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. Il tasso di mortalità di MCC, circa il 33%, superiore a quella del melanoma3,4. MCPyV ha un genoma circolare di ~ 5 kb1,5 , diviso in due da una regione regolatrice non codificanti (NCRR) in precoce e tardiva codifica regioni1. Il NCRR contiene l'origine virale della replica (Ori) e promotori di bidirezionale per trascrizione virale6,7. La regione precoce codifica proteine antigene tumore chiamati grande T (LT), piccolo T (sT), 57kT, alternativa LT ORF (ALTO), come pure un autoregulatory miRNA1,8,9,10. La regione tarda codifica per le proteine del capside VP1 e VP211,12,13. LT e sT sono le proteine di MCPyV meglio studiate e sono stati indicati per sostenere la replicazione del DNA virale e tumorigenesis indotto MCPyV5. Integrazione clonale di MCPyV DNA nel genoma ospite, che è stato osservato in fino a 80% di MCCs, è probabilmente un fattore causale per tumore virus-positivo sviluppo14,15.
L'incidenza di MCC è triplicato sopra i venti anni ultimi16. MCPyV l'infezione asintomatica è diffuso nella popolazione generale17,18,19. Con il crescente numero di diagnosi MCC e l'alta prevalenza dell'infezione di MCPyV, c'è la necessità di migliorare la nostra comprensione del virus e la sua potenziale oncogeno. Tuttavia, molti aspetti della biologia di MCPyV e meccanismi oncogenici rimangono capita male20. Questo è in gran parte perché MCPyV replica scarsamente cellulari stabilizzate linee11,12,21,22,23 e, fino a poco tempo, in grado di supportare MCPyV le cellule della pelle infezione non era stati individuati22. Gli studi meccanicistici per investigare completamente MCPyV e la sua interazione con cellule dell'ospite sono stati ostacolati dalla mancanza di sistema di coltura cellulare per propagare il virus5.
Abbiamo scoperto che fibroblasti cutanei umani primari (HDFs) isolato da infezione di prepuzio umano neonatale supporto robusto MCPyV entrambi in vitro ed ex vivo24. Da questo studio, abbiamo stabilito il primo modello di infezione di coltura cellulare per MCPyV24. Sulla base di questo sistema di modello, abbiamo mostrato che l'induzione di geni metalloproteasi (MMP) matrice di WNT/β-catenin signaling pathway e altri fattori di crescita stimola l'infezione MCPyV. Inoltre, abbiamo trovato che la nuova antagonista MEK approvato dalla FDA inibisce efficacemente l'infezione MCPyV5,25. Da questi studi, abbiamo anche stabilito una serie di protocolli per l'isolamento di fibroblasti cutanei umani24,25, preparando MCPyV virioni11,12, eseguendo MCPyV infezione su fibroblasti cutanei umani 24 , rilevazione MCPyV proteine di IF colorazione26e 25 . Inoltre, ci siamo adattati in situ del DNA ibridazione reazione a catena (HCR) tecnologia27 per sviluppare una tecnica altamente sensibile di pesce (pesce HCR-DNA) per la rilevazione del DNA di MCPyV in cellule epiteliali umane infettate. Questi nuovi metodi sarà utili per lo studio del ciclo infettivo di MCPyV, come pure la risposta cellulare all'infezione MCPyV. Le cellule di serbatoio ospite naturale che mantengono l'infezione MCPyV e le cellule che danno origine a tumori MCC rimangono sconosciute. Le tecniche che descriviamo in questo manoscritto potrebbero essere applicate per esaminare vari tipi di cellule umane di identificare sia le cellule del serbatoio e l'origine dei tumori MCC. I nostri metodi consolidati, come il pesce HCR-DNA, potrebbero essere impiegati anche nel rilevamento di altri virus oncogeni a DNA e la caratterizzazione delle interazioni delle cellule ospite.

