Name: Sintesi e Bioconjugation di tiolo-reattive reagenti per la creazione del sito-selettivamente per volta efattori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Scopri la sintesi e la bioconiugazione del reagente PODS per proteine e peptidi. Questo metodo semplice migliora le tecniche tradizionali e consente la preparazione in qualsiasi laboratorio.

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Gli autori ringraziano il Dr. Sai Kiran Sharma per conversazioni utili.

1. la sintesi di 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)
Nota: A causa della sensibilità alla luce del composto, tenere tutte le reazioni nei vasi coperti di stagnola.
<ol><li>In 10 mL di un pallone, sciogliere 100 mg (0.517 mmol, 1 equivalente) di 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol in 3 mL di metanolo.</li>
	<li>Per questa soluzione, aggiungere 360 μL di diisopropylethylamine (DIPEA; 2.07 mmol; 4 equivalenti; anidro) e una piccola ancoretta magnetica. Coprire il recipiente con un tappo di gomma e agitare la soluzione per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilizzando una siringa di vetro da 1 mL, poke un buco attraverso il tappo di gomma e aggiungere rapidamente 32 μL (0.517 mmol, 1 equivalente) di iodometano a questa miscela. Lasciare che la miscela di reazione per 45 minuti a temperatura ambiente. Nota: A causa degli effetti nocivi potenziali di iodometano, questa reazione deve essere eseguita in una cappa chimica.</li>
	<li>Impostare il bagno di acqua di un evaporatore rotante a 40 ° C e lentamente ridurre la pressione per rimuovere il solvente per permettersi un solido bianco.</li>
	<li>Sciogliere il solido in 3 mL di acetato di etile e lavare almeno tre volte con 5 mL di soluzione di carbonato di sodio 0,1 M utilizzando un imbuto separatore. Nota: Periodicamente prendere posto-test della fase acquosa sotto una lampada UV; una volta che non si vede sotto la lampada, è possibile interrompere i lavaggi.</li>
	<li>Raccogliere la fase organica in un imbuto separatore e lavarlo con acqua fino a quando il pH della fase acquosa raggiunge 6,8-7,0 (utilizzando carta pH).</li>
	<li>Raccogliere la fase organica e aggiungere solfato di magnesio per rimuovere eventuali tracce di acqua. Nota: Il solfato di magnesio deve essere aggiunto con una spatolina, dopo di che la soluzione dovrebbe essere roteata. Se le particelle fini di agente essiccatore sono ancora visti, la soluzione è asciutta. In caso contrario, aggiungere piccole quantità di solfato di magnesio fino a quando le particelle fini possono essere visto.</li>
	<li>Filtrare la miscela utilizzando un setto di vetro medio o carta da filtro.</li>
	<li>Far evaporare le sostanze volatili utilizzando un evaporatore rotante, un processo che dovrebbe produrre il prodotto desiderato come aghi bianchi.</li>
</ol>2. la sintesi di tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] carbammato (2)
Nota: A causa della sensibilità alla luce del composto, tenere tutte le reazioni nei vasi coperti di stagnola.
<ol><li>In 25 mL di un pallone, sciogliere 387 mg (0,92 mmol, 1,0 equivalenti) di NBoc-N′-succinil-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine in 10 mL di diclorometano.</li>
	<li>Per questa soluzione, aggiungere 480 μL (2,76 mmol, 3 equivalenti) di DIPEA, 264 mg (1,38 mmol; 1,5 equivalenti) di N-etil - N′-[3-(dimetilammino) propil] carbidimiide cloridrato (EDCI) e 200 mg (0.97 mmol, 1,1 equivalenti) di 1. Sigillare il recipiente con un tappo di vetro e lasciare che la reazione di mescolare per 5 giorni a temperatura ambiente. Nota: Essere consapevoli dell'evaporazione del diclorometano. Se necessario, aggiungere più per tutta la settimana.</li>
	<li>Lavare la miscela in un imbuto separatore con una soluzione di acido cloridrico 1 M (3 x 5 mL).</li>
	<li>Raccogliere la fase organica e continuare a lavare in un imbuto separatore, prima con una soluzione di 1m Na2CO3 (2 x 5 mL) e poi con acqua (3 x 5 mL).</li>
	<li>Raccogliere la fase organica e aggiungere solfato di magnesio per rimuovere eventuali tracce di acqua (Vedi punto 1.7). Filtrare la miscela utilizzando un setto di vetro medio o carta da filtro.</li>
	<li>Utilizzando un evaporatore rotante, rimuovere i solventi volatili sotto pressione ridotta per permettersi un solido biancastro.</li>
	<li>Ri-sciogliere questo solido in 10 mL di acetato di etile e precipitare il prodotto tramite l'aggiunta graduale (ad es., 2 mL in un momento) di 30 mL di cicloesano.</li>
	<li>Filtrare la soluzione con carta da filtro o un setto di vetro medio per ottenere il prodotto come una polvere bianca.</li>
</ol>3. la sintesi di tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] carbammato (3)
Nota: A causa della sensibilità alla luce del composto, tenere tutte le reazioni nei vasi coperti di stagnola.
