Name: Sideroforo high-throughput Screening da campioni ambientali: tessuti, Bulk terreni e suoli rizosfera della pianta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Impara un metodo di screening ad alto rendimento per valutare l'attività dei siderofori in campioni di suolo e tessuti vegetali. Questa tecnica consente il rilevamento all'interno di comunità microbiche intatte per studi di microbiologia ambientale.

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Gli autori desiderano ringraziare Kalyani Muhunthan per assistenza in procedure di laboratorio, Lee Opdahl per la raccolta del grano genotipo, Consiglio di ricerca d'uva dello stato di Washington e la Washington State University Center per sostenere l'agricoltura e Risorse naturali per un BIOAg concedere per sostenere questo lavoro. Finanziamenti supplementari è stato fornito dall'USDA/catino attraverso progetto portello 1014527.

Nota: Percorso del campo sito: Washington State University, Farm di patologia vegetale (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 04' 57,4" W). Semi sono stati seminati usando una piantatrice meccanica su 19 ottobre 2017. Ogni genotipo di grano è stato piantato in headrows, circa 1 metro di distanza per evitare sovrapposizioni di sistema della radice. Il 9 agosto 2018, quando le piante erano pronti per il raccolto, sono stati raccolti campioni di pianta e terreno. I campioni sono stati raccolti da tre repliche di quattro genotipi di frumento: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain.
1. preparazione di modificate M9 medium
<ol><li>Uso Na2PO4∙7H2O (12,8 g/200 mL), KH2PO4 (0,3 g/200 mL), NaCl (0,5 g/200 mL) e NH4Cl (1 g/20 mL) reagenti per preparare la soluzione salina M9.</li>
	<li>Utilizzare 18 g di MgSO4∙7H2O in 100 mL di acqua deionizzata doppia (ddH2O) per preparare 0,75 M MgSO4∙7H2O.</li>
	<li>Fai 1 M di CaCl2∙2H2O aggiungendo 14,7 g di CaCl2∙2H2O con 100 mL di ddH2O.</li>
	<li>Preparare la soluzione tampone sciogliendo g 6,048 dei tubi in 156 mL di ddH2O con agitazione. Regolare il pH a 6,8 con 5 M NaOH.</li>
	<li>Preparare il 20% del glucosio (destrosio monoidrato) sciogliendo 20 g di glucosio in 100 mL di ddH2O.</li>
	<li>Preparare soluzioni e autoclave tutti singolarmente ma il glucosio. Filtro sterilizzare la soluzione di glucosio per aggiunta ai media M9 dopo sterilizzazione in autoclave (0,22 µm).</li>
	<li>Preparare il supporto di M9 modificato mescolando 156 mL di soluzione tampone di tubi, 40 mL di soluzione di sali M9, 20 μL di soluzione di CaCl2·2H2O e 266 μL di MgSO4·7H2O 4 mL di soluzioni di glucosio 20% insieme alla biosicurezza gabinetto, usando una tecnica sterile.</li>
	<li>Per la conservazione della M9 modificate, sigillare il contenitore, coprire con carta stagnola per proteggere dai raggi UV e posto a 4 ° C.</li>
</ol>2. preparazione del terreno CAS-Fe-Agar
<ol><li>Acido lavare tutta la cristalleria in 100 mM HCl/100 mM HNO3 per un minimo di 2 h prima dell'utilizzo nell'analisi della CAS.</li>
	<li>Preparare una teglia di alluminio riempita con sabbia di grado di laboratorio e coprire con carta stagnola. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 30 min e mettere da parte.</li>
	<li>Preparare la HDTMA (bromuro di esadeciltrimetilammonio) aggiungendo 0,0365 g 20 mL ddH2O e posizionare la soluzione a 37 ° C per favorire la solubilizzazione.</li>
	<li>Preparare HCl 10 mM e 1 mM FeCl3·6H2O usando HCl 10 mM come solvente di generare. Aggiungere 0,0302 g di CAS a 25 mL di ddH2O mescolando delicatamente con una sterile ancoretta magnetica. Quindi aggiungere 5 mL di 1 mM FeCl3·6H2O (in HCl 10 mM) a 25 mL di soluzione di CAS pur continuando a mescolare delicatamente (la soluzione si trasforma in colore nero rossastro scuro).</li>
	<li>Aggiungere lentamente i 20 mL di soluzione di HDTMA, mescolando delicatamente, nella soluzione di Fe-CAS (questo produce una soluzione blu scuro).</li>
	<li>Preparare la soluzione tampone sciogliendo g 15,12 di tubi in 375 mL di ddH2O, con agitazione delicata. Regolare il pH a 6,8 con 5 M NaOH. Aggiungere acqua per portare il volume a 450 mL. Aggiungere 5 g di agarosio per la soluzione. Autoclave i tubi del buffer soluzione e la soluzione di CAS-Fe a 121 ° C per 30 min.</li>