<table><tbody><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali, 100X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>GLUTAMAX I, 100X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>L-Glutammina</td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Proteina EGF umana ricombinante, CF</td><td>R& D systems</td><td>236-EG-200</td><td>Conservare a -80 gradi Celsius</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td>Conservare a -80 gradi Celsius</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma</td><td>SML1046</td><td>Conservare a -80 gradi Celsius</td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimicotico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240-062</td><td>Protegge dalla luce</td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 capra anti-topo</td><td>IgG Thermo Fisher Scientific</td><td>A11032</td><td>Protegge dalla luce</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>Protegge dalla luce</td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>Proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>anti-MCPyV LT (CM2B4)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-136172</td><td>Lotto # B2717</td></tr><tr><td>MCV VP1 coniglio</td><td></td><td>Siero policlonale di coniglio #10965</td><td>https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>Fattori di crescita dei fibroblasti di base (bFGF), ricombinante umano</td><td>Corning</td><td>354060</td><td>Conservare a -80 gradi Celsius</td></tr><tr><td>Benzonasi Nucleasi</td><td>Sigma</td><td>E8263</td><td></td></tr><tr><td>DNasi ATP-dipendente sicura per il plasmide</td><td>EPICENTRE</td><td>E3101K</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di ibridazione della sonda</td><td>Tecnologie</td><td></td><td></td>molecolari</tr><tr><td>Tampone di lavaggio della sonda</td><td>Tecnologie</td><td></td> <td>molecolari</td></tr><tr><td>Tampone di amplificazione</td> Tecnologie <td></td><td></td><td>molecolari</td></tr><tr><td>Forcine marcate con Alexa 594</td><td>Tecnologie molecolari</td><td>B4</td><td>Protegge dalla luce</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P7581</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136</td><td></td></tr><tr><td>Tampone PB</td><td>Qiagen</td><td>19066</td><td></td></tr><tr><td>colonna di centrifuga miniprep blu</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche da 50 ml</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligasi</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>MagicMark XP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC5602</td><td></td></tr></tbody></table>

cellule di merkel polyomavirus infezione e rilevamento

Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection

Merkel cella polyomavirus (MCPyV) infezione può portare a carcinoma delle cellule di Merkel (MCC), una forma altamente aggressiva di cancro della pelle. Gli studi meccanicistici completamente studiare biologia molecolare MCPyV e meccanismi oncogenici sono stati ostacolati dalla mancanza di modelli della coltura cellulare adeguata. Qui, descriviamo una serie di protocolli per l'esecuzione e la rilevazione dell'infezione di MCPyV delle cellule epiteliali umane primarie. I protocolli descrivono l'isolamento dei fibroblasti cutanei umani, preparazione dei virions MCPyV ricombinante e la rilevazione dell'infezione del virus di colorazione di immunofluorescenza (IF) e reazione a catena del DNA-ibridazione in situ (HCR), che è un altamente sensibile fluorescenza in situ approccio di ibridazione (pesce). I protocolli di questo documento possono essere adattati dai ricercatori interessati per identificare altri tipi di cellule o linee cellulari che supportano MCPyV infezione. L'approccio descritto di pesce può anche essere adattato per rilevare i bassi livelli di DNA virale presente nella pelle umana infetta.

Il protocollo descritto in questo manoscritto ha permesso l'isolamento di una popolazione quasi omogenea di HDFs (Figura 1). Come dimostrato dalla macchiatura immunofluorescente, quasi il 100% di cellule cutanee umane isolate utilizzando le condizioni descritte in questo protocollo sono state positivamente macchiato per gli indicatori dei fibroblasti cutanei, il vimentin e collagene sono24, ma la negazione per l'essere umano marcatore ...

Qui, presentiamo un protocollo per infettare primario fibroblasti cutanei umani con MCPyV. Il protocollo include isolamento dei fibroblasti cutanei, preparazione di virioni di MCPyV, l'infezione del virus, colorazione di immunofluorescenza e fluorescenza l'ibridazione in situ. Questo protocollo può essere esteso per la caratterizzazione di interazioni MCPyV-ospite e scoprire altri tipi di cellule infettabili da MCPyV.

Cellule di Merkel Polyomavirus infezione e rilevamento

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully ...