<ol><li>In un pallone da 10 mL, sciogliere 30 mg (0,05 mmol; 1 equivalente) di 2 a 4 mL di diclorometano.</li>
	<li>Lentamente aggiungere a 49 mg (0,2 mmol; 4 equivalenti) di 70% di acido m-chloroperbenzoic a questa miscela e coprire il recipiente di reazione con un tappo di vetro. Agitare la soluzione durante la notte a temperatura ambiente, in ultima analisi, producendo una miscela di gialla.</li>
	<li>Lavare la miscela gialla in un imbuto separatore, prima con una soluzione 0,1 M di NaOH (3 x 5 mL) e poi con acqua (3 x 5 mL).</li>
	<li>Asciugare la fase organica con il solfato di magnesio e filtrare la miscela utilizzando un setto di vetro medio o carta da filtro.</li>
	<li>Utilizzando un evaporatore rotante, rimuovere i solventi sotto pressione ridotta per ottenere il prodotto come un solido pallido.</li>
</ol>4. la sintesi di N1-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N4-{4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl] fenil} succinamide (PODS)
<ol><li>In 25 mL di un pallone, sciogliere 30 mg di 3 a 2,0 mL di diclorometano.</li>
	<li>Aggiungere 400 μL di acido trifluoroacetico e sigillare il recipiente con un tappo di vetro.</li>
	<li>Mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 3 ore.</li>
	<li>Utilizzando un evaporatore rotante, rimuovere le sostanze volatili sotto pressione ridotta a temperatura ambiente, lasciando un residuo oleoso.</li>
	<li>Sciogliere il residuo oleoso in 7 mL di acqua e, utilizzando un imbuto separatore, lavare con acetato di etile (3 x 4 mL). Mantenere lo strato acquoso.</li>
	<li>Lyophilize lo strato acquoso per permettersi baccelli come una polvere bianca. Nota: I coefficienti di assorbimento molare per cialde a 280 e 298 nm sono 9.900 e 12.400 cm-1M-1, rispettivamente.</li>
</ol>5. la sintesi di baccelli-DOTA
<ol><li>In una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, sciogliere 10 mg di cialde in 300 μL di solfossido dimetilico (0.018 mmol; 1 equivalente) e aggiungere 26 μL di N, N-diisopropylethylamine (0,15 mmol; 8 equivalenti).</li>
	<li>Sciogliere 15,2 mg di DOTA-Bn-NCS (0.02 mmol; 1,2 equivalenti) in 100 μL del dimetilsulfossido e combinare questa soluzione con la soluzione dal passaggio 5.1. Sigillare il tubo del microcentrifuge.</li>
	<li>Consentire la reazione a incubare per una notte a temperatura ambiente.</li>
	<li>Purificare il prodotto mediante cromatografia HPLC di inverso-fase C18 per rimuovere qualsiasi non reagito DOTA-Bn-NCS. Nota: Tempi di ritenzione sono ovviamente fortemente dipendente dalle apparecchiatura HPLC di ogni laboratorio (pompe, colonne, tubi, ecc.), e controlli appropriati devono essere eseguiti prima della purificazione. Tuttavia, per presentare un esempio, se una pendenza di 5: 95 MeCN/H2O (entrambi con 0,1% TFA) a 70: 30 MeCN/H2O (entrambi con 0,1% TFA) vengono utilizzati oltre 30 min, una colonna di18 semi-preparatorio 19 x 250 mm C e una portata di 6 mL/min , Baccelli, p-SCN-Bn-DOTA e cialde-DOTA avranno tempi di ritenzione di circa 14,4 e 18,8 19,6 min, rispettivamente. Tutti e tre i composti possono essere monitorati a 254 nm.</li>
</ol>6. il bioconjugation di baccelli-DOTA al trastuzumab
Nota: Per questo passaggio, abbiamo iniziato con una soluzione di riserva di 16,4 mg/mL di trastuzumab.