	<li>Aggiungere con cautela la totalità della soluzione CAS-Fe per la totalità del Buffer tubi nella biosicurezza dopo ciascuno di essi è sterilizzato nell'autoclave.</li>
	<li>Posto la soluzione mista in un bagno di acqua a 50 ° C. Nota: Appena preparare tutti i reagenti nel CAS-Fe-agar prima di ogni analisi, come deposito a lungo termine a 50 ° C risultati in precipitazione dei risultati complessi e raffreddamento CAS-Fe in mezzo solidificata.</li>
	<li>Posizionare una barca di reagente sterile nella sabbia sterile nella cappa di biosicurezza e calore a 50 ° C. Trasferire il CAS-Fe-Agar per la barca, quindi rapidamente aliquota 100 µ l a ciascun pozzetto in una micropiastra a 96 pozzetti chiara, fondo piatto e sterile.</li>
</ol>3. preparazione standard pioverdina/EDTA
<ol><li>Preparazione di pioverdina<ol>
<li>Preparare standard di 800 μM pioverdina (miscela di acido succinico, 2-idrossi glutaramide e succinaminde forme di pioverdina – Vedi Tabella materiali), nel mezzo di M9 modificata precedentemente preparato.</li>
		<li>Diluire questa soluzione in 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 e 6,25 μM soluzioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di standard di EDTA<ol>
<li>Aggiungere 0,594 g di acido etilendiamminotetracetico disodico (EDTA: C10H14N2Na2O8.2h2O), a 500 mL di mezzo di M9 modificata precedentemente preparato per predisporre 3200 μM EDTA standard.</li>
		<li>Diluire questa soluzione nel 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 e 6,25 soluzioni μM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Generazione della curva standard<ol>
<li>Aggiungere 100 μL di ogni concentrazione di pioverdina ed EDTA per separare dei pozzetti di una micropiastra a 96 pozzetti contenenti 100 μL di coltura agar CAS-Fe. Rendere le repliche tecniche duplicate di ogni concentrazione. Inoltre, aggiungere pozzetti del bianco con solo M9 (senza EDTA o pioverdina).</li>
		<li>Utilizzando un lettore di micropiastre, misurare l'assorbanza (a 420 nm e 665 nm) dopo 1, 6 e 24 h di incubazione a 22 ° C e misure di assorbanza di uso per generare le curve standard. Nota: Per misure di 420 nm, sottrarre assorbanza di spezzoni di dall'assorbanza di pioverdina o pozzetti contenenti EDTA. Per 665 nm, sottrarre l'assorbanza della pioverdina o EDTA contenente pozzi da capacità di assorbimento degli spazii in bianco. Quindi, log10(µM pioverdina o EDTA) è regredito contro le misure di assorbanza. Per facilità di interpretazione dei risultati del campione, è necessario utilizzare assorbanza come l'asse x e log10(µM pioverdina o EDTA) come l'asse y.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. raccolta di campioni ambientali: tessuti del suolo e pianta
<ol><li>Lavare attrezzature di campionamento (pale e forbici) con 0,22 µm filtrata ddH2O seguita da etanolo al 70% e asciugare con carta assorbente prima del campionamento e tra campioni di mantenere una tecnica sterile e ridurre la contaminazione incrociata.</li>
	<li>Asportare i tessuti vegetali (cereali e germogli) dalle piante nel campo e metterli in un sacchetto di stoccaggio di plastica con etichetta, lasciando abbastanza stoppie di sparare per facilità a sradicare i campioni di suolo e radice desiderati.</li>
	<li>Scavare una profonda radice piccola palla circa 15 cm e 23 cm di larghezza e metterla in un sacchetto di plastica separato, con etichettato per la preparazione del campione nell'ambiente di laboratorio. Questo passaggio è simile ai metodi di McPherson et al.27.</li>
	<li>Mettere tutti i campioni (grani, germogli, terreno di massa e sfere di radice in sacchetti separati) direttamente sul ghiaccio e conservare a 4 ° C fino a quando i campioni vengono elaborati per il dosaggio di produzione sideroforo.</li>
	<li>Separare campioni di suolo radice associato in massa, debolmente accoppiate rizosfera suolo e suolo rizosferico strettamente associato.<ol>
<li>Prendere le palle di radice fuori i sacchetti. Agitare delicatamente fuori suolo dalla sfera di radice. Scrollato di dosso del suolo, insieme con il terreno rimasto nella borsa comprende il terreno "alla rinfusa".</li>
