Name: Isolamento, propagazione e lespressione della proteina del Prion durante il differenziamento di cellule staminali polpa dentaria umana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Scopri l'isolamento e la propagazione di cellule staminali della polpa dentaria umana con un tasso di successo del 90%. Questo metodo valuta l'espressione della proteina prionica durante il differenziamento neuronale per applicazioni in medicina rigenerativa.

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Questo lavoro è stato supportato da "Fondazione Varrone" e Hub di Università di Rieti "Sabina Universitas" a Vincenzo Mattei.
Figura 5 (A, B) ristampato con il permesso dell'editore Taylor & Francis Ltd da: complesso multimolecolare di ruolo del Prion protein-EGFR durante il differenziamento neuronale della polpa dentale umane cellule staminali. Martellucci, S., Manganelli V., C. Santacroce, F. Santilli, L. Piccoli, M. Sorice, V. Mattei Prion. 2018 Mar 4. Taylor & Francis Ltd.

Terzi molari utilizzati nello studio sono stati asportati dai pazienti (13-19 anni) con senza precedenti di droga o alcol, tutte per non fumatori e con una adeguata igiene orale. Il giorno della spiegazione, presso il dipartimento di scienza odontoiatria e maxillo-facciale dell'Università "Sapienza" di Roma, il consenso informato è stato ottenuto da pazienti o i genitori. Il consenso informato è stato ottenuto basato su considerazioni etiche e approvazione del comitato etico.
1. dente ed estrazione della polpa dentale
<ol><li>
Preparazione del mezzo appropriato per la conservazione o il trasporto.
	<ol>
<li>Preparare medio bassa concentrazione per volta dell'Aquila di Dulbecco di glucosio (DMEM-L) con L-Glutammina (494,5 mL).</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di penicillina/streptomicina (1%) e 0,5 mL di amfotericina (0,1%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estrarre il terzo molare dal paziente, rapidamente sciacquare con PBS, messo in una provetta da 15 mL con il mezzo e trasferirlo al laboratorio in meno di 2 ore.</li>
	<li>Sotto una cappa biohazard, aprire il dente con una fresa di passata di taglio coronale parallelo e tangente attraverso il tetto della camera pulpare.</li>
	<li>Rimuovere la polpa con un piccolo escavatore delicatamente e metterlo in una provetta.</li>
	<li>Lavare le tre volte con PBS e centrifugare a 2.500 x g per 10 minuti a TA.</li>
</ol>2. trattamento della polpa dentale e rilascio di cellule staminali
<ol><li>Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in soluzione di Hank e metterlo in una capsula di Petri. Incubare per 2 ore a 37 ° C in 5% CO2.</li>
	<li>
Digitare preparazione soluzione della collagenosi di IV.
	<ol>
<li>Preparare 0,8 mL di DMEM-L.</li>
		<li>Sciogliere 1 mg di collagenosi di IV tipo in 0,8 mL di DMEM-L e vortexare per diversi minuti.</li>
		<li>Aggiungere DMEM-L fino a 1 mL per avere una concentrazione finale di 1 mg/mL.</li>
		<li>Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 µM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di Hank mediante centrifugazione a 2.500 x g per 10 min a RT e dividere la polpa in fettine di circa 1 mm ciascuno con un bisturi monouso.</li>
	<li>Mettere le fettine di polpa in una capsula di Petri e incubare con 1 mL di collagenasi di tipo IV per 15 min a 37 ° C in 5% CO2.</li>
	<li>
Preparazione di coltura media (500 mL).
	<ol>
<li>A 445 mL di DMEM-L con L-glutammina.</li>
		<li>Aggiungere 50 mL di siero bovino fetale (FBS) (10%).</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di penicillina/streptomicina (1%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugare il campione a 2.500 x g per 10 min a RT, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in mezzo (punto 2.5) e cultura nella beuta T25 specifico di cellule staminali a 37 ° C in 5% CO2.</li>
</ol>3. propagazione e coltura della cellula formativa di
<ol><li>Ogni giorno controllare la cultura e, dopo 3 giorni di crescita, osservare diversi cloni di cellule aderenti all'interno della beuta.</li>
	<li>Ogni 3 giorni cambiare il terreno di coltura.</li>
	<li>Tra 7 e 12 giorni, una volta che le celle aderenti hanno portata confluenza, staccarli trattando le cellule con 1 mL di tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C o delicatamente utilizzando un raschietto di cella.</li>
	<li>Aggiungere 4 ml (rapporto 1:5) nel terreno di coltura (punto 2.5) per interrompere l'azione della tripsina.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare per 6 min a 259 x g, rimuovere il supernatante e inserire le celle in una boccetta di T25 di propagare. Nota: Ogni 3 giorni le cellule raggiungono la confluenza.</li>
	<li>Propagare le cellule fino a 21 o 28 giorni (circa 6-8 passaggi) per evitare la presenza di non-staminali come le cellule nella cultura.</li>
	<li>Staccare le cellule con 1 mL di tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C o raschiare delicatamente. Centrifugare la sospensione cellulare per 6 min a 259 x g.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e testare le cellule per analisi citofluorimetrica (passaggio 6).</li>
</ol>4. transitoria PrPC tacitazione di siRNA
<ol><li>Coltura del hDPSCsin 6 pozzetti (2 x 105 cellule/mL) con 2 mL di terreno di coltura (punto 2.5) per 24 h.</li>
	<li>
Il giorno dopo, preparare siRNA PrP medie (400 µ l).
	<ol>
<li>In una provetta sterile, µ l 384 DMEM-L.</li>
		<li>Aggiungere 1 µ l per ogni tipo di siRNA PrP in DMEM-L per avere una concentrazione finale di 5 nM (4 siRNA PrP sono stati utilizzati e verificati dal fornitore per garantire un atterramento efficienza ≥ 70%).</li>
		<li>Aggiungere 12 µ l di transfectionreagent in DMEM-L.</li>
