Name: Un modello di amministrazione orale Galleria mellonella a risposte immunitarie Innate Study Commensal-Induced (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Scopri un modello di somministrazione orale con Galleria mellonella per studiare le risposte immunitarie innate. Questo protocollo consente di analizzare le interazioni batteriche senza esperienza pratica pregressa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato finanziato dalla DFG (SPP1656), il gruppo di formazione di ricerca DFG 1708, il Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) e il centro tedesco per ricerca di infezione (DZIF).

1. g. mellonella allevamento e preparazione delle larve per gli esperimenti
Nota: Il ciclo da uovo ad instar Ultima larva dura circa 5-6 settimane.
<ol><li>Trasferire le uova deposte da lepidotteri adulti per scatole da 2 L substrato Tarma della cera (granulosità di cereale del 22%, 22% di farina di frumento, 17,5% cera d'api, 11% latte scremato in polvere, miele di 11%, 11% glicerolo, lievito essiccato di 5.5%). Eseguire l'intero allevamento a 30 ° C al buio.</li>
	<li>Trasferire 25 g di substrato contenente le larve nel substrato fresco dopo circa 1-2 settimane, quando le larve di piccole e piccolissime erano visibili. Sincronizzare le larve dopo 2 settimane in base alle loro dimensioni e mantenere gruppi di 30-40 larve in contenitori 2 L su substrato di tarma della cera per 2 settimane supplementari.</li>
	<li>Selezionare le larve per esperimenti di peso. Utilizzare solo pallide e veloce movimento larve con una massa di 180-200 mg.</li>
</ol>2. coltivazione e preparazione di Bacteroides vulgatus ed Escherichia coli per somministrazione orale
<ol><li>Crescere il batterio anaerobico obbligano Bacteroides vulgatus mpk a 37 ° C anaerobicamente utilizzando vasi e bustine per la creazione di un ambiente anaerobico (vedere Tabella materiali)15,16. Coltivare b. vulgatus per 2 giorni e crescere una sottocultura pernottamento in brodo di cervello cuore infusione (BHI).</li>
	<li>Crescere la mpk di Escherichia coli batterio anaerobico facoltativo in condizioni aerobiche in brodo di Luria-Bertani (LB) a 37 ° C. Coltivare e. coli pernottamento in libbra di brodo e far crescere la sottocultura per 2 h a 37 ° C il giorno dell'esperimento.</li>
	<li>Raccogliere le culture mediante centrifugazione a 1.700 x g per 5 min. Risospendere il batterico pellet in DPBS (di Dulbecco Phosphate-Buffered Saline). Determinare la densità ottica (OD) di colture batteriche a OD 600 nm e calcolare le concentrazioni batteriche. Le concentrazioni batteriche sono state adeguate a 109/ml.</li>
</ol>3. alimentazione forzata delle larve di g. mellonella con sospensioni batteriche
<ol><li>Ingozza ogni larva con 10 µ l di sospensione batterica adattata contenente 107 batteri per dose. Utilizzare una siringa da insulina con ago smussato-conclusa per applicazione orale della sospensione batterica.<ol>
<li>Difficoltà la siringa nella pompa microsiringa (Figura 1) per assicurare l'accuratezza del volume sospensione applicata ad ogni larva (Vedi Tabella materiali). Inserire la siringa con attenzione tra le mandibole. Non forzare la siringa tra le mandibole. Attendere per le larve di aprirlo apparato boccale e poi inserire la siringa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare le larve ad alimentazione forzate al buio a 37 ° C tra le larve di h. 1-24 uso DPBS-amministrato come sfondo finto controlli per escludere potenziali risposte allo stress indotte a causa della gestione delle larve durante l'alimentazione forzata.</li>
</ol>4. elaborazione di larve somministrate per via orale e di isolamento del RNA
<ol><li>Lavorare sotto una cappa e indossare occhiali di sicurezza. Pulire il cappuccio e spray reagente per evitare la contaminazione RNasi.<ol>
<li>Snap-congelare le larve viventi dopo incubazione in azoto liquido e omogeneizzarle. Utilizzare un mortaio e un pistillo per omogeneizzazione. Aggiungere azoto liquido per il mortaio e la griglia ogni individuo larvale fino a quando non sono prodotti in polvere omogeneati.</li>
		<li>Versare l'omogeneizzato per un USA e getta pesatura barca e attendere che l'azoto liquido evapori.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mescolare il liquido esente da azoto congelato omogeneati in polvere con 1 mL di Trizol in una provetta da 2 mL e incubare la miscela a temperatura ambiente per 1 h.</li>
	<li>Centrifugare la miscela a 8.000 x g per 15 min a temperatura ambiente e trasferire il surnatante in una nuova provetta e gettare il pellet. Mescolare il surnatante con 200 µ l di 1-Bromo-3-cloropropano (BCP). Vortex e incubare la miscela per 5 min a temperatura ambiente e per 10 minuti in ghiaccio.</li>
	<li>Centrifugare le reazioni BCP-aggiunto a 18.000 x g per 15 min a 4 ° C. Trasferire lo strato superiore trasparente in una nuova provetta da 2 mL e scartare il resto. Precipitare il RNA dello strato superiore trasferito con 500 µ l isopropanolo miscelazione ed invertendo il tubo per 5 min.</li>
	<li>Centrifugare la provetta a 18.000 x g per 15 min a 4 ° C. Lavare il precipitato pellet di RNA con 500 µ l di etanolo al 75%.</li>
	<li>Asciugare il pellet di RNA per 5-10 minuti a TA. Fare attenzione a non sopra a secco come sarà difficile da sciogliere più tardi.</li>
	<li>Diluire l'inibitore della ribonucleasi (1: 100) in acqua priva di nucleasi e utilizzare 100 µ l della soluzione per risospendere il pellet di RNA secco. Vortice il tubo con attenzione fino a quando la pallina è completamente sciolto.</li>
	<li>Misura RNA qualità e quantità. Assicurare che il rapporto di 260/280 è approssimativamente 2.0 e 260/230 rapporto nella gamma di 2.0-2.2 (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Utilizzare 5 µ g di RNA isolato per digestione dnasi. Mix 5 µ l di tampone, 1 µ l di enzima inibitore della ribonucleasi, 2 µ l di enzima dnasi: 10x, 5 µ g di RNA e riempire con nucleasi-libero dell'acqua fino a 50 µ l. Incubare per 30 minuti a TA.<ol>
<li>Aggiungere 6 µ l di reagente di inattivazione e incubare per 2 min a RT e vortice reazione occasionalmente. Centrifugare la reazione a 10.000 x g per 1 min. trasferimento surnatante in provetta da 1,5 mL fresco. Nota: il RNA contiene il RNA larvale, come pure il RNA batterico del rispettivo ceppo utilizzato per la somministrazione orale.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. quantificazione dei numeri batterici 16S copia dopo alimentazione forzata