<ol><li>In un tubo del microcentrifuge di proteina bassa associazione 1,5 mL, diluire 61 μL della soluzione madre trastuzumab (1 mg; 6.67 nmol, 1 equivalente) con 859 μL di soluzione salina tampone fosfato (pH 7,4).</li>
	<li>A questa miscela, aggiungere 6,7 μL di soluzione preparata 10mm di TCEP in H2O (66,7 nmol, 10 equivalenti).</li>
	<li>Preparare una soluzione di 1 mg/mL di baccelli-DOTA in DMSO e aggiungere 73 μL di questa soluzione di baccelli-DOTA la miscela di reazione (66.67 nmol, 10 equivalenti).</li>
	<li>Il tubo del microcentrifuge ed incubare la soluzione per 2 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo 2 ore, purificare il immunoconjugate utilizzando una colonna di dissalazione esclusione dimensioni monouso pre-confezionati.<ol>
<li>In primo luogo, equilibrare la colonna di esclusione di dimensione come descritto dal fornitore per rimuovere eventuali conservanti presenti nella colonna durante la conservazione. Una tipica procedura coinvolge la colonna 5 volte con un volume di PBS che corrisponde al volume della colonna di lavaggio: 5 x 2,5 mL di PBS.</li>
		<li>Successivamente, aggiungere la miscela di reazione nella colonna di esclusione di dimensione notando il volume della miscela di reazione.</li>
		<li>Dopo la miscela di reazione è entrato la colonna, aggiungere una quantità appropriata di PBS per portare il volume totale della soluzione aggiunto alla colonna fino a 2,5 mL. Ad esempio, se la reazione di coniugazione è provocato da un volume totale di 1,3 mL, 1,2 mL di PBS ulteriori avrebbe bisogno di essere aggiunto alla colonna.</li>
		<li>Infine, raccogliere il prodotto utilizzando 2 mL di PBS come eluente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Concentrare il immunoconjugate finale con unità di filtrazione centrifuga con un limite di peso molecolare 50 kDa.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo rapporto, abbiamo scelto di non includere eventuali protocolli per la sperimentazione radiolabeling o in vivo. Le ragioni sono semplici. Per quanto riguarda i primi, la radiomarcatura di un immunoconjugate basato su cialde non differisce affatto da quella di un immunoconjugate sintetizzati utilizzando altre strategie bioconjugation, e queste procedure sono state completamente recensione altrove2 . Per quanto riguarda quest'ultimo, le specifiche di preclinici esperimenti in vivo (cioè, mo...

Radiofarmaci chimici lungo hanno sfruttato la selettività e specificità degli anticorpi per biomarcatori della malattia per entrambi imaging nucleare e mirata radioterapia1. Gran lunga il più comune approccio per la radiomarcatura di anticorpi si basa sull'attacco indiscriminato di radiomarcato gruppi prostetici o radiometal chelatori agli aminoacidi — più spesso lisine — all'interno della struttura dell'immunoglobulina ( Figura 1A)2. Mentre questa strategia è certamente efficace, la sua natura casuale, non sito specifico può creare problemi. In particolare, gli approcci tradizionali bioconjugation producono mal definito ed efattori eterogenei costituiti da miscele di migliaia di regioisomeri differenti, ognuna con un proprio set di proprietà biologiche e farmacologiche3. Inoltre, bioconjugation casuale può ostacolare il immunoreactivity di anticorpi, se il carico viene aggiunto ai domini di antigene-legante di immunoglobulina.
