Name: Pretargeted Radioimmunotherapy basato sulla reazione di Diels-Alder domanda inversa Electron (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Scopri la radioimmunoterapia pretargeting per il trattamento del cancro colorettale utilizzando anticorpi modificati con TCO e radioligandi marcati con 177Lu. Questo metodo migliora l'efficacia terapeutica riducendo la dose alle aree sane.

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Gli autori ringraziano il Dr. Jacob Houghton per conversazioni utili. Gli autori inoltre ringraziare il NIH per loro generosi finanziamenti (R00CA178205 e U01CA221046).

<ol><li>Goldenberg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Therapy+of+Cancer+with+Radiolabeled+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeted Therapy of Cancer with Radiolabeled Antibodies.</a> Journal of Nuclear Medicine. 43 (5), 693-713 (2002).</li>
<li>Goldenberg, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunotherapy+of+B-cell+Lymphomas+with+Iodine-131-labeled+LL2+Monoclonal+Antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Radioimmunotherapy of B-cell Lymphomas with Iodine-131-labeled LL2 Monoclonal Antibody.</a> Journal of Clinical Oncology. 9 (4), 548-564 (1991).</li>
<li>Kaminski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunotherapy+with+131I-Tositumomab+for+Relapsed+or+Refractory+B-cell+non-Hodgkin+Lymphoma%3A+Updated+Results+and+Long-Term+Follow-Up+of+the+University+of+Michigan+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Radioimmunotherapy with 131I-Tositumomab for Relapsed or Refractory B-cell non-Hodgkin Lymphoma: Updated Results and Long-Term Follow-Up of the University of Michigan Experience.</a> Blood. 96 (4), 1259-1266 (2000).</li>
<li>Davies, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunotherapy+for+B-cell+Lymphoma%3A+Y90+Ibritumomab+Tiuxetan+and+I131+Tositumomab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Radioimmunotherapy for B-cell Lymphoma: Y90 Ibritumomab Tiuxetan and I131 Tositumomab.</a> Oncogene. 26, 3614(2007).</li>
<li>Rajendran, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Radiation+Dose+Estimation+for+Myeloablative+Radioimmunotherapy+for+Relapsed+or+Recurrent+Mantle+Cell+Lymphoma+Using+131I+Tositumomab+to+That+of+Other+Types+of+Non-Hodgkin%27s+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biotherapy+and+Radiopharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Comparison of Radiation Dose Estimation for Myeloablative Radioimmunotherapy for Relapsed or Recurrent Mantle Cell Lymphoma Using 131I Tositumomab to That of Other Types of Non-Hodgkin's Lymphoma.</a> Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 19 (6), 738-745 (2004).</li>
<li>Rajendran, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Dose+131I-Tositumomab+%28Anti-CD20%29+Radioimmunotherapy+for+Non-Hodgkin%27s+Lymphoma%3A+Adjusting+Radiation+Absorbed+Dose+to+Actual+Organ+Volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">High-Dose 131I-Tositumomab (Anti-CD20) Radioimmunotherapy for Non-Hodgkin's Lymphoma: Adjusting Radiation Absorbed Dose to Actual Organ Volumes.</a> Journal of Nuclear Medicine. 45 (6), 1059-1064 (2004).</li>
<li>Larson, S. M., Carrasquillo, J. A., Cheung, N. -K. V., Press, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunotherapy+of+Human+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Radioimmunotherapy of Human tumours.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 347-360 (2015).</li>
<li>Kelly, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Targeting+by+a+Multivalent+Single-Chain+Fv+%28scFv%29+Anti-Lewis+Y+Antibody+Construct%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biotherapy+%26+Radiopharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Tumor Targeting by a Multivalent Single-Chain Fv (scFv) Anti-Lewis Y Antibody Construct.</a> Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 23 (4), 411-423 (2008).</li>