Nota: I numeri di copia del 16S batterica espressa è stato determinato usando il cDNA sintetizzato dal RNA estratto nella sezione 4. Quantificazione finale viene calcolato con l'aiuto di una curva standard del plasmide in cui è stato clonato il frammento della PCR 16S di b. vulgatus o e. coli .
<ol><li>Preparazione di standard di plasmide<ol>
<li>Amplificare i frammenti 16S da e. coli mpk o b. vulgatus mpk DNA genomic di PCR. Miscelare 10 µ l di tampone, 1 µ l di soluzione dNTP 10 mM, 2,5 µ l di primer in avanti di 10 µM e 2,5 µ l della diluizione di 10 µM primer reverse, 1 µ l di DMSO, 1 µ l della mascherina del DNA genomico, 31,5 µ l di acqua priva di nucleasi e 0,5 µ l di enzima di bozze: 5x.</li>
		<li>Eseguire la PCR (denaturazione iniziale: 98 ° C per 30 s, denaturazione: 98 ° C per 10 s, ricottura: 60 ° C per 30s, estensione: 72 ° C per 30 s, estensione finale: 72 ° C per 5 min, ripetere la denaturazione, ricottura ed estensione per 30 cicli).<ol>
<li>Utilizzare 16S Escherichia coli primer (p_forward: GTTAATACCTTTGCTCATTGA, p_reverse: ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) o primer b. vulgatus 16S (p_forward: AACCTGCCGTCTACTCTT, p_reverse: CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp) per amplificazione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzare i frammenti PCR 16S e. coli e b. vulgatus per clonazione smussato-fine in un vettore di clonazione. Impostare la pagina di legatura e mescolare 10 µ l di tampone, 1 µ l di prodotto di PCR non purificate, 1 µ l di plasmide clonazione smussato-fine, 7 µ l di acqua priva di nucleasi e 1 µ l di T4 DNA ligasi: 2x. Incubare la legatura per 10 minuti a TA.</li>
		<li>Preparare le celle competenti DH5α di e. coli .<ol>
<li>Inoculare 100 mL di LB medium in un matraccio di Erlenmeyer con 1 mL di una coltura durante la notte. Far crescere la cultura fino a OD 600 nm è compreso tra 0.4-0.6. Dividere la cultura risultante in due provette da 50 mL e incubare le colture in ghiaccio per 10 min.</li>
			<li>Centrifugare le culture a 1.700 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante e risospendere ogni attentamente con 5 mL di soluzione RFI (30mm CH3COOK, 100 mM KCl, 10 mM CaCl, MnCl2, regolare il pH 5,8 con acido glaciale, sterile filtrata). Riempire ogni provetta con ulteriori 45 mL di soluzione RFI.</li>
			<li>Centrifugare le culture a 1.700 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante e risospendere ogni attentamente con 6 mL di RFII (MOPS di 10 mM, 15 mM CaCl2, 10mm KCl, 15% glicerolo, sterilizzato nell'autoclave) soluzione. Piscina sia frazioni e incubare la sospensione di 12 mL in ghiaccio per aliquote per la sospensione delle cellule di 15 min. Prepare (200 µ l). Conservare le aliquote a-80 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Trasferire la reazione di legatura ad un'aliquota del competente Escherichia coli cellule DH5α e lascia la reazione sul ghiaccio per 15 min. Heat shock le cellule per 45 s a 42 ° C e aggiungere 1 mL di terreno LB.<ol>
<li>Incubare la trasformazione per 45 min a 37 ° C. Aggiungere 100 µ l della trasformazione ad una piastra di agar LB contenente ampicillina e incubare per una notte a 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eseguire PCR di 8 trasformanti risultante della Colonia dalla piastra di agar LB di passaggio 5.1.5. Scegli ogni Colonia con uno stuzzicadenti, immergerlo in un fresco piatto LB contenente ampicillina (master piatto) e poi immergere lo stesso stuzzicadenti in un contenente 5,5 µ l di acqua esente da nucleasi in una striscia PCR.<ol>
<li>Aggiungere 7,5 µ l di miscela di x PCR 2, 0,5 µ l di primer in avanti di 10 µM e 0,5 µ l della diluizione di reverse primer 10 µM. Utilizzare le stesse coppie di primer menzionate nella sezione 5.1.1.</li>
			<li>Eseguire PCR (denaturazione iniziale: 95 ° C per 5 min, denaturazione: 95 ° C per 1 min, ricottura: 60 ° C per 30s, estensione: 72 ° C per 1 min, estensione finale: 72 ° C per 7 min, ripetere la denaturazione, ricottura ed estensione per 35 cicli).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verificare la dimensione dei frammenti 16S su gel di agarosio 1%. Utilizzare il buffer di Tris-Borato-EDTA (TBE) x 0,5 per sciogliere 1 g di agarosio e portare a ebollizione in un forno a microonde. Aggiungere colorante 1: 50.000 per gel e versarlo. Aggiungere le reazioni di PCR di Colonia e un DNA ladder 100 bp al gel ed eseguire il gel per 45 min a 110 V.</li>
		<li>Inoculare una cultura di pernottamento LB 5 mL contenente ampicillina con un clone dalla piastra di master (sezione 5.1.6) per ogni e. coli e b. vulgatus del plasmide 16S che contiene la dimensione inserto giusto.<ol>
<li>Centrifugare le colture batteriche durante la notte in una provetta da 2 mL a 1.700 x g. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in acqua sterile di 600 µ l.</li>
			<li>Aggiungere 100 µ l di tampone di lisi e mescolare capovolgendo la provetta 6 volte. Aggiungere 350 µ l di freddo (4° C) soluzione di neutralizzazione e miscelare accuratamente capovolgendo la provetta.</li>
			<li>Centrifugare a massima velocità in una centrifuga per 3 min. trasferire il surnatante (~ 900 µ l) per una colonna di spin e centrifugare a massima velocità in una centrifuga per 15 s.</li>
			<li>Scartare l'attraversamento e aggiungere 200 µ l di endotossina rimozione lavaggio e centrifuga alla massima velocità in una centrifuga per 15 s.</li>
			<li>Aggiungere 400 µ l di soluzione di lavaggio alla colonna e centrifugare in una centrifuga alla massima velocità per 30 s. trasferimento della colonna in una provetta pulita 1,5 mL, 30 µ l di tampone di eluizione per la colonna viene quindi incubato per 1 min a temperatura ambiente.</li>