Abbiamo presentato il primo modello di coltura cellulare per l'infezione da Poliomavirus cellulare di Merkel. Il protocollo include l'isolamento dei fibroblasti dermici, la preparazione dell'infezione da virus MCPyV, la colorazione immunofluorescente e l'ibridazione fluorescente in situ. Questo protocollo consente di studiare il ciclo infettivo MCPyV e le interazioni con le cellule ospiti evitando artefatti associati all'espressione troppo dei geni virali.Per iniziare, usa un paio di forbici per tagliare il grasso e il tessuto sottocutaneo dal prepuzio neonatale umano. Tagliare il campione della pelle a metà o in quarti. Posizionare il tessuto in 5 millilitri da 10 milligrammi per millilitro dis-based II NPBS, integrato con antibiotico-antimicotico.Incubare a 4 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, utilizzare le forcep di microdisezione per separare accuratamente l'epidermide dagli strati dermici in un piatto di 10 centimetri. Trasferire il tessuto dermico risultante in un tubo conico da 15 millilitri contenente 5 millilitri da 2 milligrammi per millilitro collagenasi di tipo IV in mezzo privo di FBS integrato con antibiotico-anitmicotico.Incubare il campione a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% con scuotimenti periodici per quattro o sei ore, fino a quando rimangono solo pochi aggregati di tessuto macroscopico. Successivamente, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per pipettare vigorosamente la soluzione del campione su e giù 10 volte, rilasciando singole cellule dal derma. Centrifuga a 180 g per cinque minuti e scarta il supernatante.Placcare le cellule dissociate in mezzo DMEM integrato. Nel tardo pomeriggio o sera, semina 6 milioni di cellule 293TT28 in un piatto di 10 centimetri contenente mezzo DMEM integrato. Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%.La mattina seguente, assicurarsi che le cellule siano circa il 50% confluenti, quindi trasfetto le cellule con 66 microlitri di reagente di trasfezione, 12 microgrammi di MCPyV ligato isolare R17B DNA, 8,4 microgrammi di pMtB plasmide di espressione ST e 9,6 microgrammi di PADL plasmide di espressione LT. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente, quando le cellule trasfette sono quasi confluenti, tripinare le cellule e trasferirle in un piatto di 15 centimetri per una continua espansione.Quando quel piatto diventa quasi confluente, trasferisci le cellule in tre nuovi piatti da 15 centimetri. Quando questi nuovi piatti diventano quasi confluenti, raccogli le cellule come delineato nel protocollo di testo. Centrifuga a 180 g a temperatura ambiente per cinque minuti.Quindi rimuovere il supernatante e aggiungere un volume di cellule di magnesio DPBS. Aggiungere 25 solfati di ammonio micromolare, seguiti dallo 0,5% di Triton X-100, dallo 0,1% di benzonasi e dallo 0,1% di una DNASI dipendente dall'ATP. Mescolare bene e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte.Il giorno dopo, raffreddare la miscela sul ghiaccio per 15 minuti. Quindi, aggiungere 0,17 volume di cloruro di sodio. Mescolare e incubare sul ghiaccio per altri 15 minuti.Centrifuga a 12 mila g a 4 gradi Celsius per 10 minuti. Se il supernatante non è chiaro, invertire delicatamente il tubo e ripetere la centrifugazione. Successivamente, trasferire il supernatante su un nuovo tubo.Resuspend il pellet in 1 volume di DPBS integrato con 0,8 moli di cloruro di sodio. Centrifuga a 12 mila g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Se il supernatante non è chiaro, invertire delicatamente il tubo e ripetere la centrifugazione.Unire nuovamente i due supernatanti e centrifuga a 12 mila g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, utilizzare una pipetta per depositare gradienti di iodixanolo in tubi di poliallomero a parete sottile da cinque millilitri come delineato nel protocollo di testo. Caricare 3 millilitri del supernatante contenente virus chiarificato sopra il gradiente di iodixanolo preparato.Centrifuga con rotore SW 55 Ti a 234 mila g e a 16 gradi Celsius per 3,5 ore, assicurandosi di rallentare l'accelerazione e la decelerazione. Al termine dell'ultracentrifugazione, raccogliere 12 frazioni in tubi siliconizzati. Dopo aver mantenuto e staccato le cellule, a 10 millilitri di DMEM integrato e F12 medio al piatto.Trasferire la soluzione cellulare in un tubo da 15 millilitri. Centrifuga a 180 g per due minuti. Scartare il supernatante e sospendere nuovamente le cellule in mezzo DMEM e F12 integrato a una densità cellulare compresa tra 20 mila e 40 mila cellule per millilitro.Quindi, seme 200 o 400 microlitri della sospensione cellulare integrati con 1 milligrammo per millilitro di collagenasi di tipo IV in ogni pozzo di una piastra di 24 o 96 pozzetti, rispettivamente. Rimuovere il materiale di viron MCPyV dal congelatore meno 80 gradi Celsius e posizionare sul ghiaccio per scongelarsi. Aggiungere 1 miliardo di equivalenti di genoma virale di virioni MCPyV per un microlitro di iodixanolo per ogni 2500-5000 cellule da infettare.Toccare delicatamente il lato del piatto e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. In primo luogo, fissare le celle sui coperchi scivolare con 4%PFA in PBS per 