		<li>Vortice la miscela e incubare per 10 min a RT per consentire la formazione di complessi di transfezione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 400 μL di siRNA PrP medio per ogni campione e incubare per 6 h a 37 ° C.</li>
	<li>Senza scartare siRNA PrP medio, aggiungere 1,6 mL (rapporto di 1 a 5) di terreno di coltura (punto 2.5).</li>
	<li>Lasciare le cellule per 72 h a 37 ° C.</li>
	<li>Eliminare il surnatante e lavare 3 volte con 2 mL di PBS a TA.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di terreno di coltura neuronale per 7 o 14 giorni (punto 5.1).</li>
	<li>Cambiare il terreno di coltura neuronale ogni 3 giorni. Nota: Sostituire il siRNA PrP soluzione sostituire ogni volta il terreno di coltura neuronale.</li>
	<li>Alla fine del tempo, lavare 3 volte con 2 mL di PBS a RT e test per gli antigeni di superficie neuronali mediante analisi Western Blot.</li>
</ol>5. un neurone processo di induzione di hDPSCs
<ol><li>
Preparazione del terreno di coltura neuronale (500 mL).
	<ol>
<li>Preparare 444,7 mL di media basale formulato di cellule neuronali.</li>
		<li>Sul supporto di aggiungere 50 mL di supplemento privo di siero utilizzato per sostenere la redditività a lungo termine delle cellule staminali embrionali ed adulte neuronale (10%).</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) (concentrazione finale 40 ng/mL) e 100 µ l di fattore di crescita epidermico (EGF) al mezzo (concentrazione finale 20 ng/mL).</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di penicillina/streptomicina (1%) al mezzo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultura hDPSCs in piastre da 6 pozzetti (2 x 105 cellule/mL) fino a 28 giorni dalla separazione della polpa e stimolarli con 2 mL di terreno di coltura neuronale.</li>
	<li>Ogni 3 giorni scartare il surnatante, lavare 3 volte con 2 mL di PBS a RT e sostituire 2 mL di terreno di coltura neuronale.</li>
	<li>Dopo 7 o 14 giorni, staccare le cellule con 1 mL di tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C o delicatamente con un raschietto.</li>
	<li>Aggiungere 4 mL (rapporto 1:5) del terreno di coltura (punto 2.5) per interrompere l'azione della tripsina.</li>
	<li>Verificare la presenza di antigeni di superficie neuronali (passaggio 6) o l'espressione della proteina prionica (passaggio 7) analisi di citometria a flusso.</li>
</ol>6. caratterizzazione di hDPSCs tramite flusso Cytometry
<ol><li>Selezionare stromali mesenchimali (MSC)-neuronali o specifici antigeni di superficie.</li>
	<li>Cultura hDPSCs in piastre da 6 pozzetti (2 x 105 cellule/mL) con 2 mL di terreno di coltura (punto 2.5).</li>
	<li>Staccare hDPSCs a 28 giorni dalla separazione della polpa dentale o dopo 14 giorni di un neurone di coltura (passaggio 5.1) con 1 mL di tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C o delicatamente un raschietto.</li>
	<li>aggiungere 4 ml (rapporto 1:5) del terreno di coltura (punto 2.5) per interrompere l'azione della tripsina e centrifugato a 259 x g per 6 minuti a TA. altro lavare 2 volte con 2 mL di PBS a TA.</li>
	<li>Difficoltà il hDPSCs non trattata o trattata con paraformaldeide al 4% in PBS per 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Permeabilize hDPSCS con tensioattivi non ionici 0.1% (v/v) in PBS per altri 10 min a TA.</li>
	<li>Eseguire il blocco con 5% latte scremato in polvere in 1 mL di PBS per 1 h a TA.</li>
	<li>Lavare 3 volte con 1 mL di PBS e incubare le cellule con anti-CD105 (1: 100 / 5 x 105 cellule), anti-CD44 (1: 100 / 5 x 105 cellule), anti-STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 cellule), anti-CD90 (1: 100 / 5 x 105 cellule), anti-CD73 (1: 100 / 5 x 105 cellule), anti β3-tubulina (1: 100 / 5 x 105 cellule), anti-NFH (1: 100 / 5 x 105 cellule) e anti-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 cellule) mAb per 1 h a TA.</li>
	<li>Lavare le cellule 3 volte con 1 mL di PBS e incubare con PE anti-topo (01:50 / 5 x 105 cellule) o anti-coniglio CY5 mAb (01:50 / 5 x 105 celle) per ulteriore 1 h a TA.</li>
	<li>Utilizzare gli anticorpi secondari per gating le cellule immunopositive (anti-topo PE o anti-coniglio CY5 mAb) e analizzare tutti i campioni con un citometro a flusso e acquisire almeno 20.000 eventi.</li>
</ol>7. valutazione dell'espressione di PrPC in hDPSCs di analisi di citometria a flusso
<ol><li>Cultura la hDPSCsin 6 pozzetti (2 x 105 cellule/mL) con 2 mL di terreno di coltura (punto 2.5).</li>
	<li>Staccare hDPSCs alle 21 e 28 giorni dalla separazione della polpa dentale e dopo 7 o 14 giorni con terreno di coltura neuronale (azione 5.1) con 1 mL di tripsina-EDTA e fermare l'azione di tripsina, come descritto al punto 6.4. Difficoltà gli esemplari con paraformaldeide al 4% in PBS per 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Permeabilize con 0.1% (v/v) non ionici surfactantin PBS per 10 min a RT. rimuovere il surnatante e macchia le celle con coniglio anti-PrP mAb EP1802Y (01:50 / 5 x 105 celle) mAb per 1h a RT. Incubare con anti-coniglio CY5 (01:50 / 5 x 105 celle) mAb per ulteriore 1 h a TA.</li>
	<li>Analizzare tutti i campioni con un citometro a flusso e acquisire almeno 20.000 eventi.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo lavoro, ci siamo concentrati sulla metodologia per l'isolamento e la differenziazione di un neurone di hDPSCs; Inoltre, abbiamo valutato il ruolo di PrPC in questo processo. Esistono diversi metodi per isolare e differenziare hDPSCs nel neurone-come le cellule e passaggi critici durante il processo. hDPSCs sono in grado di differenziare in diversi lignaggi quali condroblasti, adipociti, osteoblasti e neuroni. Nella nostra carta, abbiamo studiato i meccanismi di differenziamento neuronale e la presenz...