			<li>Centrifugare a massima velocità in una centrifuga per 30 s (Vedi Tabella materiali).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Determinare la concentrazione di DNA del plasmide mescolando 1 µ l di DNA plasmidico con 199 µ l di soluzione di lavoro (1 µ l di colorante fluorescente a 199 µ l di tampone per ciascuna reazione). Preparare due standard mescolando 10 µ l di standard 1 o 10 µ l di campione 2 con 190 µ l. Vortexare il campione e tubi standard e incubare la reazione per 2 min. misura della concentrazione (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Preparare le concentrazioni standard in diluizioni seriali 10 volte in un intervallo di 10-100.000 copie: calcolo della massa del plasmide singolo (m = (n) x (1.096x10-21 g/bp), n = dimensione del plasmide, m = massa). Calcolare la massa del plasmide DNA necessario a contenere il numero di copie desiderato di interesse (copiare il numero di interesse x massa del plasmide singolo = massa del plasmide DNA necessario).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione dei campioni per la quantificazione<ol>
<li>Sintesi di cDNA. Mescolare 2 µ l di tampone di 7x, 1 µ l di RNA dnasi-digerito da sezione 4 e 11 µ l di acqua esente da nucleasi. Incubare per 2 min a 42 ° C.<ol>
<li>Mettere reazione immediatamente sul ghiaccio. Mix 4 µ l di 5 x RT Buffer, 1 µ l di miscela di primer RT (trascrittasi inversa), 1 µ l di enzima RT e la reazione del punto 5.2.1. Incubare per 15 min a 42 ° C. Incubare per 3 min a 95° C per inattivare l'enzima RT.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Quantificare il cDNA concentrazioni fluorometrically come descritto nel passaggio 5.1.9.</li>
	</ol></li>
	<li>Misurazione della carica batterica<ol>
<li>Regolare le concentrazioni di cDNA a 5 ng per reazione a 12 µ l per PCR quantitativa. Mescolare 2 x RT-PCR mix, 0,25 µ l di primer in avanti di 100 µM, 0,25 µ l di primer reverse a 100 µM (5.1.1) e 12 µ l di cDNA regolato. Eseguire qPCR (denaturazione iniziale: 95 ° C per 5 min, denaturazione: 95 ° C per 10 s, ricottura: 60 ° C per 30 s, ripetere la denaturazione e ricottura per 35 cicli, fusione: 95 ° C, raffreddare a 4 ° C).</li>
		<li>Tracciare le concentrazioni di10 registro della curva standard plasmide (10-100.000 copie), vale a dire 1-5 (asse x), contro i corrispondenti valori di ct (asse y). Eseguire la regressione lineare per ottenere l'equazione di regressione. Risolvere l'equazione per x (concentrazione). Utilizzare la formula per calcolare il log10 dei numeri copia inserendo ct-valore nella formula. Calcolare l'antilogaritmo per ottenere i numeri di copia.</li>
	</ol></li>
</ol>6. determinazione del gene marcatore immune innata mediante RT-PCR quantitativa
<ol><li>Controllare gli iniettori per gene-specificità di PCR e successiva dell'agarosi elettroforesi per verificare la dimensione del frammento corretto. Eseguire PCR come descritto nella sezione 5.1.5. Di Ubiquitin 130 bp: TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC in avanti, retromarcia CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (giornaliere) Bp Nox-4 159: TGGCACGGCATCAGTTATCA, reverse ACAGCGACTGTCATGTGGAA8 in avanti Nos 76 bp: ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, reverse GCCATTTTACAATCGCCACAA8 in avanti Gst 156 bp: GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, reverse TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8 in avanti ApoIII 265 bp: AGACTTGCACGCCATCAAGA, reverse TGCATGCTGTTTGTCACTGC8 in avanti hemolin 267 bp: CTCCCTCACGGAGGACAAAC, reverse GCCACGCACATGTATTCACC8 in avanti bp gallerimycin 161: GAAGTCTACAGAATCACACGA, reverse ATCGAAGACATTGACATCCA8 in avanti bp cecropin 158: CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, reverse GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8 in avanti bp gloverin 101: GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, reverse CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8 in avanti bp moricin 124: GCTGTACTCGCTGCACTGAT, reverse TGGCGATCATTGCCCTCTTT8in avanti)</li>
	<li>Valutare l'efficienza di primer per essere E = 2.<ol>
<li>Piscina 2 µ l di 5-10 differenti campioni positivi (cioè, campioni che esprimono il gene per il quale la coppia di primer deve essere studiato).</li>
		<li>Preparare una serie di diluizioni 1:5 della piscina del campione: campione 1 (S1): non diluito piscina; S2: 2 µ l di S1 + 8 µ l nuclease-free water; S3: 2 µ l di S2 + 8 µ l nuclease-free water; S4: 2 µ l di S3 + 8 µ l nuclease-free water.</li>
		<li>Applicare 1 µ l di S1-S4 e un controllo non modello (acqua priva di nucleasi) ad una piastra a 96 pozzetti qPCR. Aggiungere 5 µ l di mix master RT, 0,1 µ l di ogni primer forward e reverse di µM 100, 3,7 µ l di acqua priva di nucleasi e 0,1 µ l di miscela di RT per bene.</li>
		<li>Eseguire RT-PCR quantitativa (trascrizione inversa: 50 ° C per 10 min, denaturazione iniziale: 95 ° C per 5 min, denaturazione: 95 ° C per 10 s, ricottura: 60 ° C per 30 s, ripetere la denaturazione e ricottura per 40 cicli di fusione: 95 ° C, raffreddare a 4 ° C).</li>
		<li>Trama log10 di unità relative per S1-S4 (1, 0,2, 0,04, 0,008) (asse x) contro i corrispondenti valori di ct (asse y). Eseguire la regressione lineare e determinare la pendenza della curva standard. Calcolare l'efficienza e: E = 10-(1/slope). 20 Nota: Una pendenza di -3.32 indica condizioni di reazione ideale e l'efficienza di primer di E = 2.00. Ciò significa: la quantità di prodotto di PCR si raddoppia durante ogni ciclo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uso 100 ng di RNA digerito (100 ng / µ l) come modello per la RT-PCR. Reagenti mix RT-PCR e RT-PCR esecuzione come accennato nella sezione 6.2. Misurare tutti i campioni di batteri e DPBS amministrati con coppia di primer di pulizie sia coppie di primer di destinazione. Sempre eseguire le diluizioni S1-S4 con la coppia di primer di pulizie e S1-S4 con la coppia di primer di destinazione nello stesso piatto per la determinazione di efficienza.</li>
	<li>Calcolare il rapporto (R) dell'espressione genica RNA secondo la formula seguente utilizzando l'efficienza di primer determinato per via sperimentale sia la pulizia che la coppia di primer di destinazione. Normalizzare i batteri stimolato campioni a deridere controlli20. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59270/59270eq1.jpg"> R: rapporto Edestinazione: efficienza di S1-4 misurata con coppia di primer di destinazione Eservizio di pulizie: efficienza di S1-4 misurata con coppia di primer di pulizie Δctdestinazione(campione di controllo): Δct (CT del campione DPBS-fed)-(ct di batteri-Federazione campione) misurato con coppia di primer di destinazione Δctdelle pulizie(campione di controllo): Δct (CT del campione DPBS-fed)-(ct di batteri-Federazione campione) misurato con coppia di primer di pulizie</li>
</ol>

