Isolamento, propagazione e l'espressione della proteina del Prion durante il differenziamento di cellule staminali polpa dentaria umana

Il modo standard per ottenere una cellula staminali dalla polpa dentale è poco efficiente, e questo dipende da diverse variabili. Il nostro protocollo ha permesso di ottenere un isolamento riuscito delle cellule staminali dai denti trattati nel 90% dei casi. Ottenere un alto numero di cellule in poche settimane è il vantaggio principale.

Questo ci permette di usare la cellula in medicina rigenerativa e di creare una biobanca che fornisca ad altri scienziati questo utile strumento. La procedura per l'apertura del dente sarà eseguita dal Dr. Constantino Santacroce. Successivamente, il protocollo sarà mostrato da Stefano Martellucci, il dottorando del mio laboratorio, che è il primo autore dell'articolo.

Per iniziare, estrarre il terzo molare dal paziente, sciacquarlo rapidamente con PBS, mettere in una provetta da 15 millilitri con il mezzo e trasferirlo in laboratorio in meno di due ore. Sotto una cappa a rischio biologico, utilizzare una fresa per aprire il dente con una passata di taglio coronale, parallela e tangente, attraverso il tetto della camera della polpa. Con un piccolo escavatore, rimuovere delicatamente la polpa e posizionarla in una provetta.

Quindi, lavare con PBS tre volte e centrifugare a 2.500 volte g a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante. Risospendare il pellet nella soluzione di Hank e trasferire il campione in una piastra di Petri.

Rimuovere la soluzione di Hank centrifugando a 2.500 volte g a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, con un bisturi usa e getta, dividere la polpa in fette di circa un millimetro e aggiungere un millilitro di collagenasi di tipo IV. Quindi, centrifugare il campione a 2.500 volte g a temperatura ambiente per 10 minuti.

Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet nel mezzo. Coltura in un pallone T25 specifico per le cellule staminali a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Durante il periodo di incubazione, cambiare il mezzo di coltura ogni tre giorni.

Una volta che le cellule aderenti raggiungono la confluenza, aggiungere un millilitro di soluzione di tripside-EDTA alle cellule per staccarle e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre minuti. Successivamente, aggiungere quattro millilitri del mezzo di coltura in un rapporto uno-a-cinque per fermare l'azione della tripina e centrifugare la sospensione cellulare a 259 volte g per sei minuti. Rimuovere il supernatante.

Quindi, posizionare le cellule in un pallone T25 per propagarsi. Quindi, staccare le cellule con un millilitro di tripside-EDTA a 37 gradi Celsius per tre minuti. Centrifugare la sospensione cellulare a 259 volte g per sei minuti.

Rimuovere il supernatante e procedere al test delle cellule per l'analisi citofluorimetrica. Per eseguire la fase transitoria di silenziamento della proteina prione, prima coltura le cellule staminali della polpa dentale umana in piastre a sei porri con due millilitri del mezzo di coltura per 24 ore. Quindi, aggiungere 400 microlitri del piccolo mezzo RNA PrP interferente per ogni campione e incubarli a 37 gradi Celsius per sei ore.

Senza scartare il mezzo SiRNA PrP, aggiungere 1,6 millilitri del mezzo di coltura in un rapporto uno-cinque e lasciare le cellule a 37 gradi Celsius per 72 ore. Dopo il periodo di incubazione, rimuovere il supernatante e lavare le cellule con due millilitri di PBS tre volte a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere due millilitri del mezzo di coltura neuronale e mantenere le cellule per sette-14 giorni in un'incubatrice a 37 gradi Celsius.

Dopo il periodo di incubazione, lavare le cellule con due millilitri di PBS tre volte a temperatura ambiente e procedere all'analisi western della macchia per testare gli antigeni superficiali neuronali. Per eseguire il processo di induzione neuronale, coltura 2 milioni di cellule staminali della polpa dentale umana in piastre a sei pozzi, fino a 28 giorni dalla separazione della polpa. Ogni tre giorni, scarta il supernatante.

Lavare tre volte con due millilitri di PBS a temperatura ambiente e sostituire due millilitri del mezzo di coltura neuronale. Dopo sette o 14 giorni, staccare le cellule con un millilitro di tripside-EDTA a 37 gradi Celsius per tre minuti. Quindi, aggiungere quattro millilitri del mezzo di coltura in un rapporto uno-a-cinque per interrompere l'azione della tripina.