<li>Yazaki, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Targeting+of+Radiometal+Labeled+Anti-CEA+Recombinant+T84.66+Diabody+and+T84.66+Minibody%3A+Comparison+to+Radioiodinated+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tumor Targeting of Radiometal Labeled Anti-CEA Recombinant T84.66 Diabody and T84.66 Minibody: Comparison to Radioiodinated Fragments.</a> Bioconjugate Chemistry. 12 (2), 220-228 (2001).</li>
<li>van Duijnhoven, S. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabody+Pretargeting+with+Click+Chemistry+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diabody Pretargeting with Click Chemistry In Vivo.</a> Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1422-1428 (2015).</li>
<li>Altai, M., Membreno, R., Cook, B., Tolmachev, V., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretargeted+Imaging+and+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pretargeted Imaging and Therapy.</a> Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1553-1559 (2017).</li>
<li>Goldenberg, D. M., Chatal, J. -F., Barbet, J., Boerman, O., Sharkey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Imaging+and+Therapy+with+Bispecific+Antibody+Pretargeting%5BTitle%5D)+AND+%22Update+on+cancer+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Cancer Imaging and Therapy with Bispecific Antibody Pretargeting.</a> Update on cancer therapeutics. 2 (1), 19-31 (2007).</li>
<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-Vivo+Chemistry+for+Pretargeted+Tumor+Imaging+in+Live+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">In-Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice.</a> Angewandte Chemie International Edition. 49 (19), 3375-3378 (2010).</li>
<li>Gestin, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Step+Targeting+of+Xenografted+Colon+Carcinoma+Using+a+Bispecific+Antibody+and+188Re-Labeled+Bivalent+Hapten%3A+Biodistribution+and+Dosimetry+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Two-Step Targeting of Xenografted Colon Carcinoma Using a Bispecific Antibody and 188Re-Labeled Bivalent Hapten: Biodistribution and Dosimetry Studies.</a> Journal of Nuclear Medicine. 42 (1), 146-153 (2001).</li>
<li>Green, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Analysis+of+Bispecific+Antibody+and+Streptavidin-Targeted+Radioimmunotherapy+for+B-cell+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative Analysis of Bispecific Antibody and Streptavidin-Targeted Radioimmunotherapy for B-cell Cancers.</a> Cancer Research. 76 (22), 6669(2016).</li>
<li>Sharkey, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Streptavidin%E2%88%92Anti-Carcinoembryonic+Antigen+Antibody%2C+Radiolabeled+Biotin+Pretargeting+Method+for+Radioimmunotherapy+of+Colorectal+Cancer.+Studies+in+a+Human+Colon+Cancer+Xenograft+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a Streptavidin−Anti-Carcinoembryonic Antigen Antibody, Radiolabeled Biotin Pretargeting Method for Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer. Studies in a Human Colon Cancer Xenograft Model.</a> Bioconjugate Chemistry. 8 (4), 595-604 (1997).</li>
<li>Knox, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+Trial+of+Yttrium-90-DOTA-Biotin+Pretargeted+by+NR-LU-10+Antibody%2FStreptavidin+in+Patients+with+Metastatic+Colon+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Phase II Trial of Yttrium-90-DOTA-Biotin Pretargeted by NR-LU-10 Antibody/Streptavidin in Patients with Metastatic Colon Cancer.</a> Clinical Cancer Research. 6 (2), 406(2000).</li>
<li>Schubert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Tumor+Pretargeting+System+Based+on+Complementary+L-Configured+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel Tumor Pretargeting System Based on Complementary L-Configured Oligonucleotides.</a> Bioconjugate Chemistry. 28 (4), 1176-1188 (2017).</li>
