Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging di Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), e Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)
6 agosto 2019
Qui, i protocolli per l'esecuzione di immagini di tomografia computerizzata a raggi X (microCT) microfocus di tre animali invertebrati marini sono spiegati in dettaglio. Questo studio descrive passaggi quali la fissazione dei campioni, la colorazione, il montaggio, la scansione, la ricostruzione delle immagini e l'analisi dei dati. Vengono inoltre forniti suggerimenti su come il protocollo può essere regolato per diversi campioni.
La microTC non è stata ampiamente applicata agli invertebrati marini a causa della loro diversità morfologica. Il nostro metodo consente un facile montaggio di campioni a qualsiasi angolazione adatta alla sua morfologia. Può essere eseguito con materiali comuni, come acqua, argilla e tubi e, se applicabile, a campioni con una varietà di forme, da un verme lungo a una palla rotonda.
A dimostrare la procedura sarà Akiteru Maeno, tecnico del National Institute of Genetics, Giappone. Per iniziare, preparare lo 0,5% di agarosio sciogliendo 500 milligrammi di agarosio in 100 millilitri di acqua distillata in un pallone conico da 250 millilitri e posizionare il pallone in un forno a microonde alla potenza di 800 watt per riscaldare circa uno o tre minuti. Raffreddare il pallone a temperatura ambiente.
Per montare campioni di grandi dimensioni che non si adattano a una punta blu micropipetta da 1000 microlitri, come A.equina, posizionare prima il campione macchiato in un piatto da 60 millimetri con acqua distillata per lavare via l'eccessiva soluzione di colorazione dalla superficie. In un tubo da 50 millilitri versare delicatamente cinque millilitri dello 0,5% di agarosio senza fare bolle. Posizionare il tubo sul ghiaccio per indurire l'agarosio.
Quindi aggiungere 20 millilitri dello 0,5% di agarosio al tubo, posizionare sul ghiaccio fino a quando l'agarosio inizia a indurirsi e utilizzare le forcette per posizionare il campione all'interno dell'agarosio. Regolare la posizione del campione in modo che il suo asse del corpo sia verticale. Indurire l'agarosio sul ghiaccio.
Posizionare l'argilla sullo stadio di montaggio del microCT e impostare il tubo da 50 millilitri sull'argilla. Per montare piccoli campioni che si adattano a una punta blu micropipetta da 1000 microlitri, come Harmothoe sp. e X.japonica, decantare il campione macchiato in un piatto da 60 millimetri senza utilizzare le forcep.
Con le pinzette ad anello, trasferire delicatamente i campioni in un altro piatto da 60 millimetri riempito con acqua distillata per lavare via l'eccessiva soluzione di colorazione dalla superficie. Successivamente, redigere 100 microlitri dello 0,5% di agarosio in una punta blu micropipetta da 1000 microlitri e posizionarlo sul ghiaccio per indurirlo. Quando si maneggia Harmothoe sp.
aggiungere 1000 microlitri dello 0,5% di agarosio nella spina di agarosio nella punta. Utilizzare le pinzette ad anello per trasferire delicatamente Harmothoe sp.
Con un ago petiolato o una pinzetta di precisione, regolare la posizione e l'orientamento dell'Harmothoe sp. Assicurarsi che non siano presenti bolle, quindi posizionare la punta sul ghiaccio per indurire l'agarosio.
Quando si maneggiano campioni fragili come X.japonica, utilizzare una micropipetta per aggiungere 1000 microlitri di acqua distillata nella punta blu con il tappo di agarosio indurito. Posizionare la X.Japonica nell'acqua distillata in modo che sia stabile tra le pareti della punta. Per campioni più piccoli, è possibile utilizzare una punta gialla micropipetta da 200 microliter.
In questo caso, utilizzare 30 microlitri di agarosio per la spina e aggiungere 200 microlitri di agarosio o acqua distillata. Quindi, tagliare la punta da una nuova punta blu micropipetta da 1000 microliter e inserire la punta della punta collegata nella nuova punta. Posizionare l'argilla sullo stadio di montaggio del microCT e impostare le punte con il campione all'interno sull'argilla.