		<li>Utilizzare un martello di gomma per rimuovere lo sporco più ulteriormente dalla sfera di radice. Questo è il terreno debolmente accoppiate rizosfera.</li>
		<li>Generare suolo rizosferico strettamente associato prendendo le radici con il campione di strettamente associato e metterli in una provetta da centrifuga. Aggiungere 30 mL di ddH2O e vortex per 2-3 minuti. Rimuovere le radici per ottenere la diluizione di liquami suolo rizosferico strettamente associato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. preparazione di colture di arricchimento sideroforo e CAS-Fe sideroforo produzione dosaggio
Nota: Tutta la cristalleria dovrebbe essere acido lavato prima di iniziare l'analisi.
<ol><li>Preparazione del campione di terreno (per ognuno dei tipi di campione di tre suolo)<ol>
<li>Omogeneizzare ogni campione di terreno all'interno del sacchetto campione, mescolando e girando il terreno il più possibile senza aprire il sacchetto. Nota: Questo aiuta a ridurre la variabilità spaziale del suolo naturale e si allinea con le procedure di campionamento di suolo normale. Altri metodi possono essere utilizzati per omogeneizzare campioni ambientali, come appropriato e a seconda del design sperimentale.</li>
		<li>Dopo ogni campione è stato accuratamente miscelati, aliquotare e sospendere 2,0 g di ogni terreno in 20 mL di terreno di M9 modificata, quindi diluire 10-3 per un volume totale di 20 mL in una provetta da centrifuga sterile 50 mL con un tappo di gomma piuma sterile per permettere l'aerazione.</li>
		<li>Per i campioni strettamente associato rizosfera, aggiungere 2 mL di liquame suolo rizosferico a 20 mL di medium M9 modificate, quindi diluire 10-3 per un volume totale di 20 mL in una provetta da centrifuga sterile 50 mL con un tappo di gomma piuma sterile per permettere l'aerazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione del campione (radice, spara e grano) del tessuto<ol>
<li>Superficie sterilizzare il campione con etanolo al 70%. Macerare 2,0 g di tessuto fresco in 20 mL di mezzo di M9 modificata utilizzando un frullatore in alto per 30 secondi. Trasferire il campione in una provetta sterile 50 mL, quindi diluire 10-3 per un volume totale di 20 mL in una provetta da centrifuga sterile 50 mL con un tappo di gomma piuma sterile per permettere l'aerazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arricchimento della produzione sideroforo attraverso Fe limitazione<ol>
<li>Incubare le provette centrifuga da 50 mL a temperatura ambiente e agitare a 160 giri/min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. saggi di agar CAS-Fe per il rilevamento della produzione sideroforo in campioni ambientali
<ol><li>A 24, 48 e 72 h dopo l'inizio della cultura di arricchimento, rimuovere sottocampioni 1ml dai tubi arricchimento utilizzando una tecnica sterile e centrifugare a 10.000 x g per 1 min in provette da centrifuga 2 mL pelletizzare le cellule.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante separato. Utilizzando una tecnica sterile, aggiungere 100 μL del surnatante a 100 μL di soluzione di CAS-Fe-Agar in doppio o triplice copia la micropiastra. Inoltre è possibile aggiungere 100 µ l di mezzo sterile M9 (come gli spazii in bianco). Incubare la piastra a 28 ° C.</li>
	<li>Sospendere il surnatante e pellet per ogni campione (non aggiunto alla piastra per microtitolazione) rimanenti in proprio, provetta da centrifuga sterili da 2 mL. Aggiungere 400 μL di glicerolo sterile in ogni provetta di campione-supernatante e risospendere il pellet per creare scorte di glicerolo. Congelare il brodo a-80 ° C per successive analisi. Nota: Questo passaggio può essere modificato per generare scorte di glicerolo secondo qualsiasi protocollo di in-house preferito.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza a 6, 24, 48 e 72 ore, a 420 Nm.</li>
	<li>Utilizzare curve standard generate da pioverdina o EDTA per interpretare misure di assorbanza del campione in termini di pioverdina equivalenti. Nota: Pioverdina è stato determinato per essere uno standard superiore confrontato con EDTA (vide infra), quindi EDTA non è stata utilizzata per interpretare i risultati nello studio corrente.</li>