<li>Forero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1+Trial+of+a+Novel+Anti-CD20+Fusion+Protein+in+Pretargeted+Radioimmunotherapy+for+B-cell+Non-Hodgkin+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phase 1 Trial of a Novel Anti-CD20 Fusion Protein in Pretargeted Radioimmunotherapy for B-cell Non-Hodgkin Lymphoma.</a> Blood. 104 (1), 227(2004).</li>
<li>Kalofonos, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+Tumor+in+Patients+with+Indium-111-Labeled+Biotin+and+Streptavidin-Conjugated+Antibodies%3A+Preliminary+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging of Tumor in Patients with Indium-111-Labeled Biotin and Streptavidin-Conjugated Antibodies: Preliminary Communication.</a> Journal of Nuclear Medicine. 31 (11), 1791-1796 (1990).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pretargeted+PET+Imaging+Strategy+Based+on+Bioorthogonal+Diels-Alder+Click+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54 (8), 1389-1396 (2013).</li>
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<li>Cheal, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theranostic+Pretargeted+Radioimmunotherapy+of+Colorectal+Cancer+Xenografts+in+Mice+Using+Picomolar+Affinity+Y-86-+or+Lu-177-DOTA-Bn+Binding+scFv+C825%2FGPA33+IgG+Bispecific+Immunoconjugates%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+nuclear+medicine+and+molecular+imaging%22%5BJournal%5D)">Theranostic Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer Xenografts in Mice Using Picomolar Affinity Y-86- or Lu-177-DOTA-Bn Binding scFv C825/GPA33 IgG Bispecific Immunoconjugates.</a> European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 43 (5), 925-937 (2016).</li>
<li>Meyer, J. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+Masking+of+Circulating+Antibody-TCO+Groups+Using+Tetrazine-Functionalized+Dextran+Polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal Masking of Circulating Antibody-TCO Groups Using Tetrazine-Functionalized Dextran Polymers.</a> Bioconjugate Chemistry. 29 (2), 538-545 (2018).</li>
<li>Houghton, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretargeted+Immuno-PET+of+Pancreatic+Cancer%3A+Overcoming+Circulating+Antigen+and+Internalized+Antibody+to+Reduce+Radiation+Doses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pretargeted Immuno-PET of Pancreatic Cancer: Overcoming Circulating Antigen and Internalized Antibody to Reduce Radiation Doses.</a> Journal of Nuclear Medicine. 57 (3), 453-459 (2016).</li>
<li>Keinänen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretargeting+of+Internalizing+Trastuzumab+and+Cetuximab+with+a+%2818%29F-Tetrazine+Tracer+in+Xenograft+Models%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging+Research%22%5BJournal%5D)">Pretargeting of Internalizing Trastuzumab and Cetuximab with a (18)F-Tetrazine Tracer in Xenograft Models.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Research. 7, 95(2017).</li>
<li>Billaud, E. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-flow+Photosynthesis+of+New+Dienophiles+for+Inverse-Electron-Demand+Diels-Alder+Reactions.+Potential+Applications+for+Pretargeted+In+Vivo+PET+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Micro-flow Photosynthesis of New Dienophiles for Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactions. Potential Applications for Pretargeted In Vivo PET Imaging.</a> Chemical Science. 8 (2), 1251-1258 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Uno dei punti di forza di questo approccio per in vivo pretargeting — soprattutto in relazione alle strategie fondate sugli anticorpi anticorpo e radioattivi apteni — è la sua modularità: trans- ciclottene moiety possono essere aggiunti a qualsiasi anticorpo, e tetrazine radioligands possono essere radioattivi con una straordinaria varietà di radionuclidi senza alterare la loro capacità di reagire con i loro partner di clic. Ancora l'adattamento di questo approccio per altri sistemi antigene/anticorpo n...