Nel corso degli anni, una varietà di strategie bioconjugation site-specific e sito-selettivi sono stati sviluppati al fine di affrontare questi problemi4,5. Il più comune di questi approcci si basa sulla legatura delle sonde maleimide-cuscinetto ai gruppi solfidrilici di cisteine (Figura 1B). Gli anticorpi IgG1 contengono naturalmente 4 ponti disolfuro di inter-catena, legami che possono essere ridotti in modo selettivo per produrre i tioli gratuiti in grado di subire reazioni di addizione di Michael con le maleimidi per formare legami tioetere succinimidyl. L'uso dei tioli e le maleimidi è certamente un miglioramento rispetto ai metodi tradizionali e un'ampia varietà di maleimide-cuscinetto Sintoni e chelanti bifunzionali attualmente disponibili. Tuttavia, è importante notare che questa metodologia ha seri limiti pure. Basato su maleimide efattori presentano limitata stabilità in vivo, poiché il sollevatore thioether possa subire una reazione di retrò-Michael (Figura 2)6,7,8,9, 10. questo, naturalmente, può portare al rilascio di payload radioattivo o relativo scambio con biomolecole di tiolo-cuscinetto in circolazione (ad es., glutatione o albumina). Entrambi questi processi possono aumentare le concentrazioni di attività in organi sani, nonché diminuire le concentrazioni di attività nei tessuti bersaglio, con conseguente ridotta formazione immagine contrasto e rapporti terapeutici più bassi. Sono stati sviluppati diversi reagenti alternativi tiolo-reattive nel tentativo di eludere questi problemi, tra cui tosylates, bromo - e iodo-acetili e vinile solfoni11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. Tuttavia, tutti questi approcci presentano limitazioni che hanno ostacolato la loro applicazione diffusa.
Circa cinque anni fa, il laboratorio di Carlos Barbas III allo Scripps Research Institute ha sperimentato l'uso dei solfoni metil phenyloxadiazolyl come reagenti per la formazione selettiva di legami altamente stabile con tioli (Figura 1 e figura 3) 18 , 19. gli autori hanno impiegato una variante del solfone-cuscinetto di metile phenyloxadiazolyl di fluorescina per modificare parecchi anticorpi ingegnerizzati per contenere residui di cisteina libera, producendo infine efattori con più alta stabilità che analoga costrutti creati utilizzando sonde maleimide-basato. Vedendo questo lavoro promettente, siamo rimasti un po' sorpresi che questa tecnologia era stata utilizzata solo a malapena in radiochimica e non era stato ancora utilizzata affatto nella sintesi di chelanti bifunzionali o radioimmunoconjugates20,21 . Questa scarsità di applicazioni, tuttavia, ben presto cominciò ad avere più senso: parecchi tentativi di procurarsi il reagente da Sigma-Aldrich ha provocato la ricevuta di miscele complesse di prodotti di degradazione con < 15% del composto desiderato. Inoltre, sintetizzando il reagente segnalato noi stessi non era un'opzione realistica, come il percorso sintetico pubblicato è alquanto complesso e richiede attrezzature sofisticate chimica organica che la maggior parte radiochimica e imaging molecolare laboratori — compreso il nostro — semplicemente non possiedono.
In risposta a questi ostacoli, abbiamo deciso di creare un facilmente accessibile e altamente stabile reagente del solfone di metile phenyloxadiazolyl che può essere ottenuto tramite un percorso sintetico robusto e ragionevolmente facile. All'inizio di quest'anno, abbiamo segnalato la creazione di un modulare, stalla e facilmente raggiungibile phenyloxadiazolyl metil solfone reagente — soprannominato 'Baccelli' — come una piattaforma per bioconiugazione tiolo-base (Figura 1 e figura 3)22. La differenza fondamentale tra le cialde e il reagente segnalato da Barbas, et al è che il primo impiega un anello di anilina attaccato nella frazione di phenyloxadiazolyl metil solfone, mentre quest'ultimo dispone di un fenolo nella stessa posizione (Figura 4). Questo cambiamento facilita un percorso sintetico più semplice e accessibile come pure — se la nostra esperienza con il composto commercialmente disponibile è emblematico — un reagente finale più stabile. In questo lavoro, abbiamo sintetizzato anche un paio di chelanti bifunzionali baccelli-cuscinetto — cialde-DFO e cialde-CHX-A cm-DTPA — per facilitare la creazione di 89Zr - e 177radioimmunoconjugates Lu-etichettati, rispettivamente. Come vedremo, abbiamo dimostrato che bioconiugazione sito-selettivo basato su cialde riproducibile e robustamente creare radioimmunoconjugates omogeneo, ben definito, altamente immunoreactive e altamente stabile. Inoltre, esperimenti preclinici in modelli murini di cancro colorettale hanno dimostrato che questi sito-selettivamente etichettato radioimmunoconjugates espositivo superior in vivo delle prestazioni rispetto agli anticorpi radiomarcati sintetizzati tramite maleimide-basato coniugazioni.
