Name: Stampa a getto dinchiostro reattiva e analisi di propulsione di micro-agitatori semoventi a base di seta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Scopri la stampa a getto d'inchiostro reattiva per produrre micro-agitatori semoventi a base di seta. Questo metodo consente di creare dispositivi biocompatibili per applicazioni biomediche e ambientali.

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Gli autori vorrebbero riconoscere il supporto della EPSRC tramite la stampa a getto d'inchiostro reattiva di X. Zhao dei premi Silk Materials (EP/N007174/1 e EP/N023579/1), la Fellowship di accelerazione della carriera di S. J. ebbens e la borsa di impatto sulle tecnologie sanitarie (EP/J002402/ 1 e EP/N033736/1). Gli autori ringraziano anche il dottor Qingyou Xia del laboratorio di stato chiave della biologia del genoma di Silkworm, la Southwest University, Cina per la fornitura di bozzoli di seta.

Attenzione: Prima dell'uso di perossido di idrogeno, carbonato di sodio, etanolo, cloruro di calcio e metanolo, consultare le pertinenti schede tecniche di sicurezza del materiale. Assicurarsi di indossare tutti i dispositivi di protezione individuale appropriati, compresi i controlli tecnici, mentre si trattano sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo.
1. estrazione della fibroina
<ol><li>Tagliare 5 g di bozzoli di seta puliti in ~ 1 cm2 piccoli pezzi con le forbici.</li>
	<li>Far bollire 2 L di acqua deionizzata (DI) in un becher da 2 L su una piastra riscaldabile magnetica sotto un cappuccio di estrazione.</li>
	<li>Aggiungere 4,24 g di carbonato di sodio gradualmente e lentamente nell'acqua bollente per evitare di bollire e lasciarlo sciogliere con l'aiuto di una barretta di agitazione magnetica.</li>
	<li>Attendere fino a quando la soluzione inizia a bollire di nuovo e aggiungere i pezzi tagliati di bozzoli nella soluzione. Assicurarsi che tutta la seta sia immersa nella soluzione e mantenere la soluzione bollente sotto agitazione costante per 90 min. coprire leggermente il becher con un foglio di alluminio e ricaricare con acqua preriscaldata regolarmente per ricostituire la perdita di acqua dovuta all'evaporazione.</li>
</ol>2. essiccazione della fibroina
<ol><li>Rimuovere le fibre di fibroina estratte dalla soluzione di carbonato di sodio con una canna di vetro o spatola e lavare 3x con 1 L di acqua preriscaldata per ogni lavaggio, diminuendo gradualmente la temperatura per ogni fase di lavaggio (circa 60 ° c, 40 ° c e temperatura ambiente, 25 ° C).</li>
	<li>Stendere le fibre di fibroina su un piatto di cristallizzazione in vetro borosilicato da 750 mL e posizionarla in un forno di essiccazione a 60 ° c sotto pressione atmosferica e lasciarla asciugare durante la notte. Una volta asciugato, conservare la fibroina in un contenitore chiuso a temperatura ambiente.</li>
</ol>3. dissoluzione della fibroina
<ol><li>Preparare una soluzione ternaria (reagente di Ajisawa) contenente 4,8 g di acqua di DI, 3,7 g di etanolo e 3,1 g di cloruro di calcio17.</li>
	<li>Mettere un pallone di fondo rotondo a due colli (100 mL) in un bagno d'acqua, realizzato riempiendo un piatto di cristallizzazione in vetro borosilicato 750 mL con 600 mL di acqua DI, sopra una piastra magnetica. Collocare la soluzione ternaria all'interno del pallone.</li>
	<li>Posizionare un termometro in uno dei colli per monitorare accuratamente la temperatura della soluzione. Coprire l'altro collo con un foglio di alluminio per evitare l'essiccazione della soluzione a causa dell'evaporazione (o utilizzare un condensatore a riflusso raffreddato ad acqua). Riscaldare la soluzione a 80 ° c. Nota: accertarsi che la lampadina del termometro sia all'interno della soluzione.</li>
	<li>Quando la temperatura della soluzione è stabile a 80 ° c, rimuovere la lamina di alluminio e aggiungere 1 g di fibroina essiccata alla soluzione. Aggiungere una piccola barra magnetica per garantire che la soluzione sia miscelata bene durante il processo di dissoluzione. Coprire nuovamente il secondo collo con un foglio di alluminio per minimizzare l'evaporazione, ma mantenere aperto il sistema. Lasciar sciogliere per 90 min.</li>
</ol>4. dialisi della soluzione di fibroina
<ol><li>Dopo 90 minuti di dissoluzione, lasciare la soluzione di fibroina per 10 minuti per raffreddare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Prendere 1 15 cm di tubo di dialisi lungo (peso molecolare cut-off 12000 − 14000 kDa) e legare un nodo in una delle due estremità. Lavare per alcuni minuti con l'acqua DI corsa dal rubinetto.</li>
	<li>Aprire l'altra estremità e versare la soluzione di fibroina all'interno. Utilizzando un morsetto metallico, chiudere l'altra estremità del tubo di dialisi assicurando che il tubo sia chiuso il più strettamente possibile. Collegare una delle estremità del tubo di dialisi tramite un tappo a vite a un flaconcino di plastica da 30 mL vuoto per consentire al tubo di dialisi di galleggiare nell'acqua.</li>
	<li>Riempire un becher da 2 L con 2 L di acqua DI e posizionare il tubo di dialisi al suo interno. Cambiare l'acqua a intervalli regolari. Controllare la conducibilità dell'acqua ogni volta che viene modificato per seguire il processo di dialisi. La fase di dialisi termina una volta che la conducibilità dell'acqua è inferiore a 10 μS/cm. Nota: questo processo di solito richiede circa 24 − 36 h con 5 cambiamenti di acqua.</li>
	<li>Dopo la dialisi è completa, tagliare un'estremità del tubo di dialisi con le forbici e versare la soluzione in una serie di 1,5 mL tubi. Quindi, centrifugare per 5 min a 16.000 x g per rimuovere eventuali particelle all'interno della soluzione di fibroina. Raccogliere il supernatante in un flaconcino di plastica da 30 mL e conservarlo a 4 ° c.</li>
</ol>5. determinazione della concentrazione della soluzione di RSF
<ol><li>Pesare un vetrino pulito (W1). Aggiungere 200 μL di soluzione di seta (V1).</li>
	<li>Lasciare il vetrino in un forno a 60 ° c per 2 h.</li>
	<li>Pesare nuovamente il vetrino (W2).</li>
	<li>Calcolare la concentrazione della soluzione di seta (w/v) utilizzando la seguente formula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59030/59030eq1.jpg">
</li>
</ol>6. preparazione degli inchiostri per la stampa
<ol><li>Preparare l'inchiostro A (volume finale 1,5 mL) miscelando la soluzione di fibroina (40 mg/mL), polietilenglicole 400 (PEG400; 14 mg/ml) e acqua deionizzata per la stampa del corpo principale degli spmss.</li>
	<li>Per la stampa del motore catalitico degli SPMSs, miscelare fibroina (40 mg/mL), PEG400 (12 mg/ml), catalasi (6 mg/ml con attività catalitica di &gt; 20000 unità/mg) e acqua deionizzata per fare 1,5 ml di inchiostro B.</li>