10 minuti, quindi lavare il coperchio scivola due volte con PBS e trattarle con etanolo al 70% a quattro gradi Celsius durante la notte per permeabilizzare le cellule. Il giorno successivo, sostituire l'etanolo con tampone di idratazione della sonda e incubare a temperatura ambiente per 60 minuti per pre-ibridare i campioni.30 minuti prima della fine dell'incubazione pre-ibridazione, diluire le sonde in soluzione di ibridazione della sonda a una diluizione 1:500 e incubare a 45 gradi Celsius. Al termine delle incubazioni, pipettare circa 10 microlitri della miscela di sonda diluita su uno scivolo al microscopio per ogni slittamento del coperchio. Posizionare ogni lato della cella di scorrimento del coperchio verso il basso sulla rispettiva goccia di mix di ibridazione.Utilizzando una quantità liberale di cemento di gomma, sigillare i bordi e la parte posteriore di ogni coperchio scivolare sul suo scivolo. Impostare lo scivolo sul lato piatto di un blocco di calore e riscaldarlo a 94 gradi Celsius per tre minuti. Successivamente, trasferire lo scivolo in una camera umidificata e incubarli a 45 gradi Celsius durante la notte.Il giorno dopo, utilizzare le forceps per rimuovere con cura il cemento di gomma. Posizionare il coperchio scivolare il lato della cella verso l'alto nei pozzi di una piastra di 24 pozza e lavarli con tampone di lavaggio della sonda tre volte a temperatura ambiente. Aggiungere 200 microlitri di tampone di amplificazione a ciascun pozzo contenente un coperchio scivolare e incubare a temperatura ambiente per 30-60 minuti.Nel frattempo, ricottura ciascuno dei due tornanti oligonucleotidi etichettati riconoscendo le sonde in tubi PCR separati riscaldandole a 94 gradi Celsius per 90 secondi, quindi raffreddandole a temperatura ambiente per 30 minuti. Mescolare le forcine insieme in tampone di amplificazione con una diluizione di 1:50. Successivamente, allungare la pellicola di paraffina sulla faccia aperta di un coperchio a piastra di 12 po 'per creare una superficie per la reazione di amplificazione.Pipetta 50-100 goccioline di microliter della miscela di forcine sul film di paraffina per ogni slittamento di copertura. Utilizzando le forcep, rimuovere con cura ogni slittamento del coperchio dalla soluzione di pre-amplificazione e toccare il bordo per asciugare una porosa salvietta monouso. Posizionare ogni lato della cella di scorrimento del coperchio essiccato verso il basso su una goccia di amplificazione.Trasferire il coperchio della piastra in una camera umidificata e incubare durante la notte a temperatura ambiente e al buio. Il giorno dopo, riportare la copertura scivola ai pozzi della piastra del pozzo 24. Aggiungere 5X SSCT contenente DAPI ad una concentrazione di 0,5 microgrammi per millilitro ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per un'ora.Successivamente, lavare i campioni due volte con 5X SSCT a temperatura ambiente. Montare la copertura lavata scivola su vetrini al microscopio e utilizzare un microscopio a fluorescenza invertita per analizzare le cellule e immaginirne i campioni. In questo studio, una popolazione quasi omogenea di fibroblasti dermici umani è isolata.La colorazione immunofluorescente rivela che quasi il 100% delle cellule dermiche umane isolate sono macchiate positivamente per marcatori di fibroblasti dermici, vimentina e collagene, ma negative per il marcatore di cheratinocite del prepuzio umano K14. I virioni MCPyV vengono quindi generati e dopo aver visualizzato la banda di virioni MCPyV concentrati nel nucleo del gradiente, vengono raccolte 500 frazioni di microliter e viene eseguita MCPyV qPCR per identificare le frazioni di picco. Le immagini macchiate immunofluorescenti degli HDF infettati da MCPyV sono mostrate qui, dove le cellule che sono LT positive, VP1 positive o sia LT che VP1 positive sono considerate positive per l'infezione da MCPyV.Oltre il 30% delle celle è LT positivo e oltre il 10% è positivo al VP1. I genomi MCPyV replicati nelle cellule infette vengono rilevati utilizzando sia l'HCR-DNA FISH che l'Immunofluorescent-HCR-DNA FISH. Mentre l'HCR-DNA FISH rivela la localizzazione del DNA MCPyV presente nella fabbrica di replicazione, i metodi Immunofluorescent-HCR-DNA FISH consentono il rilevamento simultaneo sia del DNA MCPyV che della co-localizzazione delle proteine LT nei centri di replicazione.Per ottenere la migliore efficienza delle infezioni da virus, è molto importante che MCPyV sia concentrato ad almeno 2 x 10-8 ° genoma del virus per microlitro poiché l'iodoxanolo è tossico per le cellule. A seguito dell'infezione da MCPyV dei fibroblasti dermici, possono essere eseguite molte analisi biologiche molecolari, tra cui immunofluorescenza, immunoblocco, immunopositivizzazione e saggio a base di qPCR. Il sistema di infezione che abbiamo descritto consente ai ricercatori di studiare le fasi dell'infezione da MCPyV come il traffico nucleare e il packaging virale.MCPyV è un virus BSL-2, ma poco si sa del suo potenziale di patologia nelle quantità raggiunte in un ambiente di laboratorio. Pertanto, i ricercatori dovrebbero prendere precauzioni per evitare l'esposizione al virus.

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