Radioimmunoterapia (RIT) — l'uso degli anticorpi per la consegna dei radionuclidi terapeutici ai tumori — è stata a lungo un seducente approccio per il trattamento di cancro1,2. Infatti, questa promessa è stata sottolineata dalla United States Food and Drug Administration l'approvazione di due radioimmunoconjugates per il trattamento del linfoma Non-Hodgkin: 90Y-ibritumomab tiuxetano e 131-tositumomab3 , 4. ma anche dai suoi primi giorni, le prospettive cliniche di RIT sono state ostacolate da una complicazione critica: intensità di dose elevata radiazione ai tessuti sani5,6. In generale, radioimmunoconjugates per RIT sono etichettati con radionuclidi piu ' longevi (ad es., 131io [t½ = 8,0 giorni] e 90Y [t½ = 2,7 giorni]) con emivite fisiche che si incastrano bene con il emivita lunga farmacocinetica delle immunoglobuline. Questo è essenziale, in quanto garantisce che la radioattività sufficiente rimane una volta che l'anticorpo ha raggiunto la biodistribuzione ottimale dopo diversi giorni di circolazione. Tuttavia, questa combinazione di tempi di permanenza lunga nel sangue ed emivita lunga fisica comporta inevitabilmente l'irradiazione dei tessuti sani, riducendo i rapporti terapeutici e limitare l'efficacia della terapia7. Diverse strategie sono state esplorate per aggirare questo problema, compreso l'uso di frammenti anticorpali troncato come Fab, Fab', punto2, minibodies e nanobodies8,9,10. Uno dei più promettenti e affascinante, ma innegabilmente complessi approcci alternativi è in vivo pretargeting11.
In vivo pretargeting è un approccio alla terapia che cerca di sfruttare la squisita affinità e selettività degli anticorpi bordando loro farmacocinetica inconvenienti11,12,13e imaging nucleare. A tal fine, l'anticorpo radioattivo utilizzato nel tradizionale radioimmunotherapy viene decostruito in due componenti: una piccola molecola radioligand e un immunoconjugate che può legarsi sia un antigene tumorale e il suddetto radioligand. Il immunoconjugate è iniettato prima e dato un 'vantaggio', spesso parecchi giorni, durante i quali si accumula nel tessuto bersaglio e Cancella dal sangue. Successivamente, la piccola molecola radioligand è amministrato e combina con il immunoconjugate al tumore o cancella rapidamente dal corpo. In sostanza, in vivo pretargeting si basa sulla esecuzione di radiochimica all'interno del corpo stesso. Riducendo la circolazione della radioattività, questo approccio riduce le dosi di radiazione ai tessuti sani e facilita l'uso di radionuclidi contemporaneamente (ad es., 68Ga, t½ = 68 min211; Come, t½ = 7,2 h) con emivite che in genere sono considerate incompatibili con i vettori di base di anticorpi.
A partire nel tardo 1980, sono stati sviluppati una manciata di diversi approcci per in vivo pretargeting, comprese strategie basate sugli anticorpi anticorpo, l'interazione tra streptavidina e biotina e l'ibridazione di complementari oligonucleotidi14,15,16,17,18. Eppure ognuno è stata frenata a vari gradi di complicazioni, più notoriamente l'immunogenicità potente di anticorpi streptavidina-modificato19,20. Negli ultimi cinque anni, il nostro gruppo e altri hanno sviluppato un approccio in vivo pretargeting basato sulla rapida e bioorthogonal inversa electron demand Diels-Alder legatura tra trans- ciclottene (TCO) e tetrazine (Tz) 21,22,23,24. Il maggior successo di queste strategie hanno impiegato un anticorpo TCO-modificato e un radioligand Tz-cuscinetto, come TCO è in genere più stabile in vivo oltre la Tz partner (Figura 1)25,26. Come in altre metodologie pretargeting, il immunoconjugate mAb-TCO è amministrato in primo luogo e dato il tempo di cancellare dalla circolazione e si accumulano nel tessuto del tumore. Successivamente, la piccola molecola Tz radioligand viene iniettato, dopo di che fa clic con il immunoconjugate all'interno del tessuto bersaglio o cancella rapidamente dal corpo. Questo in vivo pretargeting strategia si è dimostrato altamente efficace per PET e SPECT imaging con diversi sistemi di diversi anticorpi e antigeni, costantemente producendo immagini con contrasto elevato e consentendo l'uso di radionuclidi di breve durata come 18 F (t½ = 109 min) e 64Cu (t1/2 = 12.7 ore)21,22,24. Più recentemente, l'efficacia di basati su clic pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) è stata dimostrata in modelli murini di adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) e carcinoma colorettale27,28. A tal fine, i radionuclidi terapeutici 177Lu (βmax = 498 keV, t1/2 = 6,7 giorni) è stato impiegato in combinazione con due differenti anticorpi: 5B1, che si rivolge l'antigene carboidratico 19.9 (CA 19.9) espressa ubiquitariamente in PDAC , e huA33, che si rivolge A33, una glicoproteina transmembrana espressa in > 95% dei cancri colorettali. In entrambi i casi, questo approccio a 177Lu-PRIT ha reso le concentrazioni di alta attività nel tessuto del tumore, ha creato un effetto terapeutico dose-dipendente e contemporaneamente ridotte concentrazioni di attività in tessuti sani rispetto ai tradizionali direttamente-con l'etichetta radioimmunoconjugates.
In questo articolo, descriviamo i protocolli per PRIT utilizzando un 177Lu-DOTA-etichettati tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) e una variante di TCO-modificato dell'anticorpo huA33 (huA33-TCO). Più specificamente, descriviamo la costruzione di huA33-TCO (Figura 2), la sintesi e radiolabeling [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (Figura 3 e Figura 4) e le prestazioni di in vivo biodistribuzione e terapia longitudinale studi in modelli murini di carcinoma colorettale. Inoltre, nei risultati rappresentativi e discussione, presentiamo un set di dati campione, possibili strategie di indirizzo per l'ottimizzazione di questo approccio e considerare questa strategia nel contesto più ampio di in vivo pretargeting e PRIT. Infine, è importante notare che mentre abbiamo scelto di concentrarsi su pretargeting utilizzando huA33-TCO e [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz in questo protocollo, questa strategia è altamente modulare e può essere adattato per soddisfare una vasta gamma di anticorpi e radionuclidi.