<ol><li>Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+the+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD%3A+lessons+from+mouse+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).</li>
<li>Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+antimicrobial+peptides+during+homeostasis%2C+infection%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease.</a> Frontiers in Immunology. 3, 310(2012).</li>
<li>Ivanov, I. I., Honda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+commensal+microbes+as+immune+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Intestinal commensal microbes as immune modulators.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).</li>
<li>Ayres, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasome-microbiota+interplay+in+host+physiologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies.</a> Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).</li>
<li>Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+G.+mellonella+Larvae+to+Provide+Reliable+and+Reproducible+Results+in+the+Study+of+Fungal+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens.</a> Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).</li>
<li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Insect Science. , (2016).</li>
<li>Buchmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Innate+Immunity%3A+Clues+from+Invertebrates+via+Fish+to+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals.</a> Frontiers in Immunology. 5, 459(2014).</li>
<li>Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galleria+mellonella%3A+A+Novel+Invertebrate+Model+to+Distinguish+Intestinal+Symbionts+From+Pathobionts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts.</a> Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).</li>
<li>Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. , 1-16 (2016).</li>
<li>Bolouri Moghaddam, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+the+Galleria+mellonella+innate+immune+system+is+maximized+by+the+co-presentation+of+diverse+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides.</a> Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).</li>
<li>Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Signaling+and+Antimicrobial+Peptide+Expression+in+Lepidoptera%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera.</a> Insects. 4 (3), 320-338 (2013).</li>
<li>Mukherjee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galleria+mellonella+as+a+model+system+for+studying+Listeria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).</li>
<li>Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+virulence+of+Candida+albicans+mutants+in+mice+and+Galleria+mellonella+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunological+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae.</a> FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).</li>
<li>Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Galleria+mellonella+caterpillar+as+a+model+host+to+study+the+role+of+the+type+III+secretion+system+in+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).</li>
<li>Waidmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteroides+vulgatus+protects+against+Escherichia+coli-induced+colitis+in+gnotobiotic+interleukin-2-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice.</a> Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).</li>
<li>Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Mobilome-Driven+Genome+Diversification+in+Mouse+Gut-Associated+Bacteroides+vulgatus+mpk%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk.</a> Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).</li>
<li>Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gut+Microbiotassay%3A+a+high-throughput+qPCR+approach+combinable+with+next+generation+sequencing+to+study+gut+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity.</a> BMC Genomics. 14, 788(2013).</li>
<li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OmpA+variants+affecting+the+adherence+of+ulcerative+colitis-derived+Bacteroides+vulgatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+and+Dental+Science%22%5BJournal%5D)">OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus.</a> Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).</li>
<li>Freitak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal+transfer+of+bacteria+can+mediate+trans-generational+immune+priming+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects.</a> Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 29 (9), 45(2001).</li>
<li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392(2012).</li>
<li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392(2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il modello g. mellonella è un modello frequentemente usato per valutare i fattori di virulenza batterici in un approccio di infezione sistemica21. Poiché molti patogeni e batteri immettere l'host via orale colonizzazione o infezione, nuove intuizioni devono essere trovati per valutare mellonella g. come un modello per colonizzazione orale e l'infezione.
La possibilità di posteriore g. mellonella tra 15-37 ° C è un grande vantaggio poiché model...