</ol>

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<li>Mirleau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+in+soil+and+rhizosphere+of+Pseudomonas+fluorescens+C7R12+compared+with+a+C7R12+mutant+affected+in+pyoverdine+synthesis+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake.</a> FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).</li>
<li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+siderophores%3A+from+biogenesis+to+biosignificance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li>
<li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Blue+Agar+CAS+Assay+for+Siderophore+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection.</a> Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Il principale risultato di questo lavoro è la produzione di una nuova metodologia che può essere utilizzata per arricchire rapidamente per sideroforo producendo microbi durante la misurazione quantitativamente sideroforo/attività di produzione del campione ambientale. La metodologia è rapido, semplice e conveniente, e i risultati mostrano come può essere utilizzato per rilevare l'attività di sideroforo da tipi di campioni complessi e romanzo (ad es.., del suolo e pianta del tessuto). Il protocollo inoltre provoc...

Siderofori sono importanti biomolecole coinvolte principalmente nella chelazione del ferro per biodisponibilità, ma con una vasta gamma di ulteriori finalità negli ecosistemi terrestri e acquatici che vanno da microbica quorum sensing, segnalazione di microbiche pianta-padroni di casa, Promozione della crescita di pianta, la cooperazione e la concorrenza all'interno di comunità microbiche complesse1,2. Siderofori possono essere classificati secondo la loro siti attivi e caratteristiche strutturali, creazione di quattro tipi di base: carbossilato, idrossammica, catecolati e mescolato tipi3,4. Molti microrganismi sono in grado di espellere più di un tipo di sideroforo5 e in comunità complesse, una vasta maggioranza di organismi biosintetizzare i recettori di membrana per consentire l'assorbimento di una varietà ancora più ampia di siderofori1, 6. Lavoro recente indica che i siderofori sono particolarmente importanti a livello comunitario e anche nelle comunicazioni inter-Unite e biogeochimici trasferimenti7,8,9,10 ,11.
Chrome azurol solfonato (CAS) è stato utilizzato per oltre 30 anni come un agente chelante di legare il ferro (Fe) in modo che aggiunta di ligandi (cioè, siderofori) può provocare la dissociazione del complesso CAS-Fe, creando un cambiamento di colore facilmente identificabile nel medio 12. quando il CAS è associato con Fe, il colorante viene visualizzato come un colore blu royal e come il complesso di CAS-Fe si dissocia, il mezzo cambia colore a seconda del tipo di legante utilizzato per pulire il Fe13. Il mezzo iniziale, base liquida costituito da Schwyn e Neilands nel 1987, è stato modificato in molti modi per ospitare cambiando obiettivi microbica14, abitudini di crescita e limitazioni15, nonché una varietà di metalli oltre a Fe, tra cui alluminio, manganese, cobalto, nichel cadmio, litio, zinco16, rame17e anche arsenico18.
Molti agenti patogeni umani, anche come impianto di microrganismi promuovere crescita (International) sono stati identificati come organismi produttori sideroforo3,19,20e importante rizosfera ed endophytic International spesso prova positivo per sideroforo-produzione4. Il tradizionale metodo di liquido basato su Fe è stato adattato per microtitolazione test degli isolati in coltura per sideroforo produzione21. Tuttavia, queste tecniche non riescono a riconoscere l'importanza della comunità microbica nel suo complesso (il microbioma), in collaborazione ed eventuale regolazione della produzione sideroforo nel suolo e pianta sistemi22. Per questo motivo, abbiamo sviluppato una valutazione di livello comunitario di alto-rendimento di produzione sideroforo da un determinato ambiente, basato sull'analisi CAS tradizionale, ma con replica, facilità di misurazione, affidabilità e ripetibilità in una micropiastra test.