Per caratterizzare le cellule staminali della polpa dentale umana per citometria a flusso, coltura 2 milioni per millilitro delle cellule in piastre a sei pozzi con due millilitri del mezzo di coltura. A 28 giorni di separazione post-dentale della polpa o dopo altri 14 giorni con mezzo di coltura neuronale, aggiungere un millilitro della tripside-EDTA a 37 gradi Celsius per tre minuti per staccare le cellule. Quindi, aggiungere quattro millilitri del mezzo di coltura in un rapporto uno-a-cinque per fermare l'azione della tripina e centrifugare a 259 volte g a temperatura ambiente per sei minuti.

Fissare le cellule non trattate o trattate con 300 microlitri di paraformaldeide al 4% in PBS a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, centrifugare, scartare il supernatante e permeabilizzare le cellule con un tensioattiva non ionico all'1% in PBS a temperatura ambiente per altri 10 minuti. Quindi, centrifugare di nuovo, scartare il supernatante ed eseguire il blocco con il 5% di latte essiccato non grasso in un millilitri di PBS a temperatura ambiente per un'ora.

Lavare tre volte con un millilitro di PBS e incubare le cellule con anticorpi monoclonali anti-CD105, anti-CD44, anti-STRO-1, anti-CD90, anti-CD73, anti-beta-tre-tubulina, anti-NFH e anti-GAP43 a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, centrifugare nuovamente le cellule tre volte consecutive con un millilitro di PBS a intervalli di sei minuti, quindi incubare con anticorpi monoclonali CY5 anti-topo o anti-coniglio CY5 a temperatura ambiente per un'ora aggiuntiva. Utilizzare gli anticorpi secondari per gating le cellule immuno-positive e analizzare tutti i campioni con un citometro a flusso.

Coltura 2 milioni di cellule per millilitro delle cellule staminali della polpa dentale umana in piastre a sei pozzi con due millilitri del mezzo di coltura. A 21 e 28 giorni dopo la separazione della polpa dentale o dopo altri sette-14 giorni con il mezzo di coltura neuronale, aggiungere un millilitro della tripside-EDTA a 37 gradi Celsius per tre minuti per staccare le cellule. Quindi, centrifugare, scartare il supernatante, quindi fissare i campioni con paraformaldeide al 4% in PBS a quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi, centrifugare, scartare il supernatante e quindi permeabilizzare con un tensioattiva non ionico all'1% in PBS a temperatura ambiente per 10 minuti. Rimuovere il supernatante e macchiare le cellule con anticorpo monoclonale anti-PrP del coniglio a temperatura ambiente per un'ora. Infine, centrifugare, scartare il supernatante, quindi incubare con anticorpo monoclonale CY5 anti-coniglio a temperatura ambiente per un'ora aggiuntiva.

Analizzare tutti i campioni con un citometro a flusso. Dopo la separazione della polpa, gruppi di cellule staminali della polpa dentale umana sono stati espansi alla periferia. Un confronto tra la crescita di queste cellule prima e dopo la differenziazione neuronale indotta da EGF/bFGF ha mostrato cambiamenti significativi nella morfologia cellulare e nella crescita dei neuriti.

Le cellule staminali della polpa dentale umana non trattate espressero antigeni superficiali specifici stromali mesenchimali multipotenti, come CD44, CD90, CD105, CD73 e STRO-1. Dopo opportuni stimoli di induzione neuronale, queste cellule hanno espresso marcatori neuronali specifici, come beta-tre-tubulina, NFH e GAP43. Le cellule non trattate o trattate non esprimevano marcatori ematopoietici, come CD14 e CD19.

Dopo 28 giorni, la proteina prione è stata espressa precocemente nelle cellule staminali della polpa dentale umana rispetto al corrispondente controllo negativo, e la sua espressione è stata aumentata dopo il processo di differenziazione neuronale indotto da EGF / bFGF. L'analisi western blot ha mostrato che silenziare la proteina prione per sRNA prima degli stimoli EGF/bFGF potrebbe influenzare il processo di differenziazione neuronale delle cellule staminali della polpa dentale umana impedendo l'espressione di marcatori neuronali beta-tre-tubulina e NHF. La cosa più importante è la scelta dell'enzima per separare le cellule dalla polpa.

Infatti, se l'enzima è troppo aggressivo, le cellule potrebbero essere danneggiate e la loro capacità di crescita e differenziazione potrebbe essere compromessa. Le cellule staminali della polpa dentale sono un eccellente modello sperimentale che può essere utilizzato in vivo e studi in vitro nel campo della medicina rigenerativa. Poiché il PrP svolge un ruolo chiave nel processo di differenziazione neuronale delle cellule staminali della polpa dentale, questo marcatore può essere un candidato eccellente come bersaglio efficace nelle malattie neurodegenerative.

L'aspetto più importante da consigliare è la condizione di salute dei pazienti, come l'assenza di malattie infettive.