Cellule staminali mesenchimali sono state isolate da diversi tessuti, compreso il midollo osseo, sangue del cordone ombelicale, polpa dentaria umana, tessuto adiposo e sangue1,2,3,4,5 , 6. come riportato da diversi autori, hDPSCs Visualizza plastica aderenza, una tipica morfologia di fibroblasto-come. Questi rappresentano una popolazione altamente eterogenea con cloni distinti e le differenze nella capacità proliferativa e differenziante7,8. hDPSCs express markers specifici per le cellule staminali mesenchimali (cioè CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), esse sono negativi per alcuni marcatori ematopoietici (quali CD14 e CD19) e sono capaci di differenziazione in vitro di multilineage9, 10,11.
Diversi autori hanno dimostrato che queste cellule sono in grado di differenziarsi in cellule del neurone-come utilizzando protocolli diversi, che includono l'aggiunta di NGF, bFGF, EGF in combinazione con la specifica media e integratori7,12. Inoltre, molte proteine sono coinvolti durante il processo di differenziamento neuronale e, tra queste, parecchie carte mostrano un ruolo rilevante e significativa espressione della proteina prionica cellulare PrP (C), sia in cellule staminali embrionali ed adulte13, 14. PrPC rappresenta una molecola pleiotropica capace di svolgere diverse funzioni all'interno delle cellule come metabolismo del rame, apoptosi, e resistenza a ossidativo stress15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
Nel nostro precedente carta23, abbiamo studiato il ruolo della PrPC nel processo di differenziazione di un neurone di hDPSCs. Infatti, hDPSCs express precocemente PrPC e, dopo il differenziamento neuronale, è stato possibile osservare un aumento supplementare. Altri autori hanno supposto un ruolo possibile di PrPC nei processi di differenziamento delle cellule staminali. Infatti, PrPC spinge la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane in neuroni, oligodendrociti e astrociti24. Lo scopo di questo studio era quello di sottolineare la metodologia per ottenere cellule staminali da polpa dentaria, il processo di differenziazione e il ruolo di PrPC durante il differenziamento neuronale.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di amfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>Viene utilizzato per integrare i terreni di coltura cellulare, è un antibiotico antimicotico polienico della</td></tr><tr>tecnologia di segnalazione cellulare<td>anti-B3tubulina</td> di Streptomyce<td>&nbsp;</td><td>#4466</td><td>Una delle sei isoforme della B-tubulina, è altamente espressa durante lo sviluppo fetale e postnatale, rimanendo alta nel sistema nervoso periferico</td></tr><tr><td>Anti-CD105&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>611314</td><td>Endoglin (CD105), una delle principali glicoproteine dell'endotelio vascolare umano, è una proteina integrale di membrana di tipo I con una grande regione extracellulare, una regione transmembrana idrofobica e una coda citoplasmatica corta</td></tr><tr><td>Anti-CD44</td><td>Millipore</td><td>CBL154-20ul</td><td>Anticorpi marcatori cellulari positivi diretti contro le cellule staminali mesenchimali</td></tr><tr><td>Anti-CD73&nbsp;</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare&nbsp;</td><td>13160</td><td>CD73 è una glicoproteina legata alla membrana ancorata al glicosil fosfatidilinositolo da 70 kDa che catalizza l'idrolisi dei monofosfati nucleosidici extracellulari in nucleosidi bioattivi</td></tr><tr><td>Anti-CD90</td><td>Millipore</td><td>CBL415-20ul</td><td>Anticorpi marcatori cellulari positivi diretti contro le cellule staminali mesenchimali</td></tr><tr><td>Anti-GAP43&nbsp;</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare&nbsp;</td><td>#8945</td><td>È una proteina specifica del sistema nervoso, associata alla crescita nei coni di crescita e nelle aree ad alta plasticità</td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab7003</td><td>è un anticorpo utilizzato nella citometria a flusso o nell'analisi FACS</td></tr><tr><td>Anti-NFH&nbsp;</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare&nbsp;</td><td>#2836</td><td>È un anticorpo che rileva i livelli endogeni della proteina totale Neurofilamento-H</td></tr><tr><td>Anti-PrP mAb EP1802Y&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab52604</td><td>Coniglio monoclonale [EP 1802Y] a proteina prionica PrP</td></tr><tr><td>Anti-coniglio CY5&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6564</td><td>è un anticorpo utilizzato nella citometria a flusso o nell'analisi FACS</td></tr><tr><td>Anti-STRO 1</td><td>Millipore</td><td>MAB4315-20ul</td><td>Anticorpi marcatori cellulari positivi diretti contro le cellule staminali mesenchimali</td></tr><tr><td>B27 Supp XF CTS</td><td>Gibco di life technologies</td><td>A14867-01</td><td>B-27&nbsp; può essere utilizzato per supportare l'induzione di cellule staminali neurali umane (hNSC) da cellule staminali pluripotenti (PSC), l'espansione di hNSC, differenziazione delle hNSCs e mantenimento di neuroni differenziati maturi in coltura</td></tr><tr><td>Citometro a flusso BD Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td>AC6531180187</td><td>Citometro a flusso dotato di un laser blu (488 nm) e di un laser rosso (640 nm)</td></tr><tr><td>Software BD Accuri C6.