<table><tbody><tr><td>(E)-Cicloott-4-enile 2,5-diosso-1-pirrolidinil carbonato (TCO-NHS)</td><td>Sigma-Aldrich 764523</td><td></td><td>Conservare a -80 gradi; C</td></tr><tr><td>2,5-Dioxo-1-pirrolidinil 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-il)benzilammino]-5-ossopentanoato (Tz-NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764701</td><td>Negozio a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Acetonitrile (MeCN)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di ammonio (NH4OAc)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A639-500</td><td></td></tr><tr><td>Boc-PEG7-ammina (O-(2-amminoetil)-O&prime;-[2-(Boc-ammino)etil]esaetilenglicole)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70023</td><td>Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Diclorometano (DCM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D143-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO), anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore Amicon Ultra-2 Unità di filtro centrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC205024</td><td></td></tr><tr><td>GE Healthcare Colonne di desalinizzazione PD-10 monouso</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>N, N-dimetilformammide (DMF), anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC610941000</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>70-011-044</td><td>10x concentrato</td></tr><tr><td>p-SCN-Bn-DOTA</td><td>Macrociclici</td><td>B-205</td><td>Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Trietilammina (TEA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC157911000</td><td></td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico (TFA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A116-50</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di tumore</td><td>Peira TM900</td><td>Peira TM900</td><td></td></tr></tbody></table>