Subito dopo aver montato i campioni, accendere il fascio di raggi X a 80 kilovolt e 100 microampe. Osservando l'immagine di trasmissione a raggi X, spostare lo stadio in modo che l'intero campione possa essere visto facendo clic sui pulsanti dell'asse x e z e regolando manualmente la manopola dell'asse y sullo stadio di montaggio. Regolare le condizioni di contrasto dell'immagine in modo da poter osservare le strutture interne.
Regolare l'orientamento del campione modificando l'angolo del tubo nell'argilla. Ruotare il palco di 90 gradi impostando l'asse di rotazione su 90 e facendo clic sul pulsante Movimento relativo. Eseguire la stessa manovra quattro volte per completare una rotazione completa.
Spegnere manualmente il fascio di raggi X ogni volta che la porta del campione viene aperta, a meno che il sistema non la s spenta automaticamente. Ora fare clic sul pulsante dell'asse Z e regolare manualmente la manopola dell'asse y per spostare la fase di montaggio in modo che il campione si trova al centro della vista. Ruotare il palco di 90 gradi e regolare nuovamente il campione al centro.
Ruotare lo stage di 90 gradi altre tre volte e regolare in base alle esigenze per assicurarsi che il campione si trova al centro della vista da tutte le direzioni. Quindi, fare clic sul pulsante dell'asse X per spostare lo stadio lungo l'asse X verso la sorgente del fascio di raggi X per ingrandire il campione e regolare in base alle esigenze in modo che si adatti solo alla vista. Ruotare il palco e regolare in base alle esigenze per assicurarsi che il campione rientri nella vista da tutte le direzioni.
Regolare le condizioni di scansione e quindi iniziare la scansione. In questo esperimento, l'imaging microCT è stato eseguito su Actinia equina, Harmothoe sp.
La colorazione ha migliorato con successo il contrasto delle strutture interne in tutti i campioni, consentendo osservazioni di tessuti molli interni. Questo metodo è applicabile a campioni fragili anche con danni esterni, come si può vedere dall'esemplare X.japonica con epidermide gravemente danneggiata. Un singolo set di dati ad alta risoluzione di un intero campione è stato ricostruito per Harmothoe sp.
e X.japonica da scansioni multiple eseguite su parti diverse ma sovrapposte del campione. Assicurarsi di impostare il campione nel tubo o nella punta e montare il tubo o la punta nel microCT in modo che non si muova durante la scansione. I dati ottenuti da questa procedura possono essere utilizzati per ricostruzioni di immagini 3D, consentendo al ricercatore di comprendere appieno la morfologia interna ed esterna del campione.
Tutti i sistemi microCT utilizzano raggi X, ma le specifiche possono essere diverse da un sistema all'altro, quindi assicurati di seguire da vicino le istruzioni di ogni sistema.
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Panoramica
Questo articolo descrive i protocolli per l'immagine di tomografia computerizzata a raggi X microfocali (microCT) di invertebrati marini. Tratta la preparazione del campione, inclusa la fissazione, la colorazione e il montaggio, nonché la scansione e l'analisi dei dati.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia marina
- Tecniche di imaging
Sfondo
- La microCT ha un'applicazione limitata negli invertebrati marini a causa della diversità morfologica.
- Il metodo consente un montaggio flessibile del campione.
- Materiali comuni possono essere utilizzati per la preparazione del campione.
- Dimostrazione di Akiteru Maeno dell'Istituto Nazionale di Genetica, Giappone.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per l'imaging microCT di invertebrati marini.
- Facilitare lo studio di morfologie diverse.
- Migliorare l'accessibilità delle tecniche di imaging per forme campione varie.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di agarosio allo 0,5% per l'inclusione del campione.
- Procedimenti di fissazione e colorazione del campione.
- Montaggio dei campioni a angolazioni appropriate per l'acquisizione delle immagini.
- Tecniche di scansione e ricostruzione delle immagini.
Risultati principali
- Imaging riuscita di varie morfologie di invertebrati marini.
- Dimostrata flessibilità nella preparazione e nel montaggio dei campioni.
- Fornite linee guida per l'adeguamento dei protocolli a diversi tipi di campioni.