</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Controlla il sistema di citometro a flusso BD Accuri C6 al fine di acquisire dati, generare statistiche e analizzare i risultati</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>PeproThec, DBA</td><td>100-18B</td><td>Fattore di crescita dei fibroblasti di base</td></tr><tr><td>Centrifuga CL30R</td><td>Termo fisher Scientific</td><td>11210908</td><td>è un dispositivo che viene utilizzato per la separazione di fluidi, gas o liquidi, a base di densità</td></tr><tr><td>CO2 Incubatore 3541</td><td>Termo fisher Scientific</td><td>317527-185</td><td>assicura condizioni di crescita ottimali e riproducibili per colture cellulari</td></tr><tr><td>Collagenasi, tipo IV&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>Collagenase è una proteasi che scinde il legame tra un amminoacido neutro (X) e la glicina nella sequenza Pro-X-Glyc-Pro, che si trova con alta frequenza nel collagene</td></tr><tr><td>Bisturi usa e getta</td><td>Swann-Morton</td><td>501</td><td>Viene utilizzato per tagliare i tessuti</td></tr><tr><td>DMEM-L</td><td>Euroclone</td><td>ECM0060L</td><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose con L-Glutammina con Sodium Pyruvato</td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproThec, DBA</td><td>AF-100-15</td><td>Epidermal Growth Factor&nbsp;</td></tr><tr><td>Il siero fetale bovino</td><td>Gibco di life technologies</td><td>10270-106</td><td>FBS è un popolare integratore multimediale perché fornisce un'ampia gamma di funzioni nella coltura cellulare. FBS fornisce nutrienti, fattori di crescita e di attaccamento e protegge le cellule dal danno ossidativo e dall'apoptosi grazie a meccanismi difficili da riprodurre nei sistemi di terreni privi di siero (SFM)</td></tr><tr><td>Filtropur BT50 0,2.500 mL Filtro per flaconi</td><td>Sarstedt</td><td>831.823.101</td><td>è un dispositivo che viene utilizzato per la filtrazione di soluzioni</td></tr><tr><td>Flexitube GeneSolution per PRNP</td><td>Qiagen</td><td>GS5621</td><td>4 siRNA per il gene Entrez 5621. Sequenza target N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA&nbsp; N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA&nbsp; N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA&nbsp; N.4&nbsp; La</td></tr><tr><td>soluzione di Hank 1x</td><td>Gibco by life technologies</td><td>240200083</td><td>La funzione essenziale di Hanks&prime; La soluzione salina bilanciata serve a mantenere il pH e l'equilibrio osmotico. Fornisce inoltre acqua e ioni inorganici essenziali alle cellule</td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione HiPerFect&nbsp;</td>Il <td></td><td>reagente di trasfezione HiPerFect di Qiagen 301705 è una miscela unica di lipidi cationici e neutri che consente un efficace assorbimento di siRNA e un rilascio efficiente di siRNA all'interno delle cellule, con conseguente elevato knockdown genico anche quando si utilizzano basse concentrazioni di siRNA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco by life technologies</td><td>10888022</td><td>Neurobasal-A Medium è un terreno basale progettato per il mantenimento e la maturazione a lungo termine di neuroni cerebrali puri post-natali e adulti.</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>La paraformaldeide è stata utilizzata per il fissaggio di cellule e sezioni di tessuto durante le procedure di colorazione</td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina&nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D&nbsp;</td><td>Viene utilizzato per integrare i terreni di coltura cellulare per controllare la contaminazione batterica</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato&nbsp; (PBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004LX10&nbsp;</td><td>Il PBS è una soluzione salina bilanciata utilizzata per la manipolazione e la coltura di cellule di mammifero. La PBS è usata per irrigare, lavare e diluire le cellule dei mammiferi. Il tampone fosfato mantiene il pH nell'intervallo fisiologico</td></tr><tr><td>TC-Platte 6 pozzetto, Cell+,F</td><td>Sarstedt</td><td>833,920,300</td><td>È una superficie di crescita per cellule aderenti</td></tr><tr><td>Pallone per colture tissutali T-25,Cell+,Tappo ventilato</td><td>Sarstedt</td><td>833,910,302</td><td>Pallone per colture tissutali T-25, polistirene, superficie di crescita Cell+ per cellule aderenti sensibili, ad es. cellule primarie, collo inclinato, cappuccio di ventilazione, giallo, sterile, apirogeno, non citotossico, 10 pz./borsa</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Tensioattivo non ionico ampiamente usato per il recupero di componenti di membrana in condizioni lievi non denaturanti</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB3052D&nbsp;</td><td>La tripsina scinde i peptidi sul lato C-terminale dei residui di aminoacidi di lisina e arginina. La tripsina viene utilizzata per rimuovere le cellule aderenti da una superficie di coltura</td></tr><tr><td>Provetta</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td>Provetta 15 mL, 120 mm x17 mm, PP</td></tr><tr><td>VBH 36 C2 Compact</td><td>Steril</td><td>ST-003009000</td><td>Offre una protezione totale per l'ambiente e il lavoratore</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 Invertito&nbsp; Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>3849000962</td><td>ZEISS Axio Vert.A1 offre un prezzo base unico e può fornire tutte le tecniche di contrasto, tra cui campo chiaro, contrasto di fase, PlasDIC, VAREL, contrasto di modulazione Hoffman migliorato (iHMC), DIC e fluorescenza. Incorpora l'illuminazione a LED per un imaging delicato per le cellule marcate in fluorescenza. Axio Vert.A1 è progettato ergonomicamente per il lavoro di routine e abbastanza compatto da poter essere posizionato all'interno di cappe per colture tissutali.</td></tr></tbody></table>