In questo studio, un'analisi di CAS-Fe conveniente, ad alta produttività per la rilevazione di produzione sideroforo è presentata per valutare l'arricchimento della produzione sideroforo da campioni complessi (cioè, del suolo e pianta omogenati). Alla rinfusa, debolmente accoppiate e strettamente associato rizosfera suolo (in termini di come il suolo era legato alla radice) sono stati ottenuti con grano, sparare e tessuti di radice da quattro genotipi distinti frumento (Triticum aestivum L.): Lewjain, Madsen, PI561725, e PI561727. È stato supposto che differenze fondamentali in genotipi di frumento potrebbero comportare differenze nel reclutamento e nella selezione di sideroforo producendo le comunità. Di particolare interesse è la differenza tra comunità microbiche associata alla linea isogeniche di PI561725, che è in alluminio tollerante perché possiede ALMT1 (alluminio-attivato Malate Transporter 1), confrontata con l'alluminio PI561727 isogeniche linea sensitive, che possiede una forma reattiva non-alluminio del gene, almt123,24,25,26. L'obiettivo principale dello studio era di sviluppare un metodo semplice, rapido, di valutare quantitativamente la produzione sideroforo in colture di arricchimento sideroforo di tipi di campioni complessi, preservando le colture per il lavoro futuro.

Teglia in alluminio <table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Apex</td><td>LF451320014</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> foglio di <tr><td>alluminio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio, granulare</td><td>Fiesher Scientific</td><td>152315A</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave e sterilizzatore</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Fiesher</td><td>Scientific 171428</td><td></td></tr><tr><td>CAS (Chrome Azurol S)</td><td>Chem-Impex Int'l Inc)</td><td>000331-27168</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio monoidrato (glucosio), polvere cristallina</td><td>Fiesher Scientific</td><td>1521754</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, sale disodico, diidrato, cristallo</td><td>J.T.Baker</td><td>JI2476</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo, anidro</td><td>Baker analizzato</td><td>C22634</td><td></td></tr><tr><td>HDTMA (Cetyltrimethylammomonium </td><td>Reagente</td> Bromuro World <td>FZ0941</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrato</td><td>ACROS Organic</td><td>B0756767</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200 PRO Lettore di piastre</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ferro (III) esaidrato, 99%</td><td>ACROS Organic</td><td>A0342179</td><td></td></tr><tr>Cappa da laboratorio <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore da laboratorio</td><td>VWR Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Fiesher Scientific</td><td>27855</td><td></td></tr><tr><td>Acido Nirico, (69-70)%</td><td>J.T.Baker</td><td>72287</td><td></td></tr><tr><td>TUBI tampone, 98,5%</td><td>ACROS</td><td>Organico A0338723</td><td></td></tr><tr><td>Potassio fosfato, dibaisc, polvere</td><td>J.T.Baker</td><td>J48594</td><td></td></tr><tr><td>Pyoverdine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>078M4094V</td><td></td></tr><tr><td>Sabbia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SI-600R Shaker</td><td>Lab Companion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio, granulare</td><td>Fiesher Scientific 136539</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio, pellet</td><td>J.T.Baker</td><td>G48K53</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio, eptaidrato bibasico, 99%</td><td>ACROS A0371705</td><td></td><td></td> organico</tr></tbody></table>

sideroforo high-throughput screening da campioni ambientali: tessuti, bulk terreni e suoli rizosfera della pianta