	<li>Preparare 1,5 mL di inchiostro C dissolvendo il blu brillante di Coomassie (0,05 mg/mL) in metanolo. Nota: il metanolo viene utilizzato per convertire le bobine casuali di fibroina in fogli beta rigidi stampando l'inchiostro C sulla parte superiore dell'inchiostro A o inchiostro B. Coomassie blu brillante viene utilizzato per fornire un colore contrastante di SPMSs per aiutare il tracciamento automatico degli SPMSs durante la propulsione.</li>
</ol>7. stampa 3D Inkjet reattiva
Nota: la stampante inkjet utilizzata in questi esperimenti si basa su dispositivi a getto piezoelettrici con ugelli in vetro. Ci sono diverse stampanti inkjet disponibili in commercio per la ricerca che possono duplicare queste funzioni.
<ol><li>Utilizzare dispositivi a getto con diametro dell'ugello di 80 μm per la stampa degli inchiostri su un substrato di silicio collocato sul palco ad una distanza di lavoro tra l'ugello e il substrato si-wafer di circa 5 mm. Le forme geometriche degli SPMSs sono definite digitalmente come una serie di punti di coordinate X-Y in un file di foglio di calcolo. Nota: la stampante legge le coordinate in modo seriale ed esegue la stampante di conseguenza. Ogni punto di coordinate rende il getto della stampante una volta attraverso il dispositivo di getto. I file di foglio di calcolo separati vengono creati per gli inchiostri A e B (vedere file supplementari [SPMS Main Body. xlsx e SPMS Engine. xlsx]).</li>
	<li>Caricare i tre inchiostri (A, B e C) in tre serbatoi (1,5 mL ciascuno) e quindi regolare la contropressione utilizzando la valvola di contropressione per ogni singolo canale per assicurarsi che l'inchiostro non goccioli dai dispositivi di getto. Nota: sono necessari tre dispositivi a getto su canali indipendenti.</li>
	<li>Regolare i parametri di getto (tempo di salita 1, tempo di permanenza, tempo di caduta, tempo ecologico, tempo di salita 2, tensione di inattività, tensione di sosta, tensione dell'eco) per ogni canale per garantire che ogni inchiostro dia una buona formazione di gocce stabili (Figura 2). Nota: questi parametri sono il dispositivo a getto e l'inchiostro a carico e dovranno essere regolati di conseguenza.</li>
	<li>Stampare lo strato di inchiostro di fibroina di seta alternando il metanolo su substrati di si-wafer puliti e lucidati: fase 1, stampa dell'inchiostro A (corpo principale); fase 2: stampa dell'inchiostro C (polimerizzazione dell'inchiostro); fase 3: stampa dell'inchiostro B (inchiostro catalitico per i siti del motore); fase 4: stampa dell'inchiostro C (polimerizzazione dell'inchiostro); fase 5: ripetere le fasi 1-4 per i livelli desiderati (ad esempio, 100). Nota: due disegni di esempio per le 4 fasi sono inclusi in file supplementari; Il corpo principale di SPMS. xlsx viene utilizzato per la fase 1 e la fase 2 e il motore SPMS. xlsx viene utilizzato per la fase 3 e la fase 4.</li>
	<li>Stampare due lotti di SPMSs fibroina con 200 livelli e 100 strati di spessore, rispettivamente. Nota: il motore della catalasi si trova sul lato di un'estremità di ogni agitatore. Così, gli agitatori hanno un motore catalitico (Vedi Figura 1 regione rossa).</li>
	<li>Per rimuovere i campioni dal si-wafer, immergere i campioni in acqua DI e delicatamente agitare fino a quando si verifica il distacco.</li>
</ol>8. acquisizione/tracciamento dei dati e analisi delle traiettorie di agitatori semoventi
<ol><li>Pulire una capsula DI Petri di vetro (9 cm di diametro) con acqua DI per garantire che la superficie sia priva DI polvere.</li>
	<li>Una volta puliti e asciutti, aggiungere 10 mL di pre-filtrato (0,45 μm) 5% p/v H2O2 nella capsula di Petri e lasciare per stabilirsi. Illumina il fondo della capsula di Petri con una sorgente luminosa a diodi luminosi bianchi (LED) e utilizza una fotocamera ad alta velocità con obiettivo zoom macro per catturare il movimento dall'alto. Salva i video come file. avi. Nota: vedere la tabella dei materiali per i dettagli dell'apparecchiatura utilizzata.</li>
	<li>Lavare gli agitatori di seta stampati per 10 minuti, subfondendoli in acqua di per rimuovere qualsiasi PEG400non vincolato. Prenda con cautela un agitatore lavato con la punta di un ago sterile per siringa e lo collochi al centro della capsula di Petri. Quando l'agitatore lavato tocca il combustibile H2O2 , le bolle iniziano a formarsi intorno al motore e si osserva il movimento circolare dell'agitatore. Quando il sistema appare stabile (di solito 10 − 30 s più tardi), premere record nel software di registrazione per iniziare a catturare il video.</li>
	<li>Eseguire il tracciamento dei micro agitatori su una base fotogramma per fotogramma, tracciando ogni estremità degli agitatori come indicato dai punti A e B in Figura 3. Nota: questo può essere fatto manualmente o con l'ausilio di software di tracciamento.</li>
	<li>Dai dati di tracciamento ottenuti, calcola la velocità istantanea tra due fotogrammi consecutivi (ad esempio, 1 e 2) utilizzando l'equazione sottostante e media le velocità risultanti dall'intera sequenza per ottenere la velocità istantanea media.</li>
	<li>Oltre a questo, calcolare l'angolo di orientamento φ. Quindi utilizzare il tasso di variazione di φ per determinare la velocità di rotazione (Figura 3). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59030/59030eq2v3.jpg"> Nota: quando si calcolano le velocità istantanee dai dati delle immagini rilevate, è importante che l'immagine iniziale di un oggetto con dimensioni conosciute sia in grado di calcolare i valori corretti dei pixel in micrometri. Questi valori dipenderanno dalla fotocamera, dall'obiettivo e dalla distanza utilizzata. A seconda del tipo di particella stampata, scegliere diversi punti di tracciamento per calcolare la velocità. Per esempio, qui i punti di tracciamento A, B e C (centro di massa) sono tutti utilizzati per determinare le velocità istantanee (Figura 3).</li>
</ol>9. caratterizzazione degli SPMSs da parte di SEM
<ol><li>Rimuovere gli SPMSs inutilizzati e usati dalla soluzione si-wafer o bulk e trasferirli su pastiglie adesive in carbonio larghe 10 mm montate su microscopia elettronica a scansione di alluminio (SEM). Asciugare i campioni in forno di essiccazione per 10 minuti a 60 ° c.</li>
	<li>Caricare gli stub campione sullo stadio di coater polverizzazione catodica. Cappotto sputter (plasma di argon a 0,05 torr) 50 – 100 Nm di oro sui campioni, assicurando una copertura omogenea della superficie dorata del campione.</li>
	<li>Rimuovere i campioni dal Coater di polverizzazione catodica e l'immagine in un SEM sotto vuoto a 5,0 kV. Nota: le tensioni di accelerazione molto elevate possono bruciare la seta e dare origine a false caratteristiche.</li>
</ol>