isolamento, propagazione e l'espressione della proteina del prion durante il differenziamento di cellule staminali polpa dentaria umana

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Questioni bioetiche relazionati alla manipolazione delle cellule staminali embrionali hanno ostacolato i progressi nel campo della ricerca medica. Per questo motivo, è molto importante ottenere cellule staminali adulte da diversi tessuti quali adiposo, cordone ombelicale, midollo osseo e del sangue. Tra le possibili fonti, polpa dentale è particolarmente interessante perché è facile da ottenere per quanto riguarda considerazioni bioetiche. Infatti, le cellule staminali dentarie polpa umana (hDPSCs) sono un tipo di cellule staminali adulte in grado di differenziare in cellule di un neurone-come e può essere ottenuta dal terzo molare di pazienti sani (età 13-19). In particolare, la polpa dentale è stato rimosso con un escavatore, tagliata a fette piccole, trattata con collagenasi IV e coltivata in un matraccio da. Per indurre il differenziamento neuronale, hDPSCs sono stati stimolati con EGF/bFGF per 2 settimane. Precedentemente, abbiamo dimostrato che durante il processo di differenziazione il contenuto cellulare prion proteina (PrPC) in hDPSCs aumentato. L'analisi citofluorimetrica ha mostrato un'espressione precoce di PrPC che aumentato dopo il processo di differenziamento neuronale. Ablazione di PrPC di siRNA PrP ha impedito il differenziamento neuronale indotta da EGF/bFGF. In questa carta, illustriamo come abbiamo migliorato l'isolamento, separazione e metodi di coltivazione in vitro di hDPSCs con diverse procedure di facile, più efficienti cloni a cellula sono stato ottenuto e su larga scala l'espansione delle cellule staminali mesenchimali (MSCs) è stato osservato. Indichiamo anche come hDPSCs, ottenuti con metodi dettagliati nel protocollo, sono un eccellente modello sperimentale per studiare il processo di differenziamento di cellule staminali mesenchimali e successivi processi cellulari e molecolari.