Il microbioma intestinale è una componente essenziale per il mantenimento dell'omeostasi e coinvolge entrambi immunitaria innata e adattativa1,2. La comunità di microflora commensale è caratterizzata da diversi costituenti principali commensale: simbionti che conferiscono benefici effetti immunomodulatori importanti funzioni, e pathobionts che può avere effetti nocivi geneticamente predisposti ospita e promuovere e attivare l'infiammazione intestinale3,4. Molti studi su simbionti e pathobionts e la loro influenza sul sistema immunitario dell'ospite sono stati pubblicati soprattutto studiare risposte immunitarie.
Poiché questi studi coinvolgono molti animali per le indagini e la protezione e la sostituzione degli animali utilizzati per la sperimentazione è di crescente interesse pubblico, noi cerchiamo di trovare un modello di sostituzione per consentire una proiezione di diversi batteri immunogeno Proprietà. Gli insetti, soprattutto Galleria mellonella, sono un modello di sostituzione ampiamente usato nella ricerca di infezione. G. mellonella combina diversi vantaggi quali bassi costi e produttività elevata; consente la somministrazione orale di batteri, che è la via di esposizione naturale, e per infezioni sistemiche5,6. G. mellonella ulteriormente consente di incubazione a 37 ° C, che è la temperatura corporea fisiologica di mammiferi e l'optimum per la virulenza batterica fattore espressione5. Il vantaggio principale di g. mellonella è conservato sistema immune innato che consente la discriminazione di sé dal non-sé e codifica per una varietà di recettori di riconoscimento di pattern come apolipophorin o l'opsonina hemolin6, 7. al momento della rilevazione di microbo, g. mellonella può innescare diverse risposte immunitarie umorali a valle. Può indurre risposte allo stress ossidativo e secernono le specie reattive dell'ossigeno (ROS) che coinvolge l'attività della NOS (ossidasi nitrico sintasi) e NOX (NADPH ossidasi)6,8. Inoltre, g. mellonella attiva una risposta potente peptide antimicrobico (AMP), che provoca la secrezione di una miscela di diversi amplificatori quali gloverin, moricin, cecropin o la defensina-come gallerimycin6, 8,9,10. Generalmente, AMPs hanno specificità d'ospite piuttosto ampio contro batteri Gram-positivi e Gram-negativi e funghi e devono fornire una risposta potente poiché gli insetti stanno mancando qualsiasi risposta adattativa10. Gloverin è un amplificatore attivo contro batteri e funghi e inibisce la formazione della membrana esterna6,11. Moricins esibiscono la loro funzione antimicrobica contro batteri Gram-positivi e Gram-negativi di penetrare la membrana e formando un poro9,11. Cecropine fornire attività contro batteri e funghi e permeabilize la membrana allo stesso modo come moricins9,10. Gallerimycin è un peptide defensina-come con proprietà anti-fungine9. Interessante, è stato trovato che la combinazione di cecropin e gallerimycin aveva un'attività sinergica contro Escherichia coli10.
A causa del loro carattere easy-to-use mellonella g. larve sono un modello di infezione spesso usato per valutare la patogenicità batterica. In particolare, studi in cui i dati ottenuti da g. mellonella correlano con i dati ottenuti da topi sostegno la forza di questo modello di host alternativi. Si è constatato che i sierotipi più patogeni di Listeria monocytogenes in un modello di infezione di topo conducono anche a più alti tassi di mortalità in g. mellonella dopo infezione sistemica. Inoltre, meno virulenti sierotipi che si è rivelati per essere anche meno virulento in g. mellonella modello12. Osservazioni simili sono stati fatti con i funghi patogeni umani Candida albicans. Virulenza di diversi albicans del c. ceppi è stato valutato dall'infezione sistemica e successivo monitoraggio di sopravvivenza larvale. Ceppi non virulenti del mouse erano anche non virulenti o esposte ridotta virulenza in mellonella g., mentre i ceppi virulenti del mouse conducono anche ad alta mortalità larvale13. Il modello g. mellonella ulteriormente possa essere utilizzato per identificare fattori di patogenicità di tipo 3 secrezione sistema di Pseudomonas aeruginosa14.
Poiché la maggior parte delle indagini che coinvolgono mellonella g. erano concentrata su fattori di virulenza utilizzando l'approccio di infezione sistemica eravamo particolarmente interessati a fornire un metodo adatto per l'analisi dei commensali intestinali in un'alimentazione orale forzata modello in cui possiamo applicare un dosaggio distinto di batteri per le larve e non solo osservare il tasso di mortalità larvale ma analizzare diversi tratti distintivi della risposta immunitaria innata per mantenere l'omeostasi intestinale.
Il nostro metodo contribuisce ad per aumentare l'uso di g. mellonella come un modello di sostituzione poiché uniamo l'applicazione dei batteri e l'analisi di espressione di RNA. Non solo è utile per rafforzare il significato degli studi di patogenesi batterica quando si include l'analisi delle risposte immunitarie dopo somministrazione orale e non solo l'osservazione dei tassi di mortalità dopo infezione sistemica. I nostri metodi consente per l'analisi delle proprietà immunogeniche di batterico non patogeni commensali poiché è offre condizioni più complesse rispetto a coltura cellulare offrendo una barriera intestinale in un organismo vivente.