<ol><li>Gregory, D. A., Campbell, A. I., Ebbens, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Catalyst+Distribution+on+Spherical+Bubble+Swimmer+Trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+C%22%5BJournal%5D)">Effect of Catalyst Distribution on Spherical Bubble Swimmer Trajectories.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 119 (27), 15339-15348 (2015).</li>
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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Inkjet+Printing+of+Functional+Silk+Stirrers+for+Enhanced+Mixing+and+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Reactive Inkjet Printing of Functional Silk Stirrers for Enhanced Mixing and Sensing.</a> Small. , e1804213(2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Una caratteristica chiave di SPMSs prodotto in questo protocollo è la capacità di progettare rapidamente e facilmente diverse forme e strutture tramite RIJ di seta drogato con enzimi come catalasi e raggiungere il movimento chimicamente guidato tramite propulsione a bolle5. Questo insieme all'elevata biocompatibilità18 di questi agitatori li rende altamente desiderabile per le applicazioni future sia per le sfide di risanamento dell'acqua, sia per le applicazioni Lab-on-a-chip per i dispositivi di diagnosi medica.
Qui, la capacità di propulsione è dimostrata utilizzando un design semplice linea con una parte del motore stampata sul lato di esso, come mostrato in Figura 1. I puntini rossi rappresentano le parti del motore catalasi drogato catticamente attivi e i puntini blu rappresentano le parti inattive. Per poter generare forme 3D tramite RIJ, è necessario stampare più livelli per generare un'altezza degli assi z. Qui, i numeri di strati depositati su un si-wafer erano 100 e 200. Variando il numero di strati, si può trovare una differenza nella velocità di propulsione/rotazione paragonabile al deposito del doppio della quantità di materiale. Per avere strutture ben definite durante la stampa a getto d'inchiostro, è importante che i parametri di getto corretti siano selezionati per ottenere una gocciolina ben definita come mostrato nella Figura 2. Questi parametri varieranno a seconda dell'inchiostro utilizzato e dei dispositivi di getto. Se l'inchiostro non produce goccioline stabili, l'inchiostro probabilmente non è più adatto per la stampa ed è probabilmente iniziando a trasformarsi in gel. È importante notare che il limite di risoluzione dipende fortemente dalle dimensioni degli ugelli utilizzati e gli ugelli più piccoli consentono una maggiore risoluzione e piccole strutture/particelle stampate.
Un esempio di agitatore di seta stampato RIJ è mostrato in Figura 4, dove la catalasi drogato parte del motore (come indicato dalla regione contrassegnata rosso) può essere visto attaccato al lato del corpo principale (vedere anche lo schema in Figura 1 per i dettagli). Lo scaffold di seta stampato è un materiale che permette alla soluzione di combustibile di diffondersi in tutta la struttura 3D, e quindi bolle di ossigeno si formano durante la decomposizione del perossido di idrogeno via catalasi. Le bolle di ossigeno rilasciate generano pori in scala di micron nella struttura di scaffold di seta come si può vedere confrontando i micrografi SEM prima dell'esposizione al combustibile H2o2 (Figura 5a) e dopo l'esposizione h2o2 ( Figura 5B). Al fine di garantire che il movimento è dovuto alla decomposizione di H2O2 combustibile ma non tensione superficiale guidata tramite il rilascio di PEG400, è importante che gli agitatori siano inizialmente immersi in acqua per un periodo di almeno 10 min e testati in di acqua per il movimento di tensione superficiale prima della propulsione in soluzione di combustibile.
L'uso di PEG400 permette un migliore rilascio di bolle dalla superficie della seta19 come precedentemente spiegato da Gregory et al.5 ma può anche dare origine alla trazione superficiale Spinta propulsione, che può essere auspicabile a seconda dell'applicazione come precedentemente descritto20. Questo secondo meccanismo dà anche l'opportunità di produrre SPMSs con due meccanismi che dipendono dal tempo e possono essere vantaggiosi per alcune applicazioni che, ad esempio, si aspettano un iniziale vigoroso agitazione all'inizio seguita da una lenta continuazione mescolando per lunghi periodi di tempo20.
In conclusione, utilizzando RIJ per produrre autonomi dispositivi semoventi, una vasta gamma di forme e dimensioni può essere facilmente progettato e stampato. La seta come materiale di base per i dispositivi offre l'opportunità di incapsulare facilmente gli enzimi e altre frazioni nelle strutture dando la possibilità di aggiungere funzioni a questi dispositivi.