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderofori (composti di chelatazione metallo di basso peso molecolare) sono importanti in varie fenomeno ecologico che vanno dal ferro (Fe) ciclismo biogeochimici in terreni, a concorrenza di agente patogeno, promozione della crescita di pianta e cross-Unito della segnalazione. Inoltre, siderofori sono anche di interesse commerciale di bioleaching e bioweathering del metallo-cuscinetto minerali e minerali. Un mezzo rapido, conveniente e affidabile di valutare quantitativamente la produzione sideroforo in campioni complessi è la chiave per identificare gli aspetti importanti delle ramificazioni ecologiche di sideroforo attività, tra cui, romanzo sideroforo producendo i microbi. Il metodo qui presentato è stato sviluppato per valutare l'attività di sideroforo delle Comunità in tatto microbiome, in campioni ambientali, quali i tessuti del suolo o delle piante. I campioni sono sono omogeneizzati e diluiti in un mezzo di M9 modificato (senza Fe) e colture di arricchimento sono state incubate per 3 giorni. Produzione di sideroforo è stata valutata nei campioni a 24, 48 e 72 ore (ore) utilizzando una micropiastra a 96 pozzetti CAS (Chrome azurol solfonato) romanzo-saggio agar Fe, un adattamento del metodo colorimetrico tradizionalmente noioso e richiede tempo di valutazione sideroforo attività svolta su singoli isolati microbici coltivati. Abbiamo applicato il nostro metodo a 4 diversi genotipi/linee di grano (Triticum aestivum L.), tra cui Lewjain, Madsen e PI561725 e PI561727 comunemente coltivata nel nord-ovest pacifico dell'entroterra. Sideroforo produzione chiaramente è stata influenzata dal genotipo del grano con i tipi specifici di tessuti vegetali osservati. Abbiamo utilizzato con successo il nostro metodo per selezionare rapidamente per l'influenza del genotipo di pianta il sideroforo produzione, una funzione chiave negli ecosistemi terrestri e acquatici. Abbiamo prodotto molti tecnici replicati, producendo le differenze statistiche molto affidabile nel suolo e all'interno di tessuti vegetali. D'importanza, i risultati mostrano che il metodo proposto può essere utilizzato per esaminare rapidamente sideroforo produzione in campioni complessi con un alto grado di affidabilità, in un modo che permette alle comunità di essere conservato per lavoro successivo identificare taxa e geni funzionali.

Un pioverdina miscela biosynthesized da Pseudomonas fluorescens è stato utilizzato come standard per interpretare e quantificare assorbanza (a 420 nm) di campioni in termini di equivalenti di pioverdina in µM. la figura 1 Mostra la relazione tra assorbanza (420 Nm) e a partire di concentrazione di pioverdina (molarità di10 Log in µM). EDTA non ha fornito uno standard adeguato, perché i campioni esposti misure di assorbanza maggiore che era...

Vi presentiamo un protocollo per lo screening rapido di campioni ambientali per sideroforo potenziale che contribuiscono alla biodisponibilità di micronutrienti e fatturato nei sistemi terrestri.

Sideroforo high-throughput Screening da campioni ambientali: tessuti, Bulk terreni e suoli rizosfera della pianta

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

I siderofori sono biomolecole a basso peso molecolare, chelano metalliche coinvolte nel ciclismo del ferro nell'ambiente. Questo protocollo consente una rapida valutazione ad alta produttività dell'attività dei siderofori nei campioni di suolo e piante. I precedenti metodi per il rilevamento dei siderofori hanno eliminato l'ambiente cruciale della comunità microbica.La nostra tecnica consente il rilevamento all'interno della comunità microbica relativamente intatta e dell'habitat in cui ha coinvolto. Poiché la disponibilità di ferro è fondamentale per la produttività dell'agricoltura, quindi in questo protocollo potrebbe essere utilizzato per indagare il ruolo dei microbi nel modulare la disponibilità di ferro per le piante. Inoltre, questo metodo potrebbe essere utilizzato per valutare l'impatto delle pratiche di gestione delle aziende agricole sulla salute del suolo e sulle comunità produttrici di siderofori, nonché lo sviluppo di tali comunità nel tempo.Per iniziare, lavare con l'acido tutte le vetrerie in acido nitrico 100 millimolare 100 millimolare per un minimo di due ore prima dell'utilizzo nel saggio CAS. Preparare una teglia in alluminio riempita con sabbia di laboratorio e coprirla con un foglio di alluminio. Autoclave a 121 gradi Celsius per 30 minuti e messa da parte.Preparare HDTMA aggiungendo 0365 grammi a 20 millilitri di acqua doppia deionizzata e mettere la soluzione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per promuovere la solubilizzazione. Aggiungere 0302 grammi di CAS a 25 millilitri di acqua doppia deionizzata mescolando delicatamente con una barra di agitazione magnetica sterile. Quindi aggiungere cinque millilitri di un esaidrato di cloruro di ferro molare