<table><tbody><tr><td>Provette da 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA ladder&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific 15628019</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Bromo-3-Cloropropano (BCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>2 provette da 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>2x Mangomix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25033</td><td>Colony PCR</td></tr><tr><td>50 mL provette</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210 261</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Cera</td><td>d'api</td> <td>Mixed-Store.de-Cervello</td><td></td></tr> <tr><td>cuore infusione brodo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>CloneJET PCR Kit di clonazione</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1232</td><td>Vettore di clonazione per frammenti 16S</td></tr><tr><td>Semola di mais</td><td>Osterm&uuml; hle Naturkost GmbH</td><td>306</td><td>Coltivazione biologica</td></tr><tr><td>Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD</td><td></td></tr><tr><td>Difoco LB Brodo, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Becton Dickinson</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Kit di rimozione del DNA senza DNA&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>244510</td><td>&nbsp; Digestione Dnase</td></tr><tr><td>Lievito secco</td><td>Rapunzel</td><td>&nbsp;-</td><td>Coltivazione biologica</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W252506</td><td></td></tr><tr><td>Miele</td><td>Osterm&uuml; hle Naturkost GmbH</td><td>487</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp;</td><td>VWR</td><td>20842.330</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 Instrument II</td><td>Roche Molecular Systems</td><td>5015278001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, bianco</td><td>Roche Molecular Systems</td><td>4729692001</td><td></td></tr><tr><td>Pompa manuale per microsiringhe con display digitale</td><td>World Precision Instruments</td><td></td> Siringa per insulina DMP <td></td></tr><tr><td>Micro-Fine+ U-100 0,3 x 8 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>324826</td><td>Mortaio per somministrazione orale</td></tr><tr><td>, non smaltato</td><td>VWR</td><td>410-9327&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518</td><td></td></tr><tr><td>Acqua senza nucleasi&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977035</td><td></td></tr><tr><td>bustine Oxoid AnaeroGen&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific AN0025A</td><td></td><td>Qualità e quantità di strisce RNA</td></tr><tr><td>PCR</td><td>Biozym</td><td>710970</td><td></td></tr><tr><td>Pestello, superficie di macinazione non smaltata</td><td>VWR</td><td>410-9324&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Enzima di correzione bozze Phusion&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F553S</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>Biomeri</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plasmide Miniprep System</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>QuantiFast SYBR Green PCR kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>204056</td><td>qPCR per la misurazione del numero di copie batteriche</td></tr><tr><td>Kit QuantiFast SYBR Green RT-PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>204156</td><td>qRT-PCR per misure di espressione genica</td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa QuantiTect</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td>sintesi del cDNA</td></tr><tr><td>Qubit Provette per saggi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Kit Qubit dsHS DNA&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>Quantificazione di campioni di plasmidi e cDNA</td></tr><tr><td>Fluorimetro Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33226</td><td>Quantificazione di campioni di plasmidi e cDNA</td></tr><tr><td>RNase-ExitusPlus</td><td>AppliChem</td><td>A7153</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della ribonucleasi Rnasina</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Latte scremato in polvere</td><td>Sucofin</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>SYBR sicuro DNA Gel Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>TRI reagente&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Pesatrice</td><td>VWR</td><td>10803-148</td><td></td></tr><tr><td>Farina di grano</td><td>Osterm&uuml; hle Naturkost GmbH</td><td>6462</td><td>Coltivazione biologica</td></tr></tbody></table>

