Un metodo basato su fluorescenza per studiare la regolazione genica batterica nei tessuti infetti

Questo metodo può rivelare modelli spaziali di espressione genica batterica e strategie per l'adattamento fisiologico ai micro-ambienti del tessuto ospite che si perdono se mediati su tutta la popolazione nei tessuti. Con questa tecnica possono essere rilevate potenziali eterogeneità che devono essere prese in considerazione quando si identificano nuove vie batteriche e proteine da prendere di mira da antivirulenza o composti antibatterici. Inizia striando ceppi di S.aureus di interesse sulle placche di agar del sangue da uno stock di glicerolo congelato e incubando le piastre a 37 gradi Celsius per 16-24 ore per confermare i loro fenotipi emolitici in base alla loro capacità di lisciviare i globuli rossi e formare zone trasparenti chiare.

Inoculare gli isolati a singola colonia di ogni ceppo in quattro millilitri di brodo di soia triptico, o TSB, in tubi di vetro sterili e ruotare i tubi a 37 gradi Celsius per 16-24 ore in un rullo tubolare con un angolo di circa 70 gradi e 70 rotazioni al minuto. La mattina seguente misurare la densità ottica a 600 nanometri, o OD 600, delle colture su uno spettrofotometro e diluire le cellule a un OD 600 di 0,05 in 25 millilitri di TSB sterile con un rapporto tra cinque e uno pallone/volume in flaconi Delong da 125 millilitri. Incubare le colture in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius a 280 rotazioni al minuto e raccogliere le cellule durante la fase esponenziale.

Pellet le cellule per centrifugazione e lavare le cellule due volte in un volume uguale di PBS sterile. Quindi resuspend le cellule in PBS fresco a una per 10 all'ottava colonia formando unità per concentrazione di millilitro per la loro successiva iniezione in un animale ricevente. Nel punto finale sperimentale appropriato, raccogliere il rene, il cuore, il fegato, i polmoni e la milza in tubi di polipropilene da 15 millilitri contenenti formalina tamponata al 10% per un'incubazione da 24 a 48 ore al buio a temperatura ambiente con delicati scuotimenti o rotazioni.

Alla fine della fissazione, incorporare gli organi in un mezzo di congelamento dei tessuti chiari per la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Utilizzare un criostato per acquisire sezioni di tessuto spesse 10 micrometri e asciugare le sezioni su singoli vetri carichi pre-puliti per 20 minuti al buio prima di applicare un supporto di montaggio duro integrato con DAPI. Quindi applicare le scivolate di copertura e polimerizzarle a temperatura ambiente durante la notte prima di trasferire i campioni in conservazione a lungo termine a quattro gradi Celsius.

Per identificare le lesioni all'interno dei campioni, posizionare una diapositiva sullo stadio di un microscopio confocale a scansione laser e utilizzare un obiettivo appropriato per visualizzare le singole cellule per acquisire immagini delle lesioni. Per misurare le intensità di fluorescenza all'interno delle immagini confocali, aprire un'immagine in ImageJ e regolare la luminosità e il contrasto per visualizzare correttamente il segnale di fluorescenza della lesione. Definire l'area di interesse utilizzando lo strumento selezioni poligonale e aggiungere il ROI al gestore del ROI nella scheda Modifica in ImageJ.

Selezionare Modifica, quindi Selezione e infine Aggiungi a Manager. Rinominare quindi il ROI ed etichettare la rispettiva immagine. Per definire il baricentro, aprite la scheda Analizza (Analyze) e selezionate Area, Valore grigio medio (Mean Gray Value), Baricentro (Centroid) e Limite a soglia (Limit to Threshold).

Estrarre il valore di intensità della fluorescenza centroide o misurare l'intensità media della fluorescenza in una data lesione per unità di area. Ciò può essere ottenuto utilizzando la funzione di soglia per impostare i limiti di fluorescenza inferiore e superiore, se necessario. Esportare i dati in un file excel e preparare una colonna che indichi l'intensità media della fluorescenza per unità di area per la periferia e il nucleo.

Per calcolare le intensità di fluorescenza media per unità di area nella periferia e nel nucleo, definire manualmente i limiti superiore e inferiore della soglia. Staphylococcus aureus termonucleasi GFP la fluorescenza di fusione è in media quasi nove volte superiore nelle cellule che trasportano il gene di fusione rispetto alle cellule che non trasportano la fusione reporter. Allo stesso modo, la fluorescenza a fusione di pomodoro dimerica tandem è circa sei volte superiore al controllo nullo del reporter.

Il modello delle attività dei reporter può essere confermato dalla citometria a flusso con omogeneati tissutali. Sebbene le differenze di piegatura nella fluorescenza siano tipicamente inferiori. Le variazioni nelle misurazioni della fluorescenza possono essere dovute all'espressione eterogenea dei giornalisti.

Ad esempio, in questi campioni rappresentativi è stato osservato che alcune lesioni hanno espresso uno o entrambi i giornalisti entro circa 100 micrometri di distanza nello stesso campione di tessuto. Esaminando l'attività del reporter a una risoluzione a singola cellula nelle comunità di acesso stafilococco rivela una regolazione spaziale dell'espressione della termonucleasi stafilococco aureo negli ascessi circoscritti con forte colorazione DAPI, probabilmente associata alla formazione e al rilascio di trappole extracellulari neutrofile. Ad esempio, nel nucleo interno della comunità dell'acesso stafilococco aureo si osserva una fluorescenza di fusione GFP significativamente più elevata rispetto alla localizzata alla periferia.

Nello stesso acesso, il modello per la fluorescenza a fusione di pomodoro dimerica tandem sembra essere invertito. Tuttavia, il modello di questo esperimento non era statisticamente significativo. Ottenere dissezioni crio-incorporate intatte è vitale per l'analisi dell'immagine a fluorescenza e deve essere fatto con attenzione.

Lo smistamento delle cellule batteriche per catturare sotto-popolazioni che esprimono la fusione in varia misura, insieme all'analisi RNA-Seq potrebbe illuminare i cambiamenti a livello genomico nel trascrittame. Prestare attenzione quando si lavora con la formalina in quanto cancerogena e può causare irritazione cutanea, reazioni allergiche o danni agli occhi all'esposizione diretta. Generare derivati mutanti di ceppi che trasportano reporter fluorescenti di interesse può aiutare a rivelare le basi genetiche per i modelli regolatori spaziali osservati.