I micro-agitatori artificiali semoventi (spmss) impiegano una varietà di meccanismi di propulsione per produrre movimento, che può essere classificato come propulsione chimica1,2,3,4, 5 il , 6 o propulsione esterna fisica. Un meccanismo di propulsione chimica comune è quello di utilizzare l'attività catalitica o enzimatica per generare movimento producendo gradienti o generare bolle che impartiscono slancio all'oggetto quando si staccano. Studi precedenti hanno indagato diversi spsm catalitici e chimici, tra cui perle di polistirolo con nanoparticelle di platino e cromo adsorbente sulla superficie1, oro-platino bimetallico Janus nano-aste2, magnesio Janus Micro-agitatori3, micro-agitatori costituiti da un nucleo di magnesio e guscio di biossido di titanio con nanoparticelle d'oro incorporate4, e fibin di seta micro-razzi Janus con catalasi incorporati all'interno dello scaffold5. I meccanismi di propulsione fisica includono i sistemi di propulsione magnetici7,8, Optical9e ultrasonici10 , tutti controllati da una fonte fisica esterna. A seconda dell'applicazione prevista, la dimensione SPMS può variare da pochi nanometri a diverse centinaia di micrometri. Esempi di potenziali applicazioni di questi SPMSs summenzionati e altri sono la diagnosi medica di malattie con dispositivi Lab-on-a-chip11, carico e consegna mirata in vivo di terapie12, risanamento ambientale3 (ad es. pulizia delle fuoriuscite di olio) e degradazione fotocatalitica di agenti di guerra chimici e biologici, come Bacillus antracis e agenti nervosi4. Dipendente dall'applicazione di destinazione, è quindi auspicabile essere in grado di produrre SPMSs che subiscono traiettorie specifiche come traiettorie lineari lunghe per le sfide di trasporto o traiettorie rotazionali per applicazioni di micromiscelazione. Il focus qui è sul movimento rotazionale per le applicazioni di agitazione.
Non esiste un unico metodo consolidato per fabbricare SPMSs, ma per applicazioni mediche e ambientali, è essenziale utilizzare un materiale biocompatibile, biodegradabile, ecologico, prontamente disponibile, economico e consente una facile fabbricazione di SPMSs complessi senza richiedere apparecchiature sofisticate. La fibroina di seta rigenerata (RSF) è uno di questi materiali che soddisfa tutti questi parametri insieme ad essere approvato anche dalla Food and Drug Administration (FDA).
La seta è un termine generico utilizzato per diverse proteine Fibbe naturali, di cui, il più comunemente noto è quello fatto dalle larve di falena di seta, Bombyx mori, prima del suo Pupation. Questi bozzoli sono fatti di fibroina, una proteina FIBUS, bloccato insieme con un'altra proteina chiamata sericina. La fibroina di seta (SF) è stata trovata per avere eccellenti proprietà meccaniche, biocompatibilità e biodegradabilità13, il che lo rende una scelta ideale per la fabbricazione di SPMSS. SF esiste in tre forme polimorfiche, vale a dire, seta I, II e III. Silk I è una forma metastabile solubile in acqua contenente principalmente eliche e bobine casuali; la seta II è una forma insolubile in acqua contenente principalmente fogli β antiparalleli di seta cristallizzata; e la seta III è una triplice struttura elicoidale di poliglicina II che esiste nell'interfaccia acqua-aria della soluzione di seta. Simile ad altre proteine Fibbe, SF ha ripetuto unità di sequenze aminoacidiche. Il SF naturale di un bozzolo è costituito da tre principali domini hexapeptide di tali unità ripetute (GAGAGX), mentre X può essere A, S o Y. Attraverso il legame con l'idrogeno, i motivi (GA) n delle strutture in lamiera β antiparallele si accumulano ulteriormente attraverso le forze di Van der Waals e formano le nano cristallizzazioni idrofobiche14,15.
La biocompatibilità può essere ulteriormente migliorata cercando di guidare la propulsione utilizzando enzimi naturali per generare un gradiente di concentrazione o bolle di gas in un mezzo liquido (combustibile). Di conseguenza, in questo studio, l'enzima catalasi viene utilizzato come "motore" per generare propulsione con perossido di idrogeno utilizzato come mezzo di combustibile acquoso. La catalasi è un enzima presente in quasi tutti gli organismi viventi. Catalizza la decomposizione del perossido di idrogeno (H2O2) in acqua e ossigeno16. Il rilascio di bolle di ossigeno dai siti enzimatici degli SPMSs genera una forza sull'oggetto facendolo subire la propulsione nella direzione opposta del rilascio della bolla5 (Figura 1).
In un SPMS pilotato a livello catalizzato, il posizionamento differente del sito catalitico provoca diversi comportamenti di propulsione e traiettorie1. Al perseguimento della generazione di microagitatori efficienti, è quindi necessario fabbricare agitatori con forme geometriche ben definite e posizioni del motore e confrontare i diversi poteri del motore. Qui, per facilitare queste indagini, è descritto come gli SPMSs della fibroina di seta rigenerata sono fabbricati in scala millimetrica utilizzando la tecnologia di stampa a getto d'inchiostro reattivo (RIJ). La stampa a getto d'inchiostro è un metodo senza contatto per la deposizione dei materiali. Questo rende la fabbricazione di piccole strutture complesse con alta precisione nella generazione di varie forme semplice. RIJ si svolge quando due o più materiali di reazione diversi vengono depositati e reagiscono sul substrato per produrre il materiale desiderato. Pertanto, gli SPMSs stampati con un sito di agitatore catalitico fuori centro danno l'asimmetria dell'oggetto che si traduce in movimento rotazionale. Questo approccio rende anche semplice la produzione di micro-agitatori in una varietà di forme e configurazioni di progettazione definite dal computer-aided design (CAD), permettendo così una controllabilità più facile e più accurata sul movimento desiderato durante la pratica Applicazioni. Infine, è dimostrata la capacità di stampare dispositivi con spessori variabili che presentano proprietà di propulsione diverse.
Questo studio fornisce un progetto per la produzione di SPMSs con RSF da micrometro a scala millimetrica. L'uso della tecnologia RIJ per la produzione di micro-agitatori RSF apre la porta per la produzione altamente versatile di micro-Agitatori da materiali come scaffold prodotti in situ o idrogel, che non sono altrimenti in grado di essere depositati o fabbricati attraverso altri mezzi come l'evaporazione. Dopo un'appropriata ulteriore funzionalizzazione (ad esempio, enzimi), questi SPMSs possono essere adatti per la bonifica ambientale3, come la pulizia di tossine biologiche, inquinanti organici, e agenti di guerra chimici e biologici4.