ai 25 millilitri della soluzione CAS continuando a mescolare delicatamente.Ora, aggiungere lentamente i 20 millilitri della soluzione HDTMA nella soluzione complessa CAS di ferro mescolando delicatamente. Preparare la soluzione tampone sciogliendo 15,12 grammi di TUBI in 375 millilitri di acqua doppia deionizzata con agitazione delicata. Regolare il pH a 6,8 con cinque idrossido di sodio molare.Quindi aggiungere acqua per portare il volume a 450 millilitri. Ora aggiungi cinque grammi di agarosio alla soluzione. Autoclavare la soluzione tampone PIPES e la soluzione complessa CAS di ferro a 121 gradi Celsius per 30 minuti.Aggiungere con cura l'intera soluzione complessa CAS di ferro all'intero tampone PIPES nell'armadio di biosicurezza dopo che ognuno di essi è stato autoclavato. Posizionare la soluzione mista in un bagno d'acqua a 50 gradi Celsius. Ora posiziona una barca di reagenti sterile nella sabbia sterile all'interno dell'armadietto della biosicurezza e riscalda a 50 gradi Celsius.Trasferire l'agar complesso CAS di ferro sulla barca, quindi aliquotare rapidamente 100 microlitri in ogni pozzo di una micropiatta sterile a fondo piatto chiara a 96 poder. Preparare 800 micromolare standard di pilodina in mezzo M9 modificato precedentemente preparato. Diluire la soluzione in soluzioni micromolare 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25.Aggiungere EDTA a 500 millilitri di mezzo M9 modificato precedentemente preparato per preparare lo standard EDTA da 3,2 millimolare. Diluire questa soluzione in soluzioni micromolare 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25. Per generare una curva standard, aggiungere 100 microlitri di ogni concentrazione di pyoverdine ed EDTA per separare i pozzi di una micropiatta da 96 po ' contenente 100 microlitri di ferro CAS complesso agar medium.Effettuare repliche tecniche duplicate di ogni concentrazione. Aggiungere anche pozzi vuoti con solo M9. Utilizzando un lettore di micropiastra, misurare l'assorbanza dopo un'incubazione di una, sei e 24 ore a 22 gradi Celsius e utilizzare le misurazioni dell'assorbanza per generare curve standard. Lavare l'apparecchiatura di campionamento con 22 micron di filtro a doppia acqua deionizzata seguita dal 70% di etanolo e pulire con tovaglioli di carta.Eseguire il lavaggio prima del campionamento e tra i campioni per mantenere la tecnica sterile e ridurre la contaminazione incrociata. Dopo aver eccitato i tessuti vegetali e scavato una piccola palla di radice dalle piante sul campo, posizionare la palla di radice in un sacchetto di plastica etichettato separato per la separazione del campione nell'ambiente di laboratorio. Posizionare tutti i campioni direttamente sul ghiaccio e conservare a quattro gradi Celsius fino a quando i campioni non vengono elaborati per il saggio di produzione del sideroforo.Separare i campioni di suolo associati alle radici in terreno di rizosfera sfuso e vagamente legato e nel suolo della rizosfera strettamente legato. Per fare ciò, prendi le palle di radice dalle borse e scrollati delicatamente di gitare il terreno dalla palla di radice. Scosso dal terreno, insieme al terreno lasciato nella borsa, comprendono il terreno sfuso.Questo è il suolo della rizosfera vagamente legato. Genera terreno rizopshere strettamente legato prendendo radici con il campione strettamente legato e mettendole in un tubo di centrifuga. Aggiungere 30 millilitri di acqua e vortice doppi deionizzati per due o tre minuti.Rimuovere le radici per ottenere la diluizione del suolo della rizosfera strettamente legata. Omogeneizzare ogni campione di terreno all'interno del sacchetto campione mescolando e ruotando il terreno il più possibile senza aprire la borsa. Dopo che ogni campione è stato accuratamente miscelato, aliquota e sospendere due grammi di ciascun campione di terreno in 20 millilitri di mezzo M9 modificato all'interno di un tubo di centrifuga sterile da 50 millilitri.Diluire il campione e quindi sigillare il tubo con un tappo di schiuma sterile per consentire l'aerazione. Per campioni di rizosfera strettamente legati, aggiungere due millilitri del liquame del suolo della rizosfera a 20 millilitri di mezzo M9 modificato all'interno di un tubo di centrifuga sterile da 50 millilitri. Diluire il campione e quindi sigillare il tubo con un tappo di schiuma sterile per consentire l'aerazione.Per