un modello di amministrazione orale galleria mellonella a risposte immunitarie innate study commensal-induced

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

L'indagine del potenziale immunogenico di batteri commensali il sistema immunitario dell'ospite è una componente essenziale nello studio di interazioni ospite-microbo intestinale. È affermato che diversi commensali esibiscono un diverso potenziale per stimolare il sistema immunitario intestinale di host. Tali indagini coinvolgono animali vertebrati, soprattutto roditori. Poiché crescenti preoccupazioni etiche sono collegate con esperimenti su vertebrati, c'è una forte domanda per i modelli di sostituzioni degli invertebrati.
Qui, forniamo un modello di somministrazione orale di Galleria mellonella utilizzando batteri commensali non patogeni e la possibile valutazione del potenziale immunogenico di commensali sul sistema immunitario mellonella g. . Dimostriamo che mellonella g. è un modello di sostituzione degli invertebrati alternativa utile che permette l'analisi di commensali con differente potenziale immunogenico quali Bacteroides vulgatus ed Escherichia coli. Interessante, i batteri hanno esibito alcun effetto di uccidere le larve, che è simile a quella dei mammiferi. Le risposte immunitarie di g. mellonella erano comparabili con la risposta immune innata dei vertebrati e coinvolgere il riconoscimento dei batteri e la produzione di molecole antimicrobiche. Proponiamo che mellonella g. era in grado di ristabilire l'equilibrio di microbiota precedente, che è ben noto da individui sani dei mammiferi. Anche se fornire risposte immunitarie innate paragonabile in entrambi mellonella g. e vertebrati, g. mellonella non porto un sistema immunitario adattativo. Poiché i componenti studiati del sistema immunitario innato sono evolutivi conservato, il modello consente un'analisi di preselezione e prima del batterica proprietà immunogeniche.

Il modello di infezione g. mellonella emolinfa in ampiamente usato per analizzare i fattori di virulenza di una grande varietà di agenti patogeni. Maggior parte delle misure comprendono l'analisi della mortalità di larve, che è un metodo abbastanza facile. Tuttavia, questo metodo non consentono conclusioni sulle risposte immunitarie in generale e collegare i risultati delle risposte immunitarie mellonella g. con meccanismi immuni vertebrati. Il modello di somministrazion...

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per un modello di somministrazione orale utilizzando larve di Galleria mellonella e come caratterizzare indotto risposte immunitarie innate. Usando questo protocollo, i ricercatori senza esperienza pratica sarà in grado di utilizzare la mellonella g. alimentazione forzata di metodo.

Un modello di amministrazione orale Galleria mellonella a risposte immunitarie Innate Study Commensal-Induced

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Il nostro protocollo espande l'utilizzo di G.mellonella da modello di infezione sistemica a modello che consente la somministrazione batterica attraverso la via orale naturale. G.mellonella è un modello sostitutivo adatto per i roditori nell'analisi di diversi segni distintivi delle interazioni micro-post innate in quanto le larve possono essere utilizzate per batteri patogeni umani. Inizia trasferendo le uova deposte dalle tarme adulte in scatole da due litri contenenti substrato di falena di cera, a 30 gradi Celsius, al buio.Dopo una o due settimane, trasferire 25 grammi di larva contenente substrato in substrato fresco, quando la larva piccola e piccola diventa visibile. Sincronizza le larve dopo due settimane in base alle loro dimensioni, in gruppi da 30 a 40 larve in nuovi contenitori da due litri su substrato di falena di cera. Dopo due settimane, seleziona le larve per l'esperimento in base al peso.Usando solo larve pallide e in rapido movimento con una massa da 180 a 200 milligrammi. Per forzare l'alimentazione delle larve, caricare una siringa per insulina con un ago smussato per l'applicazione orale, con uno per 10 al settimo batterio per 10 microlitri di DPBS per larva. Caricare la siringa in una pompa a microsiringa.Attendere che una larva apra le parti della bocca prima di inserire attentamente la siringa tra le mattidi e fornire i batteri. Quando tutta la larva è stata nutrita, incubare gli animali al buio a 37 gradi Celsius, da una a 24 ore. Per la lavorazione delle larve, pulire una cappa di sicurezza con etanolo e reagente spray per prevenire la contaminazione da RNasi.Snap congela la larva vivente in azoto liquido. Omogeneizzare ogni singola larva congelata usando un mortaio e un pestello e un piccolo volume di azoto liquido. Quando è stato prodotto un omogeneato in polvere, trasferire l'omogeneato su una barca di attesa usa e getta e attendere che l'azoto liquido evapori.Quando tutta la larva è stata omogeneizzata, mescolare gli omogeneati in polvere con un millilitro di TRIzol in un tubo a due millilitri. Incubare la miscela a temperatura ambiente per un'ora. Alla fine dell'incubazione, pellettizzare l'omogeneato per centrifugazione.Trasferire il supernatante in un nuovo tubo. Mescolare il supernatante con 200 microlitri di 1-Bromo-3-cloropropano, o BCP. Vortice e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente, seguito da un'incubazione di 10 minuti sul ghiaccio.Alla fine della seconda incubazione, centrifugare la reazione aggiunta dal BCP e trasferire lo strato trasparente superiore in un nuovo tubo da due millilitri. Precipitare l'RNA dello strato superiore trasferito con 500 microlitri di isopropanolo mescolando e invertendo il tubo per cinque minuti. Quindi raccogliere l'RNA precipitato per centrifugazione.Lavare il pellet di RNA precipitato con 500 microlitri di etanolo al 75% e asciugare l'RNA per cinque-10 minuti a temperatura ambiente. Quando l'etanolo è evaporato, aggiungere 100 microlitri di inibitore della ribonucleasi in acqua priva di nucleasi al pellet di RNA essiccato e vortice con cura il tubo fino a quando il pellet non è completamente sciolto. Misurare la qualità e la quantità dell'RNA in base ai protocolli standard, assicurando che il rapporto tra 260 e 280 sia di circa due, e il rapporto da 260 a 230 sia nell'intervallo da due a 2,2.Quindi utilizzare cinque microgrammi dell'RNA isolato per la digestione della DNasi e l'analisi dell'espressione genica, secondo protocolli standard. G.mellonella è in grado di cancellare la forza iniziale alimentata carica batterica fino a quando nessun batterio non è rilevabile. Con i numeri di copia genica 16s sia di B.vulgatus che di E.coli diminuirono sostanzialmente entro 24 ore.Commensal somministrava una larva di G.mellonella inducendo l'espressione genica dell'RNA di vari geni marcatori immunitari innati. Ad esempio, le molecole di riconoscimento LPS, l'apolipophorina e l'emolina sono generalmente espresse più altamente nelle larve somministrate dall'E.coli rispetto alle larve somministrate da B.vulgatus. Inoltre, la produzione di specie reattive di ossigeno e azoto è fortemente elevata rispetto all'alimentazione della forza E.coli rispetto al B.vulgatus, così come all'espressione genica GST antiossidante.Inoltre, l'espressione differenziale del peptide microbico è indotta più fortemente dopo la somministrazione di E.coli che in risposta all'alimentazione forzata di B.vulgatus. Ricorda di usare solo larve sane, bianche e in rapido movimento, per usare la pazienza durante l'alimentazione forzata per evitare di stressare le larve e includere tutti i controlli necessari. L'attivazione dei marcatori immunitari G.mellonella può essere determinata direttamente dai test di attività RUS o GST e l'abbondanza di ANP può essere determinata da test di inibizione della crescita batterica.Questa tecnica può essere utilizzata come strumento di screening per batteri commensali e patogeni e per esplorare simbiomi intestinali e pathobiomi senza sacrificare molti vertebrati. Utilizzare sempre i dispositivi di protezione individuale appropriati quando si lavora con azoto liquido, BCP o sostanze TRIzol.