Le procedure di isolamento e la separazione di hDPSCs da polpa dentaria, ottenuta dal terzo molare, sono processi complessi, in cui piccoli cambiamenti possono portare un risultato rovinoso. In questa carta, utilizziamo il protocollo di Arthur et al.. 12 con molti nuovi miglioramenti. Uno schema rappresentativo delle procedure è illustrato nella Figura 1.
hDPSCs rapp...

Qui presentiamo un protocollo per isolamento umano Dental Pulp Stem Cells e propagazione al fine di valutare l'espressione della proteina del prion durante il processo di differenziamento neuronale.

Isolamento, propagazione e l'espressione della proteina del Prion durante il differenziamento di cellule staminali polpa dentaria umana

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

Il modo standard per ottenere una cellula staminali dalla polpa dentale è poco efficiente, e questo dipende da diverse variabili. Il nostro protocollo ha permesso di ottenere un isolamento riuscito delle cellule staminali dai denti trattati nel 90% dei casi. Ottenere un alto numero di cellule in poche settimane è il vantaggio principale.Questo ci permette di usare la cellula in medicina rigenerativa e di creare una biobanca che fornisca ad altri scienziati questo utile strumento. La procedura per l'apertura del dente sarà eseguita dal Dr. Constantino Santacroce. Successivamente, il protocollo sarà mostrato da Stefano Martellucci, il dottorando del mio laboratorio, che è il primo autore dell'articolo.Per iniziare, estrarre il terzo molare dal paziente, sciacquarlo rapidamente con PBS, mettere in una provetta da 15 millilitri con il mezzo e trasferirlo in laboratorio in meno di due ore. Sotto una cappa a rischio biologico, utilizzare una fresa per aprire il dente con una passata di taglio coronale, parallela e tangente, attraverso il tetto della camera della polpa. Con un piccolo escavatore, rimuovere delicatamente la polpa e posizionarla in una provetta.Quindi, lavare con PBS tre volte e centrifugare a 2.500 volte g a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante. Risospendare il pellet nella soluzione di Hank e trasferire il campione in una piastra di Petri.Rimuovere la soluzione di Hank centrifugando a 2.500 volte g a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, con un bisturi usa e getta, dividere la polpa in fette di circa un millimetro e aggiungere un millilitro di collagenasi di tipo IV. Quindi, centrifugare il campione a 2.500 volte g a temperatura ambiente per 10 minuti.Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet nel mezzo. Coltura in un pallone T25 specifico per le cellule staminali a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Durante il periodo di incubazione, cambiare il mezzo di coltura ogni tre giorni.Una volta che le cellule aderenti raggiungono la confluenza, aggiungere un millilitro di soluzione di tripside-EDTA alle cellule per staccarle e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre minuti. Successivamente, aggiungere quattro millilitri del mezzo di coltura in un rapporto uno-a-cinque per fermare l'azione della tripina e centrifugare la sospensione cellulare a 259 volte g per sei minuti. Rimuovere il supernatante.Quindi, posizionare le cellule in un pallone T25 per propagarsi. Quindi, staccare le cellule con un millilitro di tripside-EDTA a 37 gradi Celsius per tre minuti. Centrifugare la sospensione cellulare a 259 volte g per sei minuti.Rimuovere il supernatante e procedere al test delle cellule per l'analisi citofluorimetrica. Per eseguire la fase transitoria di silenziamento della proteina prione, prima coltura le cellule staminali della polpa dentale umana in piastre a sei porri con due millilitri del mezzo di coltura per 24 ore. Quindi, aggiungere 400 microlitri del piccolo mezzo RNA PrP interferente per ogni campione e incubarli a 37 gradi Celsius per sei ore.Senza scartare il mezzo SiRNA PrP, aggiungere 1,6 millilitri del mezzo di coltura in un rapporto uno-cinque e lasciare le cellule a 37 gradi Celsius per 72 ore. Dopo il periodo di incubazione, rimuovere il supernatante e lavare le cellule con due millilitri di PBS tre volte a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere due millilitri del mezzo di coltura neuronale e mantenere le cellule per sette-14 giorni in un'incubatrice a 37 gradi Celsius.Dopo il periodo di incubazione, lavare le cellule con due millilitri di PBS tre volte a temperatura ambiente e procedere all'analisi western della macchia per testare gli antigeni superficiali neuronali. Per eseguire il processo di induzione neuronale, coltura 2 milioni di cellule staminali della polpa dentale umana in piastre a sei pozzi, fino a 28 giorni dalla separazione della polpa. Ogni tre giorni, scarta il supernatante.Lavare tre volte con due millilitri di PBS a temperatura ambiente e sostituire due millilitri del mezzo di coltura neuronale. Dopo sette o 14 giorni, staccare le cellule con un millilitro di tripside-EDTA a 