pretargeted radioimmunotherapy basato sulla reazione di diels-alder domanda inversa electron

Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction

Mentre radioimmunoterapia (RIT) è un approccio promettente per il trattamento del cancro, l'emivita lunga farmacocinetica degli anticorpi radiomarcati può provocare dosi di alta radiazione ai tessuti sani. Forse non a caso, diverse strategie differenti sono state sviluppate per aggirare questa limitazione preoccupante. Uno dei più promettenti di questi approcci è pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT si basa sul disaccoppiamento radionuclide dall'immunoglobulina, iniettando loro separatamente e quindi consentendo loro di combinare in vivo presso il tessuto bersaglio. Questo approccio sfrutta le eccezionali proprietà di targeting tumorale di anticorpi costeggiando i loro svantaggi farmacocinetiche, quindi riducendo le dosi di radiazione ai tessuti non bersaglio e facilitare l'uso di radionuclidi con emivite che sono considerato troppo breve per uso in radioimmunoconjugates tradizionale. Negli ultimi cinque anni, il nostro laboratorio ed altri hanno sviluppato un approccio in vivo pretargeting basato sulla reazione di Diels-Alder (IEDDA) dell'elettrone-domanda inversa tra trans- ciclottene (TCO) e tetrazine (Tz). Questa strategia è stata applicata con successo a pretargeted tomografia a emissione di positroni (PET) ed emissione del singolo-fotone tomografia (SPECT) imaging con una varietà di sistemi antigene-anticorpo. In un paio di pubblicazioni recenti, abbiamo dimostrato l'efficacia di PRIT basati su IEDDA in modelli murini di adenocarcinoma duttale pancreatico e carcinoma colorettale. In questo protocollo, descriviamo protocolli per PRIT utilizzando un 177Lu-DOTA-etichettati tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) e una variante di TCO-modificato del cancro colorettale targeting huA33 anticorpo (huA33-TCO). Più specificamente, descriveremo la costruzione di huA33-TCO, la sintesi e radiolabeling [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz e le prestazioni di biodistribuzione in vivo e studi longitudinali terapia in modelli murini di carcinoma colorettale.

La coniugazione del TCO per huA33 si basa sull'accoppiamento tra il TCO-NHS ammina-reattivo e i residui di lisina sulla superficie dell'immunoglobulina. Questo metodo è altamente affidabile e riproducibile e affidabile produce una grado-di-etichettatura di TCO/mAb 2-4. In questo caso, spettrometria di massa MALDI-ToF è stata impiegata per confermare un certo grado di etichettatura di circa 4,0 TCO/mAb; un valore simile è stato ottenuto utilizzando un tetrazine fluorophore-modificato come ...

Questo protocollo descrive la sintesi e la caratterizzazione di un trans- ciclottene (TCO)-anticorpo e un radioligand tetrazine Lu-etichettati (Tz) 177per pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) modifica. Inoltre, vi si descrive l'uso di questi due costrutti di biodistribuzione in vivo e studi longitudinali terapia in un modello murino di cancro colorettale.

Pretargeted Radioimmunotherapy basato sulla reazione di Diels-Alder domanda inversa Electron

While radioimmunotherapy (RIT) is a promising approach for the treatment of cancer, the long pharmacokinetic half-life of radiolabeled antibodies can ...