<table><tbody><tr><td>Carbonato di sodio</td><td>Alfa Aesar</td><td>11552</td><td>anidro, 99,5%, cloruro</td></tr><tr><td>di calcio</td> granulare <td>Fluka Analytical</td><td>C1016</td><td>anidro, >93%, granulare</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>10542382</td><td>grado HPLC</td></tr><tr><td>PEG-400</td><td>Aldrich Chemistry</td><td></td><td>202398 media Mn 400, tetramero mol wt ~250 kDa&nbsp;</td></tr><tr><td>Catalasi</td><td>Sigma Life Science</td><td>E3289</td><td>>20K unità</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Acros Organics</td><td>268280025</td> Perossido di idrogeno <td>di grado HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>31642</td><td>30% (p/p)</td></tr><tr><td>Seta</td><td>Southwest University, Cina</td><td>NA</td><td>Bozzoli di seta puliti grezzi, tubi per dialisi Bombox Mori</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9777</td><td>Cellulosa, media, larghezza piana 25 mm, taglio tipico del peso molecolare = 14000</td></tr><tr><td>Fisherbrand Hoffman Clips&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12744396</td><td>Clip utilizzate per chiudere le estremità delle provette per dialisi</td></tr><tr><td>Si-Wafer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>647535</td><td>Utilizzate come substrato di stampa</td></tr><tr><td>Balance</td><td>OHAUS Pioneer&nbsp;</td><td>PA214C&nbsp;</td><td>Bilancia analitica</td></tr><tr><td>Conduttimetro</td><td>Mettler Toledo</td><td>FG3</td><td>Mettler Toledo FiveGo Misuratore di conducibilità portatile</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>10355052</td><td>Heraeus Biofuge fresco venduto da Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>Stuart</td><td>US152</td><td>Stuart US152 Agitatore magnetico</td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>PixeLink</td><td>PL-D732CU-T</td><td>Obiettivo</td></tr> <tr><td></td><td>per fotocamera a colori ad alta velocitàNavitar</td><td>Navitar 1-60135</td> Dispositivi a getto di <td>lenti con zoom macro</td></tr><tr><td>Microfab</td><td>Technologies Inc.</td><td>MJ-AT-01-40-8MX</td><td>80um diametro ugello Dispositivo a getto</td></tr><tr><td>MJ-AT-01-80-8MX</td><td>80um diametro ugello Dispositivo</td><td></td><td></td>a getto</tr><tr><td>Lightpad</td><td>AGPTEK</td><td>UN-HL0245-EUUN</td><td>Luce per l'esperimento di nuoto</td></tr><tr><td>Pipettatori</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td>monocanale, variabile, &nbsp; 100&nbsp; &ndash; &nbsp; 1.000&nbsp; &micro; L, blu</td></tr><tr><td>3123000055</td><td>monocanale, variabile, 20&nbsp; &ndash; &nbsp; 200&nbsp; &micro; L, giallo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon</td><td>LV100ND</td><td>Manuale, microscopio verticale</td></tr><tr><td>SEM</td><td>Fei</td><td>F50</td><td>Utilizzato per la scansione di micrografie elettroniche</td></tr></tbody></table>

stampa a getto d'inchiostro reattiva e analisi di propulsione di micro-agitatori semoventi a base di seta