37 gradi Celsius per tre minuti. Quindi, aggiungere quattro millilitri del mezzo di coltura in un rapporto uno-a-cinque per interrompere l'azione della tripina.Per caratterizzare le cellule staminali della polpa dentale umana per citometria a flusso, coltura 2 milioni per millilitro delle cellule in piastre a sei pozzi con due millilitri del mezzo di coltura. A 28 giorni di separazione post-dentale della polpa o dopo altri 14 giorni con mezzo di coltura neuronale, aggiungere un millilitro della tripside-EDTA a 37 gradi Celsius per tre minuti per staccare le cellule. Quindi, aggiungere quattro millilitri del mezzo di coltura in un rapporto uno-a-cinque per fermare l'azione della tripina e centrifugare a 259 volte g a temperatura ambiente per sei minuti.Fissare le cellule non trattate o trattate con 300 microlitri di paraformaldeide al 4% in PBS a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, centrifugare, scartare il supernatante e permeabilizzare le cellule con un tensioattiva non ionico all'1% in PBS a temperatura ambiente per altri 10 minuti. Quindi, centrifugare di nuovo, scartare il supernatante ed eseguire il blocco con il 5% di latte essiccato non grasso in un millilitri di PBS a temperatura ambiente per un'ora.Lavare tre volte con un millilitro di PBS e incubare le cellule con anticorpi monoclonali anti-CD105, anti-CD44, anti-STRO-1, anti-CD90, anti-CD73, anti-beta-tre-tubulina, anti-NFH e anti-GAP43 a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, centrifugare nuovamente le cellule tre volte consecutive con un millilitro di PBS a intervalli di sei minuti, quindi incubare con anticorpi monoclonali CY5 anti-topo o anti-coniglio CY5 a temperatura ambiente per un'ora aggiuntiva. Utilizzare gli anticorpi secondari per gating le cellule immuno-positive e analizzare tutti i campioni con un citometro a flusso.Coltura 2 milioni di cellule per millilitro delle cellule staminali della polpa dentale umana in piastre a sei pozzi con due millilitri del mezzo di coltura. A 21 e 28 giorni dopo la separazione della polpa dentale o dopo altri sette-14 giorni con il mezzo di coltura neuronale, aggiungere un millilitro della tripside-EDTA a 37 gradi Celsius per tre minuti per staccare le cellule. Quindi, centrifugare, scartare il supernatante, quindi fissare i campioni con paraformaldeide al 4% in PBS a quattro gradi Celsius per 10 minuti.Quindi, centrifugare, scartare il supernatante e quindi permeabilizzare con un tensioattiva non ionico all'1% in PBS a temperatura ambiente per 10 minuti. Rimuovere il supernatante e macchiare le cellule con anticorpo monoclonale anti-PrP del coniglio a temperatura ambiente per un'ora. Infine, centrifugare, scartare il supernatante, quindi incubare con anticorpo monoclonale CY5 anti-coniglio a temperatura ambiente per un'ora aggiuntiva.Analizzare tutti i campioni con un citometro a flusso. Dopo la separazione della polpa, gruppi di cellule staminali della polpa dentale umana sono stati espansi alla periferia. Un confronto tra la crescita di queste cellule prima e dopo la differenziazione neuronale indotta da EGF/bFGF ha mostrato cambiamenti significativi nella morfologia cellulare e nella crescita dei neuriti.Le cellule staminali della polpa dentale umana non trattate espressero antigeni superficiali specifici stromali mesenchimali multipotenti, come CD44, CD90, CD105, CD73 e STRO-1. Dopo opportuni stimoli di induzione neuronale, queste cellule hanno espresso marcatori neuronali specifici, come beta-tre-tubulina, NFH e GAP43. Le cellule non trattate o trattate non esprimevano marcatori ematopoietici, come CD14 e CD19.Dopo 28 giorni, la proteina prione è stata espressa precocemente nelle cellule staminali della polpa dentale umana rispetto al corrispondente controllo negativo, e la sua espressione è stata aumentata dopo il processo di differenziazione neuronale indotto da EGF / bFGF. L'analisi western blot ha mostrato che silenziare la proteina prione per sRNA prima degli stimoli EGF/bFGF potrebbe influenzare il processo di differenziazione neuronale delle cellule staminali della polpa dentale umana impedendo l'espressione di marcatori neuronali beta-tre-tubulina e NHF. La cosa più importante è la scelta dell'enzima per separare le cellule dalla polpa.Infatti, se l'enzima è troppo aggressivo, le cellule potrebbero essere danneggiate e la loro capacità di crescita e differenziazione potrebbe essere compromessa. Le cellule staminali della polpa dentale sono un eccellente modello sperimentale che può essere utilizzato in vivo e studi in vitro nel campo della medicina rigenerativa. Poiché il PrP svolge un ruolo chiave nel processo di differenziazione neuronale delle cellule staminali della polpa dentale, questo marcatore può essere un candidato eccellente come bersaglio efficace nelle malattie neurodegenerative.L'aspetto più importante da consigliare è la condizione di salute dei pazienti, come l'assenza di malattie infettive.