L'obiettivo generale di questo lavoro è quello di facilitare la creazione di ben definito, omogeneo, altamente stabile e altamente immunoreactive efattori per applicazioni in vitro e in vivo. L'approccio sintetico è abbastanza semplice da essere eseguito in quasi tutti i laboratori e il reagente di baccelli del genitore può essere modificato con una pletora di diversi chelatori, fluorofori o carichi. In questo protocollo e il video di accompagnamento, descriveremo la sintesi semplice, quattro fasi di baccelli (Figura 5); la creazione di una variante di baccelli-cuscinetto di DOTA, un chelatore ampiamente usato per il coordinamento di 64Cu, 68Ga, 111a, 177Lu e 225Ac (Figura 6); e il bioconjugation di baccelli-DOTA di un anticorpo di modello, il IgG1 come destinazione HER2 trastuzumab (Figura 7).

<table><tbody><tr><td>5-(4-amminofenil)-1,3,4-ossadiazolo-2-tiolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675024</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Provetta microcentrifuga LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>925000090</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Provetta microcentrifuga</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-2 Unità filtrante centrifuga</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td>EN300000141G</tr><tr><td>Cicloesano</td><td>Fisher Scientific</td><td>C556-4</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC383780010</td><td></td></tr><tr><td>Diisopropiletilamina</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>150915</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido</td><td>Fisher Scientific</td><td>31-727-5100ML</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di etile</td><td>Fisher Scientific</td><td>E145 4</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Iodometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566-100G</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Acros Organics</td><td>413485000</td><td></td></tr><tr><td>acido m-cloroperbenzoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>273031</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412 1</td><td></td></tr><tr><td>NBoc-N&prime;- succinil-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>671401</td><td>Negozio a -80 C</td></tr><tr><td>N-etil-N&prime;- [3- (dimetilammino)propil] carbodiimmide cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493 10</td><td>&volte; Concentrazione</td></tr><tr><td>p-SCN-Bn-DOTA</td><td>Macrociclici</td><td>B-205</td><td>Conservare a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Sephadex G-25 in colonne di desalinizzazione PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>20490</td><td></td></tr><tr><td>Trietilammina</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC157911000</td><td></td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A116-50</td><td></td></tr></tbody></table>

sintesi e bioconjugation di tiolo-reattive reagenti per la creazione del sito-selettivamente per volta efattori

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Sonde bifunzionale maleimide-cuscinetto sono state impiegate per decenni per la modifica sito-selettiva di tioli in biomolecole, soprattutto gli anticorpi. Ancora basato su maleimide coniugati visualizzazione limitata stabilità in vivo perché il sollevatore thioether succinimidyl possa subire una reazione di retrò-Michael. Questo, naturalmente, può portare al rilascio di payload radioattivo o relativo scambio con biomolecole di tiolo-cuscinetto in circolazione. Entrambi questi processi può produrre concentrazioni di attività elevati in organi sani come pure in diminuzione di concentrazioni di attività nei tessuti bersaglio, con conseguente ridotta formazione immagine contrasto e rapporti terapeutici più bassi. Nel 2018, abbiamo segnalato la creazione di un modulare, stalla e facilmente raggiungibile phenyloxadiazolyl metil solfone reagente — soprannominato 'Baccelli' — come una piattaforma per bioconiugazione tiolo-basato. Abbiamo chiaramente dimostrato che bioconiugazione sito-selettivo basato su cialde riproducibile e robustamente creare radioimmunoconjugates omogeneo, ben definito, altamente immunoreactive e altamente stabile. Inoltre, esperimenti preclinici in modelli murini di cancro colorettale hanno dimostrato che questi sito-selettivamente etichettato radioimmunoconjugates espositivo molto superiore in vivo delle prestazioni rispetto agli anticorpi radiomarcati sintetizzati tramite maleimide-basato coniugazioni. In questo protocollo, descriveremo la sintesi di quattro fasi di baccelli, la creazione di una variante di baccelli-cuscinetto bifunzionale dell'onnipresente chelante DOTA (cialde-DOTA) e la coniugazione di baccelli-DOTA per il targeting per HER2 anticorpo trastuzumab.