Questo protocollo descrive come applicare una metodologia pre-mirata alla radioterapia mirata delle xenografie tumorali nel modello del topo. La radioimmunoterapia pre-mirata o PRIT ci consente di iniettare l'anticorpo e il radioligand separatamente e lasciare che i due si combinino in vivo usando la chimica dei clic. Mentre presentiamo PRIT utilizzando un modello di xenografo di cancro del colon-retto, questa tecnica può essere applicata a qualsiasi anticorpo di targeting antigene superficiale.È importante selezionare un antigene che non si interiorizzi rapidamente o persi ampiamente in quanto questi possono ridurre l'efficacia dell'approccio. Per sintetizzare huA33-TCO preparare prima una soluzione di 125 microlitri di 40 milligrammi per millilitro TCO-NHS in metilformamide secca in un tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri. Questa soluzione può essere aliquota e congelata a 80 gradi celsius per l'uso in esperimenti futuri.In un tubo di microcentrifugo separato da 1,7 millilitri preparare una soluzione di cinque milligrammi per millilitro di huA33 in un millilitro di soluzione salina tamponata con fosfato. Utilizzando piccole aliquote di carbonato di sodio molare 0,1, regolare il pH della soluzione anticorpale tra 8,8 e 9,0. Utilizzare carta pH o un pH meter con un microelettrodo per monitorare il pH e fare attenzione che il pH non superi 9,0.Aggiungere un volume corrispondente all'equivalenza molare 40 di TCO-NHS alla soluzione anticorpale. Per prevenire la precipitazione del TCO-NHS idrofobico, aggiungerlo lentamente e con agitazione. Lasciare incubare la reazione a 25 gradi Celsius su un miscelatore termico per un'ora con lieve agitazione.Prima di purificare l'immunoconigiudato huA33-TCO utilizzando una colonna di desalinizzazione di esclusione delle dimensioni usa e getta precondiché imballata, equilibrare la colonna di esclusione delle dimensioni descritta dal fornitore per rimuovere eventuali conservanti presenti nella colonna durante la conservazione che di solito comporta il lavaggio della colonna cinque volte con un volume di PBS corrispondente al volume della colonna. Aggiungere la miscela di reazione alla colonna di esclusione delle dimensioni, annotando il volume della miscela di reazione. Dopo che la miscela di reazione è entrata nella colonna aggiungere una quantità appropriata di PBS per portare il volume totale di soluzione aggiunta alla colonna fino a 2,5 millilitri.Raccogliere il prodotto utilizzando due millilitri di PBS come eluente. Misurare la concentrazione dell'huA33-TCO utilizzando uno spettrofotometro UV vis che monitora la lunghezza d'onda a 280 nanometri. Se si desidera una soluzione con una maggiore concentrazione di immunoconijugate, concentrare la soluzione huA33-TCO utilizzando un'unità filtrante centrifuga con un taglio di peso molecolare di 50.000 persone seguendo le istruzioni del produttore.Conservare l'immunocongiudato huA33-TCO completato a 4 gradi celsius al buio. Se deve essere usato più di quattro giorni in futuro, conservarlo a 80 gradi celsius al buio. In un tubo di centrifuga da 1,7 millilitri aggiungere 200 microlitri di tampone di acetato di ammonio molare regolato in pH 5,5.Aggiungere la quantità desiderata di cloruro di Lutezio-177 alla soluzione tampone. La quantità aggiunta dipenderà dal numero di soggetti dell'esperimento e dalle dosi radioattive somministrate. Aggiungere tetrazina PEG7-DOTA in DMSO alla miscela radioattiva.L'importo aggiunto dipende dal numero di soggetti sottoposti a test. Lasciare incubare la soluzione a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Verificare che l'etichettatura radio sia completa utilizzando la cromatografia a strato sottile e radio istantaneo con 50 millimolare EDTA pH 5.5 come fase mobile.L'etichetta Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazine rimarrà al basale mentre il Lutezio-177 gratuito sarà coordinato dall'EDTA e viaggerà con il fronte solvente. È fondamentale che il posizionamento dei tumori sottocutanei non interferisca con la tecnica di ritenuta. Consiglio di posizionarli sul lato del fianco che è opposto alla tua mano restrittiva.Da quando mi trattengo con la mano sinistra ho scelto di posizionare i tumori sul fianco destro. Ordina topi nudi atimici femminili con xenografo del cancro del colon-retto, in modo che il volume medio del tumore in ogni coorte sia approssimativamente uguale. Per fare ciò, elenca i numeri di identificazione degli animali, il modello di tacca dell'orecchio e il volume tumorale in tre colonne separate di un programma di fogli di calcolo.Ordinare i dati dal più piccolo al più grande volume tumorale. In una quarta colonna