Reactive Inkjet Printing and Propulsion Analysis of Silk-based Self-propelled Micro-stirrers

In questo studio, viene segnalato un protocollo per l'utilizzo della stampa inkjet reattiva per fabbricare nuotatori di seta a propulsione enzimica con forme ben definite. I dispositivi risultanti sono un esempio di oggetti semoventi capaci di generare movimento senza azionamento esterno e hanno potenziali applicazioni in medicina e scienze ambientali per una varietà di scopi che vanno da micro-agitazione, mirato erogazione terapeutica, alla bonifica dell'acqua (ad esempio, pulizia delle fuoriuscite di olio). Questo metodo utilizza la stampa a getto d'inchiostro reattiva per generare strutture di seta solida su piccola scala ben definite convertendo la fibroina di seta rigenerata idrosolubile (seta I) in fibroina di seta insolubile (seta II). Queste strutture sono anche selettivamente drogato in regioni specifiche con la catalasi enzimatica al fine di produrre movimento attraverso la generazione di bolle e distacco. Il numero di strati stampati determina la struttura tridimensionale (3D) del dispositivo, e così qui viene riportato l'effetto di questo parametro sulle traiettorie propulsiva. I risultati dimostrano la capacità di sintonizzare il movimento variando le dimensioni delle strutture stampate.

Dopo aver bollito la seta, si prevede che le fibre essiccate siano circa un terzo più leggero di prima, indicando la rimozione di sericina di successo. Durante la dissoluzione della seta nel reagente di Ajisawa, le fibre devono essere completamente disciolte e deve essere recuperato un liquido viscosi giallo. Dopo la dialisi, la soluzione di seta deve essere meno viscosa, ma mostra ancora un colore leggermente giallo. Se la seta si è trasformata in gel, questo indica che la dissoluzione non è stata fatta con successo.
Le goccioline stabili formate dai dispositivi a getto consentiranno la definizione più alta dei campioni stampati. Figura 2 Mostra un esempio di una singola gocciolina stabile per dare buoni risultati di stampa, come la seta stampata-agitatori mostrati in Figura 4. È normale, a seconda di come viscoso l'inchiostro è, che la diffusione avviene sul substrato.
A seconda delle stampanti a getto d'inchiostro utilizzate e delle dimensioni delle gocce, la distanza tra ogni goccia stampata deve essere regolata in modo tale che si sovrappongano per generare linee connesse. Se le goccioline sono troppo distanti, la struttura stampata si rompe. In aggiunta a questo, se non abbastanza strati sono stampati, c'è la possibilità di micro-agitatori rottura quando messo in soluzione di combustibile. Una volta che gli agitatori sono stati rimossi dal substrato e lavati, metterli nella soluzione di combustibile perossido di idrogeno dovrebbe provocare istantaneamente bolle che si formano. Il tasso di successo di buon rilascio di bolle dipende fortemente dall'attività enzimatica; Se l'attività enzimatica è bassa, si formano meno bolle, portando così a scarsi risultati di propulsione. La Figura 5 Mostra come la morfologia superficiale degli agitatori sia alterata a causa delle bolle rilasciate dalle strutture interne che generano piccoli pori. Un micro-agitatore di successo sarà simile a quelli che possono essere visti in Figura 6 e i due video supplementari S1 e S2 rispettivamente.
Figura 6 Mostra ancora fotogrammi video di due rappresentativi, 100-Layer (Figura 6a) e 200-Layer (Figura 6b) micro-agitatori in 5% H2O2 carburante. Le linee rosse e verdi indicano le traiettorie tracciate (vedere video supplementari S1 e S2). La velocità di rotazione può essere determinata dal tasso di cambio di orientamento (ɸ, Figura 3) come mostrato in Figura 7. Il confronto tra i micro-agitatori drogato a strato di 100 e 200-strato di catalasi Mostra un aumento distintivo della velocità di rotazione di ~ 0,6 piega da 60 ± 6 rpm a 100 ± 10 giri/min (Figura 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59030/59030fig1v2.jpg"> Figura 1: illustrazione schematica della ripartizione catalitica del perossido di idrogeno in acqua e ossigeno mediante catalasi incastonata nel pontile dell'agitatore nelle posizioni desiderate (in rosso). Le bolle di ossigeno del prodotto forniscono la propulsione necessaria per muovere l'agitatore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59030/59030fig1v2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59030/59030fig2v2.jpg"> Figura 2: le immagini time lapse della formazione di gocciolina di RSF da un dispositivo a getto (diametro ugello 80 μm). I numeri sotto le immagini rappresentano il tempo trascorso, in microsecondi (μs), dall'inizio del getto della goccia di inchiostro di seta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59030/59030fig2v2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59030/59030fig3.jpg"> Figura 3: rappresentazione schematica del tracciamento delle particelle su due fotogrammi consecutivi. A e B indicano i punti di tracciamento e C indica il centro di massa. φ indica l'angolo di orientamento. La direzione della traiettoria SPMS è indicata dalla freccia nera curva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59030/59030fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59030/59030fig4.jpg"> Figura 4: Micrografo leggero di un micro-agitatore stampato appena RIJ (100 strati) prima del lavaggio. La casella rossa denota la regione drogato della catalasi (regione del motore). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59030/59030fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59030/59030fig5.jpg"> Figura 5: Immagini SEM del corpo principale e della parte del motore della catalasi di un SPMS dopo i pori si formano a causa del rilascio di bolle. I pori possono essere chiaramente visti sulla superficie del motore nelle immagini SEM degli SPMSs provenienti dal rilascio della bolla di ossigeno. A) micro-agitatori di seta prima dell'esposizione al 5% p/v H2O2 soluzione di combustibile. B) SPMS di seta dopo esposizione al 5% p/v H2O2 soluzione di combustibile. Le immagini a destra sono allargamenti delle regioni rosse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59030/59030fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59030/59030fig6.jpg"> Figura 6: fotogrammi video di due micro-agitatori in una soluzione di combustibile al 5% che mostra la traiettoria nel tempo. A) micro-agitatoriastrato 100. (B) micro-agitatori a strato 200. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59030/59030fig6large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59030/59030fig7.jpg"> Figura 7: confronto dell'angolo di orientamento (φ) per i microagitatori a 100 strati (60 ± 6 rpm) e 200-Layer (100 ± 10 rpm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59030/59030fig7large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
Video supplementare S1: microagitatore auto-motile rappresentativo a 100 strati in 5% p/v H 2 il O 2 il in fase di propulsione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59030/Video_1.mp4">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Video supplementare S2: rappresentante di 200-motile a strato di microagitatore in 5% p/v H 2 il O 2 il in fase di propulsione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59030/Video_2.mp4">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Questo protocollo dimostra la capacità di utilizzare la stampa a getto d'inchiostro reattiva per stampare micro-agitatori biocompatibili e rispettosi dell'ambiente per l'uso in applicazioni biomediche e ambientali.