preparare il campione di tessuto, sterilizzare in superficie la radice, sparare e il grano con il 70% di etanolo. Macerare due grammi di tessuto fresco in 20 millilitri di mezzo M9 modificato utilizzando un frullatore in alto per 30 secondi. Quindi, trasferire il campione in un tubo di centrifuga sterile da 50 millilitri, diluire e sigillare il tubo con un tappo di schiuma sterile.Per arricchire la produzione di sideroforo attraverso la limitazione del ferro incubare i tubi di centrifuga da 50 millilitri a temperatura ambiente e agitare a 160 giri/min. A 24, 48 e 72 ore dall'inizio della coltura di arricchimento, rimuovere un sottocampione millilitro dai tubi di arricchimento con tecnica sterile. Centrifugare i sottocampioni a 10.000 volte G per un minuto in due tubi di centrifuga millilitro per pellettizzare le cellule.Utilizzando una tecnica sterile, aggiungere 100 microlitri del supernatante a una soluzione da 100 microlitri di agar complesso CAS di ferro in duplicato o triplicato all'interno della micropiatta. Aggiungere anche 100 microlitri di mezzo M9 sterile come spazi vuoti. Quindi incubare il piatto a 28 gradi Celsius.Ogni piastra deve essere sigillata e coperta con un foglio prima del posizionamento nell'incubatore. Sospendere il supernatante rimanente e il pellet per ogni campione nel proprio tubo di centrifuga sterile a due millilitri. Aggiungere 400 microlitri di glicerolo sterile in ogni tubo supernatante del campione e sospendere di nuovo il pellet per creare scorte di glicerolo.Congelare il titolo a meno 80 gradi Celsius per un'analisi successiva. Misurare l'assorbanza a sei, 24, 48 e 72 ore ad una lunghezza d'onda di 420 nanometri. Una miscela di pioverdina biosintesizzata da Pseudomonas fluorescens è stata utilizzata come standard per interpretare e quantificare l'assorbanza dei campioni in campioni di equivalenza della pilorsidina in micromolare.La relazione tra l'assorbanza a 420 nanometri e la concentrazione iniziale di pioverdina è mostrata qui. L'attività sideroforica dell'arricchimento di 72 ore è stata valutata a 48 ore di incubazione per determinare l'influenza del genotipo e del tipo di campione sull'isolamento del sideroforo. L'attività del sideroforo nei campioni di terreno sfuso era relativamente bassa e non presentava differenze tra il genotipo di grano da cui è stato campionato il terreno sfuso.Tuttavia, gli arricchimenti di terreno liberamente legato isolato dal genotipo 725 presentavano una maggiore produzione di sideroforo rispetto al terreno liberamente legato di Madsen e 727 ma non di Lewjain. Al contrario, la produzione di siderofori negli arricchimenti da terreni strettamente legati non è stata fortemente influenzata dal genotipo. Le colture di arricchimento del tessuto cerealico hanno prodotto una produzione di sideroforo relativamente bassa indipendentemente dal genotipo.Gli arricchimenti del tessuto di germoglio di Lewjain avevano una produzione di sideroforo significativamente inferiore rispetto agli altri genotipi, e 725 colture di tessuti di germoglio hanno portato a una produzione di sideroforo più variabile. La maggiore differenza nell'attività del sideroforo è stata osservata nelle colture di arricchimento dei tessuti delle radici in cui 725 avevano più del 200% di attività sideroforica maggiore rispetto a tutti gli altri genotipi. Uno degli aspetti più fiscali dell'esecuzione del protocollo è il mantenimento delle condizioni asettiche, completando al contempo i numerosi passaggi per generare la micropiatta di agar di ferro CAS e testando campioni per l'attività del sideroforo.Una vasta gamma di tecniche cromatografiche basate sulla coltura o sul DNA possono essere applicate sia al pozzo del microtitere reale che alla coltura preservata dal glicerolo per ulteriori test biochimici o caratterizzazione genetica e modellazione metabolica. Utilizzando questo protocollo, l'attività del sideroforo può essere successivamente collegata a organismi specifici responsabili di tale attività o successivamente presa di mira come meccanismo per impatti ecologici più grandi. Questo protocollo potrebbe essere facilmente modificato per valutare la produzione di siderofori nelle colture di arricchimento generate da campioni raccolti da altri compartimenti ambientali tra cui aria, acqua e sedimenti.

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