assegnare a ciascun animale un numero di gabbia. Pedala attraverso le gabbie in un modello simile a un serpente fino a quando a tutti gli animali viene assegnata una gabbia.Una volta assegnate le gabbie, ordinare i dati in base al numero della gabbia. Per iniettare l'immunoconiuvante precomporre dosi di 150 microlitri di soluzione huA33-TCO in siringhe pretrattate con albumina siemica bovina all'1% in PBS e conservare queste siringhe sul ghiaccio. Per iniettare il radioligand, preleva prima dosi in 150 microlitri di soluzione salina sterile allo 0,9% contenente 1,1 equivalenza molare della Tetrazina-PEG7-DOTA radiomarcata rispetto alla quantità di huA33-TCO somministrata.Utilizzare le pinze per misurare il lato più lungo del tumore oblungo e la larghezza che è perpendicolare alla lunghezza. Pesare ogni mouse su una bilancia per tenere traccia dell'aumento di peso o della perdita di peso nel tempo. Infine, calcola il volume usando la formula per il volume di un ellissoide supponendo che l'altezza sia approssimativamente uguale alla larghezza.Qui è mostrata la biodistribuzione di un pretargeting in vivo con huA33-TCO e Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazine in topi nudi atimici con tumori del caner colorettale umano SOTTOcutanei SW1222. Tutti gli intervalli di iniezione producono alte concentrazioni di attività nel tessuto tumorale e basse concentrazioni di attività negli organi sani. L'intervallo di iniezione di 24 ore offre il più alto assorbimento tumorale a 120 ore dopo l'iniezione.Sulla base di questi risultati è stato scelto un intervallo di 24 ore per il successivo studio di terapia longitudinale. Qui è mostrato lo studio di terapia longitudinale di cinque gruppi di topi con tumori SW1222 sottocutanei raffigurati nel volume medio del tumore in funzione del tempo e volume tumorale normalizzato al volume iniziale in funzione del tempo. C'è una netta differenza nella risposta delle coorti sperimentali rispetto ai gruppi di controllo.Mentre i tumori nei topi che ricevevano solo un componente della strategia di radioimmunoterapia pre-mirata continuavano a crescere incontrollati, i tumori dei topi che ricevevano il regime completo di radioimmunoterapia pre-mirata hanno smesso di crescere e alla fine si sono arrestati. È importante sottolineare che non sono stati osservati effetti collaterali tossici e tutti gli animali hanno mantenuto un peso entro il 20% della loro massa iniziale. Sorprendentemente, i topi delle coorti sperimentali avevano un perfetto record di sopravvivenza alla fine dell'indagine.Quando si tenta questa procedura è della massima importanza misurare in modo accurato e riproducibile i tumori. Quando si lavora con la radioattività, consultare il responsabile della sicurezza delle radiazioni dell'istituto per sviluppare protocolli e strutture sicuri. Disporre di adeguati controlli di sicurezza limiterà l'esposizione ed eviterà la contaminazione.Il pretargeting offre una dose di radiazioni inferiore agli organi di fondo rispetto alla radioimmunoterapia tradizionale. Condividendo questo protocollo speriamo che altri possano essere in grado di testare i propri modelli e idee che porteranno a nuovi ed entusiasmanti progressi per il trattamento del paziente.

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Questo video descrive la tecnica della radioimmunoterapia premirata o PRIT, in cui vengono somministrati immunoconiugati seguiti da radioligandi per il trattamento dei tumori. Questa radioimmunoterapia riduce le dosi di radiazioni ai tessuti sani e utilizza radionuclidi con emivite molto basse incompatibili con vettori basati su anticorpi.

Radioimmunoterapia premirata: un metodo per la somministrazione mirata di radionuclidi terapeutici ai tumori

La cicloaddizione di Diels-Alder per la domanda di elettroni inversi bioortogonali è stata sfruttata per creare una strategia di imaging PET premirata efficace e modulare per il cancro. In questo protocollo, le fasi di questa metodologia sono descritte nel contesto di un sistema modello che impiega l'anticorpo mirato al cancro del colon-retto huA33 e un radioligando marcato con 64Cu.

Sfruttando la domanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder cicloaddizione per Pretargeted PET Imaging

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Il bioconjugation e radiosintesi di<sup&gt; 89</sup&gt; Anticorpi Zr-DFO-etichettati

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Preparazione e valutazione di<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc marcato tridentate chelati di pre-targeting Utilizzando Bioorthogonal Chimica

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