Stampa a getto d'inchiostro reattiva e analisi di propulsione di micro-agitatori semoventi a base di seta

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The ...

Siamo in grado di produrre micromotori di seta versatili, biocompatibili e biodegradabili da utilizzare in applicazioni di micro-miscelazione come il miglioramento del dosaggio enzimatico, la diagnostica dei trucioli di legno di lava e il monitoraggio e la bonifica ambientale. L'utilizzo della stampa a getto d'inchiostro reattiva per creare micro-agitatori di seta enzimatici e alimentati da Marangoni ci consente di alterare forme, dimensioni, distribuzioni di catalizzatori e fondere altre moieties nelle strutture in modo rapido e semplice, controllando così traiettoria, comportamento e funzioni. La stampa a getto d'inchiostro reattiva può essere applicata anche per produrre dispositivi a micromotore con altri inchiostri reattivi acquosi oltre alla seta, il che dimostra la grande versatilità di questo metodo.La persona che dimostri la procedura sarà la dottoranda Ana Jimenez-Franco del mio laboratorio. In primo luogo, tagliare cinque grammi di bozzoli di seta puliti in piccoli pezzi quadrati di un centimetro usando le forbici. In una cappa di estrazione, far bollire due litri di acqua deionizzata in un becher da due litri su una piastra calda magnetica.Aggiungere una barra di agitazione magnetica al becher di acqua deionizzata. Quindi aggiungere lentamente 4,24 grammi di carbonato di sodio all'acqua per evitare di bollire e lasciare che si dissolva. Una volta che la soluzione ricomincia a bollire, aggiungere i pezzi tagliati dei bozzoli di seta alla soluzione.Assicurarsi che tutta la seta sia sommersa e riscaldare la soluzione, mescolando costantemente per 90 minuti. Coprire il becher con un foglio di alluminio. Dopo 90 minuti, rimuovere le fibre di fibroina estratte dalla soluzione di carbonato di sodio con un'asta di vetro.Lavare le fibre di fibroina tre volte con un litro di acqua deionizzata preriscaldata, diminuendo gradualmente la temperatura per ogni lavaggio. Stendere le fibre di fibroina su un piatto cristallizzante in vetro borosilicato da 750 millilitri e metterli in un forno di essiccazione durante la notte a 60 gradi Celsius sotto pressione atmosferica. Una volta asciutte, conservare le fibre di fibroina in un contenitore chiuso a temperatura ambiente.Preparare una soluzione ternaria contenente 4,8 grammi di acqua deionizzata, 3,7 grammi di etanolo e 3,1 grammi di cloruro di calcio. Prima sciogliere il cloruro di calcio in acqua deionizzata e quindi aggiungere l'etanolo. Posizionare un pallone a due colli a due colli da 100 millilitri in un bagno d'acqua sopra una piastra calda magnetica.Quindi aggiungere la soluzione ternaria al pallone. Quindi, posizionare un termometro in uno dei colli del pallone per monitorare con precisione la temperatura della soluzione. Coprire l'altro collo con un foglio di alluminio per evitare di asciugare la soluzione a causa dell'evaporazione.Quindi, riscaldare la soluzione a 80 gradi Celsius. Quando la temperatura della soluzione è stabile a 80 gradi Celsius, rimuovere il foglio di alluminio e aggiungere un grammo di fibroina essiccata alla soluzione. Aggiungere una piccola barra di agitazione magnetica per assicurarsi che la soluzione sia mescolata bene durante tutto il processo di dissoluzione.Coprire il secondo collo del pallone con un foglio di alluminio per ridurre al minimo l'evaporazione e lasciare sciogliere per 90 minuti. Dopo 90 minuti di dissoluzione, lasciare raffreddare la soluzione di fibroina a temperatura ambiente per 10 minuti. Legare un nodo su una delle estremità di un tubo di dialisi lungo 15 centimetri.Lavare il tubo per alcuni minuti con acqua deionizzata corrente dal rubinetto. Aprire l'altra estremità del tubo di dialisi e aggiungere la soluzione di fibroina. Utilizzando un morsetto metallico, chiudere l'altra estremità del tubo di dialisi assicurando che sia chiuso il più strettamente possibile.Attaccare una delle estremità del tubo di dialisi tramite un tappo a vite a un flaconcino di plastica vuoto da 30 millilitri per consentire al tubo di dialisi di galleggiare in acqua. Quindi, posizionare il tubo di dialisi in un becher da due litri contenente due litri di acqua deionizzata. Cambiare l'acqua a intervalli regolari e controllare la conducibilità dell'acqua ogni volta che viene cambiata per seguire il processo di dialisi.Al termine della dialisi, tagliare un'estremità del tubo di dialisi con le forbici e versare la soluzione in una serie di tubi da 1,5 millilitri. Centrifugare per cinque minuti a 16000 x G per rimuovere eventuali particelle