I primi quattro passaggi del presente protocollo — la sintesi dei baccelli — sono stati progettati per essere robusti ed affidabili. La deprotonazione e sostituzione di 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol per formare il prodotto desiderato thioether permette il thioether in &gt; 99% di rendimento dopo appena 45 minuti. Successivamente, la legatura tra 1 e N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine è stata realizzata via un peptide standard procedura di a...

In questo protocollo, descriveremo la sintesi di cialde, un reagente basati su solfone metil phenyoxadiazolyl per il fissaggio dei carichi sito selettivo i tioli di biomolecole, in particolare gli anticorpi. Inoltre, descriveremo la sintesi e la caratterizzazione di un chelante bifunzionale baccelli-cuscinetto e la sua coniugazione di un anticorpo di modello.

Sintesi e Bioconjugation di tiolo-reattive reagenti per la creazione del sito-selettivamente per volta efattori

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Questo protocollo descrive la sintesi e l'applicazione di PODS, un nuovo reagente per la bioconiogazione site-specific di proteine e peptidi. Questa tecnologia rappresenta un netto miglioramento rispetto alle tradizionali biocongiugazioni a base di maleimide-tiolo. Il più grande vantaggio di questa procedura è la semplicità con cui viene realizzato il reagente.Il metodo consente di sintetizzare il reagente praticamente in qualsiasi laboratorio. In un pallone a fondo rotondo da 10 millilitri, sciogliere 100 milligrammi dell'amminofenil oxadiazolo tiolo in tre millilitri di metanolo. Alla soluzione aggiungere 360 microlitri di diisopropiletilammina e una barra di agitazione magnetica.Sigillare il pallone con un tappo di gomma e mescolare la soluzione per 10 minuti a temperatura ambiente. Utilizzando una siringa di vetro da un millilitro, fare un buco attraverso il tappo di gomma e aggiungere rapidamente 32 microlitri di iodometano alla miscela. Lasciare reagire la miscela per 45 minuti a temperatura ambiente.In un pallone a fondo tondo da 25 millilitri, sciogliere 387 milligrammi dell'acido carbossilico protetto dal boc in 10 millilitri di diclorometano. Alla soluzione aggiungere 480 microlitri di diisopropiletilammina, 264 milligrammi di EDCI, 200 milligrammi di anilina e una barra di agitazione magnetica. Sigillare il pallone con un tappo di vetro e lasciare mescolare la reazione per cinque giorni a temperatura ambiente.Una volta completata la reazione, trasferire la miscela di reazione in un imbuto separatore e lavare tre volte con cinque millilitri di acido cloridrico un molare. Raccogliere la fase organica e trasferirla nell'imbuto separatore. Quindi lavare la fase organica con carbonato di sodio un molare seguito da acqua.Successivamente, raccogliere la fase organica e aggiungere solfato di magnesio per rimuovere eventuali tracce di acqua. Quindi filtrare la miscela utilizzando una fritta di vetro media. Utilizzando un evaporatore rotante, rimuovere i solventi volatili a pressione ridotta per permettersi un solido bianco troppo bianco.In seguito, riassolvere il solido isolato in 10 millilitri di acetato di etile. Quindi precipitare il prodotto attraverso l'aggiunta graduale di 30 millilitri di cicloesano. Filtrare la soluzione utilizzando una fritta di vetro media per ottenere il prodotto carbammato come polvere bianca.In un pallone a fondo tondo da 10 millilitri, sciogliere 30 milligrammi del carbammato in quattro millilitri di diclorometano. Aggiungere lentamente 49 milligrammi di acido cloroperbenzoico al 70%m e una barra di agitazione magnetica alla miscela e sigillare il pallone con un tappo di vetro. Mescolare la soluzione durante la notte a temperatura ambiente, producendo infine una miscela gialla.Il giorno seguente, trasferire la miscela in un imbuto separatore. Quindi lavare la miscela con idrossido di sodio 0,1 molare seguito da acqua. Raccogliere la fase organica e