a-galleria-mellonella-oral-administration-model-to-study-commensal

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Orale e infezioni intra haemocolic di larve della tarma della cera...

L&#39;insetto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Come un modello di infezione potente per Indagare Patogenesi batterica

La larva di tarma della cera Galleria mellonella è stato recentemente stabilito come un modello in vivo per studiare l'infezione da Legionella pneumophila. Qui, dimostriamo tecniche fondamentali per caratterizzare la patogenesi della Legionella nelle larve, tra cui l'inoculazione, la misurazione della virulenza batterica e la replica così come l'estrazione e l'analisi delle hemocytes infetti.

Uso di<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Come organismo modello per studiare<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infezione

Galleria mellonella serve come un modello di invertebrati marini per candidosi diffusa. Qui, abbiamo dettaglio l'infezione protocollo e fornire dati di supporto per l'efficacia del modello.

Il modello di infezione del Waxworm di Galleria mellonella per candidosi disseminata

Galleria mellonella è stata recentemente fondata come un modello di infezione riproducibile, economico ed eticamente accettabile per il complesso della tubercolosi Mycobacterium. Qui descriviamo e dimostriamo i passi compiuti per stabilire l'infezione di successo di G. mellonella con Mycobacterium bovis BCG lux bioluminescente.

Uso della mellonella Invertebrate Galleria come modello di infezione per studiare il complesso di tubercolosi Mycobacterium

Questo studio presenta un quadro standardizzato per l'ottimizzazione dei modelli di infezione da G. mellonella da utilizzare nella valutazione antimicrobica preclinica. L'applicazione di un modello di G. mellonella come parte di una pipeline di sviluppo antimicrobico preclinico potrebbe ridurre il numero di composti inefficaci che progrediscono verso gli studi clinici.

Galleria mellonella come modello di screening antimicrobico

Il virus respiratorio sinciziale umano (HRSV) può causare grave bronchiolite nei neonati. Parte della patogenesi della malattia grave da HRSV è causata dalla risposta immunitaria dell'ospite. La stimolazione delle cellule immunitarie umane primarie con HRSV fornisce un sistema modello rapido e riproducibile per studiare l'attivazione delle vie infiammatorie e delle infezioni.

Un modello in vitro per studiare le risposte immunitarie delle cellule mononucleate del sangue periferico umano all'infezione da virus respiratorio sinciziale umano

In questo protocollo, descriviamo metodi per trasfettare in modo efficiente linee cellulari di macrofagi murini con siRNA utilizzando il sistema navetta a 96 pozzetti Amaxa Nucleofector, stimolare i macrofagi con lipopolisaccaride e monitorare gli effetti sulla produzione di citochine infiammatorie.

Usando RNA-interferenza per Indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi

Qui, presentiamo un protocollo per la generazione e l'imaging di un'infezione batterica localizzata nella vescicola otica del pesce zebra.

Imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di Zebrafish larvale<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infezione

La stimolazione del nervo vago ha dimostrato di avere una forte efficacia per ridurre l'infiammazione periferica. Qui, presentiamo un protocollo di stimolazione del nervo vago modificato che consente ulteriori esami dei meccanismi antinfiammatori colinergici in risposte infiammatorie limitate.

Aumento tempo di recupero e Diminuzione LPS Per studiare il nervo vago meccanismi di stimolazione in risposta infiammatoria limitati

Un approccio è descritto per la rilevazione in tempo reale della risposta immunitaria innata di ferite cutanee e Staphylococcus aureus infezione dei topi. Di confronto LysM-EGFP topi (che possiedono i neutrofili fluorescenti) con un LysM-EGFP incrociate topo immunodeficiente, abbiamo anticipato la nostra comprensione dell'infezione e lo sviluppo di approcci per combattere l'infezione.

Un modello di topo per valutare risposta immunitaria innata per infezione da Staphylococcus aureus

Scopri un modello di somministrazione orale con Galleria mellonella per studiare le risposte immunitarie innate. Questo protocollo consente di analizzare le interazioni batteriche senza esperienza pratica pregressa.

Un modello di amministrazione orale Galleria mellonella a risposte immunitarie Innate Study Commensal-Induced

Esplora altri video