all'interno della soluzione di fibroina. Quindi, raccogli il supernatante in una fiala di plastica da 30 millilitri e conservalo a quattro gradi Celsius.Per stampare il corpo principale dei micro-agitatori artificiali semoventi, o spms, mescolare la soluzione di fibroina, polietilene glicole 400 e acqua deionizzata per realizzare 1,5 millilitri di inchiostro A.Per la stampa del motore catalitico delle stecche, mescolare la soluzione di fibroina, polietilene glicole 400, catalasi e acqua deionizzata per fare 1,5 millilitri di inchiostro B.Preparare 1,5 millilitri di inchiostro C sciogliendo 0,05 mg per millilitro di Coomassie Brilliant Blue e metanolo. Utilizzare dispositivi di getto con diametro dell'ugello di 80 micrometri per stampare gli inchiostri sul substrato di silicio, posizionati sul palco a una distanza di lavoro tra l'ugello e il substrato del wafer di silicio di circa cinque millimetri. Caricare gli inchiostri A, B e C in tre serbatoi, quindi regolare la controtendione utilizzando la valvola di contro-pressione per ogni singolo canale per assicurarsi che l'inchiostro non goccioli dai dispositivi di getto.Quindi, regolare i parametri di getto per ogni canale per assicurarsi che ogni inchiostro dia una buona formazione stabile delle goccioline. Stampare l'inchiostro di fibroina di seta strato per strato alternato al metanolo su un substrato di wafer di silicio lucido pulito. Stampare due lotti di spms di fibroina con spessore rispettivamente a 200 e 100 strati.Per rimuovere i campioni dai wafer di silicio, immergerli in acqua deionizzata e agitare delicatamente fino a quando non si verifica il distacco. Pulire una piastra di Petri in vetro di nove centimetri con acqua deionizzata e assicurarsi che la superficie sia priva di polvere. Aggiungere 10 millilitri di perossido di idrogeno prefiltrato al cinque per cento alla piastra di Petri pulita e asciutta e lasciare insediarsi.Illumina il fondo della piastra di Petri con una fresca sorgente luminosa a LED bianca. Quindi, usa una fotocamera ad alta velocità con obiettivo macro-zoom per catturare il movimento dall'alto. Ora, lavare gli agitatori di seta stampati per 10 minuti immergendoli in acqua deionizzata per rimuovere qualsiasi glicole polietilene non legato 400.Prendere con cura un agitatore lavato con la punta di un ago sterile per siringhe e posizionare al centro della piastra di Petri. Quando l'agitatore lavato tocca il combustibile perossido di idrogeno, le bolle iniziano a formarsi attorno al motore e si osserva il movimento circolare dell'agitatore. Quando il sistema appare stabile, premere registra nel software di registrazione per iniziare a catturare il video.Eseguire il tracciamento dei micro-agitatori su un telaio per fotogramma, tracciando ogni estremità degli agitatori. Le goccioline stabili formate dai dispositivi di getto consentiranno la definizione più alta dei campioni stampati come mostrato qui. A seconda delle stampanti a getto d'inchiostro utilizzate nelle dimensioni delle goccioline, la distanza tra ogni gocciolamento stampato deve essere regolata in modo tale che si sovrappongano per generare linee collegate.Quando i micro-agitatori di seta vengono collocati nella soluzione di combustibile perossido di idrogeno, la morfologia superficiale degli agitatori viene alterata a causa del rilascio delle bolle dalle strutture interne, generando piccoli pori. Qui sono mostrati fotogrammi video di due micro-agitatori rappresentativi a 100 strati e 200 strati e il 5% di combustibile perossido di idrogeno. Le linee rosse e verdi indicano le traiettorie tracciate.La velocità di rotazione può essere determinata dal cambio di orientamento della velocità come mostrato qui. Il confronto tra micro-agitatori drogati di catalasi a 100 strati e a 200 strati mostra un aumento distintivo della velocità di rotazione di circa 0,6 volte, da 60 più o meno sei giri/min a 100 più o meno 10 giri/min. Per produrre inchiostri stampabili per questa procedura, è importante che le fibre siano completamente sciolte durante il processo di dissoluzione.Questa tecnica ci ha permesso di produrre micro-agitatori alimentati da vari meccanismi, adatti per studi di agitazione e rilevamento della contaminazione come recentemente pubblicato da noi sulla rivista Small.

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Tecnica di imaging frugale del flusso capillare attraverso polveri di stampa polimerica tridimensionale

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Stampa a getto d'inchiostro reattiva e analisi di propulsione di micro-agitatori semoventi a base di seta

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