aggiungere solfato di magnesio per rimuovere eventuali tracce di acqua.Quindi filtrare la miscela utilizzando una fritta di vetro media. In un pallone a fondo tondo da 25 millilitri, sciogliere 30 milligrammi del carbammato in due millilitri di diclorometano. Aggiungere una barra di agitazione magnetica alla miscela.E 400 microlitri di acido trifluoroacetico e sigillare il pallone con un tappo di vetro. Quindi mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per tre ore. Una volta completata la reazione, rimuovere i volatili a pressione ridotta a temperatura ambiente utilizzando un evaporatore rotante per ottenere un residuo oleoso.Sciogliere il residuo oleoso in sette millilitri di acqua. E trasferimento in un imbuto separatorio. Lavare la soluzione acquosa tre volte con quattro millilitri di acetato di etile.In un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri sciogliere 10 milligrammi di PODS e 300 microlitri di solfossido di dimetile. Quindi aggiungere 26 microlitri di N, N-diisopropiletilammina alla soluzione. Sciogliere 15,2 milligrammi di DOTA NCS in 100 microlitri di solfossido di dimetile e combinare la soluzione con la soluzione PODS.Sigillare il tubo di microcentrifugo e consentire alla reazione di incubare durante la notte a temperatura ambiente. Successivamente, diluire 61 microlitri di una soluzione di stock di trastuzumab con 859 microlitri di PBS in un tubo di microcentrifugo a basso legame proteico da 1,5 millilitri. A questa miscela, aggiungere 6,7 microlitri di una soluzione da 10 millimolare appena fatta di TCEP in acqua.Aggiungere 73 microlitri di una soluzione PODS-DOTA da un milligrammo per millilitro alla miscela di reazione. Infine, sigillare il tubo di microcentrifugo e incubare la soluzione per due ore a temperatura ambiente. La sintesi PODS è robusta e affidabile.La deproteinazione e la sostituzione dell'amminofenil oxadiazolo tiolo ne offriva una in resa quantitativa. La legatura del tioetere uno e dell'acido carbossilico protetto dal boc ha prodotto il composto due nella resa del 55%. L'ossidazione ha offerto al composto tre con una resa del 90%.E la rimozione del gruppo che protegge i bocs ha prodotto PODS con una resa del 98%. L'identità di ogni prodotto è stata confermata tramite NMR protone, NMR in carbonio e SM ad alta risoluzione. Una variante portante di isotiocianato del chelatore DOTA è stata accoppiata all'ammina pendente di PODS per ottenere il chelatore bifunzionale con una resa del 75%. L'identità del prodotto è stata confermata tramite NMR protone, NMR al carbonio e SM ad alta risoluzione. Qui viene mostrata la bioconiogazione selettiva del sito di PODS-DOTA al trastuzumab anticorpale con targeting HER2.I collegamenti disolfuro della regione della cerniera dell'anticorpo sono stati selettivamente ridotti e l'anticorpo è stato quindi incubato con PODS-DOTA per permettersi all'immunoconiuvato dota una resa dell'80%. L'analisi MALDI-TOF ha rivelato un grado di etichettatura di 1,8 DOTA per anticorpo. Che rimane coerente in una serie di anticorpi IgG1 umani, umanizzati e chimerici.Tuttavia, le stesse condizioni producono immunoconiuvati con un grado di etichettatura di 1,5 per gli anticorpi murini IgG1. A causa della sensibilità alla luce di questo composto, è importante mantenere tutte le reazioni nei vasi ricoperti di fogli. Ciò aumenterà la resa complessiva del prodotto.Mentre questo protocollo descrive la sintesi di PODS-DOTA, una procedura simile può essere applicata a una vasta gamma di carichi potenziali, tra cui fluorofori, tossine e altri chelatori. Questo metodo faciliterà la costruzione di immunoconiuvati ben definiti, omogenei e altamente stabili che possono essere utilizzati in un'ampia varietà di campi. È importante ricordare che l'iodometano aggiunto nella prima fase di questo esperimento può avere effetti dannosi e dovrebbe quindi essere usato in una cappa aspirante.

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