- Migliorata comprensione delle applicazioni della microTC in biologia marina.
Conclusioni
- Il protocollo consente un'efficace imaging di diversi invertebrati marini.
- Materiali comuni rendono il metodo accessibile ai ricercatori.
- Applicazioni future potrebbero estendersi ad altri campioni biologici.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'imaging microCT non distruttivo consente una visualizzazione tridimensionale dettagliata delle strutture interne in campioni biologici complessi senza ricorrere alla sezionatura, supportando la validazione degli obiettivi terapeutici e la riduzione del rischio meccanicistico nella fase iniziale della scoperta. Il protocollo affronta le sfide poste dalla diversità morfologica negli invertebrati marini, offrendo un approccio flessibile e riproducibile per lo sviluppo di saggi e flussi di lavoro di screening fenotipico. Fornendo metodi standardizzati di montaggio e colorazione che utilizzano materiali facilmente accessibili, aumenta l'affidabilità predittiva nei modelli preclinici e favorisce l'allineamento di biomarcatori traslazionali in diversi sistemi rilevanti per le malattie.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante imaging 3D non distruttivo dell'anatomia interna e delle strutture dei tessuti molli.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico consentendo l'acquisizione ripetuta di immagini dello stesso campione per monitorare nel tempo i cambiamenti strutturali.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia sul bersaglio fornendo dati strutturali ad alta risoluzione utili a chiarire il coinvolgimento delle vie e la rilevanza funzionale.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive preservando l'integrità del campione e consentendo un orientamento costante.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso procedure standardizzate di inclusione e montaggio in agarosio.
- Scalabilità: Facilita il riutilizzo della piattaforma su diversi tipi di campioni, da vermi allungati a organismi sferici, mediante tecniche di montaggio adattabili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Supporta l'analisi di sistemi rilevanti per le malattie consentendo l'imaging longitudinale di campioni per monitorare i fenotipi strutturali.
- De-risking meccanicistico: Fornisce letture strutturali quantitative che aiutano a correlare le osservazioni fenotipiche con la modulazione del bersaglio.
- Avanzamento basato sul rischio: Genera set di dati 3D affidabili che informano le decisioni di proseguimento o interruzione riducendo l'ambiguità nell'interpretazione anatomica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta consentendo una valutazione strutturale non distruttiva prima dei saggi funzionali, sostenendo le fasi di convalida dell'obiettivo guidata da ipotesi e di identificazione dei composti promettenti.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi rivelando la morfologia interna senza alterare lo stato nativo.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso un montaggio riproducibile del campione che mantiene l'orientamento e riduce al minimo gli artefatti di preparazione.
- Analisi: Fornisce output morfometrici quantitativi in 3D che permettono analisi comparative tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica fornendo basi strutturali per la correlazione di biomarcatori nei modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di imaging riutilizzabile applicabile in progetti multipli e sistemi modello grazie alla sua adattabilità a morfologie diverse.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica attraverso la visualizzazione diretta delle strutture interne.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la scalabilità grazie a semplici protocolli di montaggio che utilizzano acqua, argilla e tubi.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avvio o meno di un progetto fornendo dati strutturali affidabili che riducono i rischi nella selezione delle target.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi grazie a set di dati anatomici chiari e riproducibili che supportano la revisione interfunzionale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in istologia e protocolli di imaging per ottimizzare la colorazione e il contrasto nella visualizzazione dei tessuti molli.
- Presuppone l'accesso a sistemi microCT dotati di impostazioni regolabili di tensione e corrente (ad esempio, 80 kV, 100 µA) e di piattaforme per campioni flessibili.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda i parametri di colorazione (ad esempio, soluzione di Lugol al 25%), montaggio e scansione, al fine di garantire la riproducibilità.
- Comporta considerazioni adattative per campioni fragili o danneggiati, come dimostrato con Xenoturbella japonica mediante stabilizzazione in acqua delle punte.
- Comprende limitazioni pratiche legate alle dimensioni e alla densità del campione, che richiedono aggiustamenti nella concentrazione di agarosio e nei parametri di scansione per un'ottimale penetrazione e contrasto.