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Il metodo descritto l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali dentali umane Pulp (hDPSCs)...

Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

Questo video mostra una tecnica per stabilire una co-coltura di neuroni trigemino e cellule primarie della polpa dentale utilizzando un filtro transwell. In questa condizione fisicamente separata, le cellule mesenchimali ottenute dal tessuto pulpare dentale secernono molecole di segnalazione paracrina che attraversano i pori, promuovendo la differenziazione e la migrazione dei neuroni verso le cellule mesenchimali stabilendo un sistema di co-coltura.

Stabilire una co-coltura di cellule della polpa dentale e neuroni del trigemino per la comunicazione incrociata

Questo video dimostra il processo di induzione delle cellule staminali pluripotenti umane a differenziarsi in neuroni trasfettandoli con lentivirus ingegnerizzati che trasportano un gene del fattore di trascrizione neurogenico sotto il controllo dell'elemento responsivo alla tetraciclina, seguito da un trattamento con un derivato della tetraciclina e un mezzo di maturazione.

Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane nei neuroni utilizzando lentivirus ingegnerizzati

Questa procedura produce neuroni telencefalici passando attraverso i punti di controllo che sono simili a quelli osservati durante lo sviluppo umano. Le cellule possono differenziarsi spontaneamente, sono esposti a fattori che li spingono verso il lineage neurale, sono isolati, e vengono piastrate su vetrini per consentire la differenziazione terminale e maturazione.

La specifica di telencefalici neuroni glutamatergici di cellule staminali umane pluripotenti

Questo protocollo descrive l'ingegneria genetica transitoria delle cellule staminali dentali estratti dal follicolo dentale umano. La strategia applicata modifica non virali può diventare una base per il miglioramento dei prodotti terapeutico delle cellule staminali.

Isolamento, caratterizzazione e MicroRNA-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano

Descriviamo l'isolamento, la dispersione e la placcatura delle cellule primarie della polpa dentale (DP) con neuroni trigeminali (TG) coltivati in cima ai filtri transwell sovrastanti. Le risposte cellulari delle cellule DP possono essere analizzate con l'immunofluorescenza o l'analisi RNA/proteina. L'immunofluorescenza dei marcatori neuronali con microscopia confocale consente l'analisi delle risposte di escrescenza neurite.

Un metodo di co-cultura per studiare l'escrescenza neurite in risposta ai segnali paracrini dentali

Questo articolo fornisce una guida passo passo per stabilire una coltura primaria di cellule staminali di polpa dentale utilizzando il metodo della coltura di espiantazione e la caratterizzazione di queste cellule in base alle linee guida ICSCRT. Le cellule isolate da questo protocollo possono essere considerate come cellule staminali mesenchimali per ulteriori applicazioni.

Coltura primaria di cellule staminali della polpa dentale

Questo protocollo enfatizza l'estrazione, la coltura e la conservazione di cellule staminali multipotenti dalla polpa dentale attraverso la digestione enzimatica. Inoltre, dimostra il loro potenziale di differenziarsi in osteoblasti, adipociti e condrociti, evidenziando l'importanza della precisione e della coerenza nel processo.

Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule staminali della polpa dentale da denti decidui e permanenti umani

I principali tipi di cellule aderenti derivati dal muscolo umano sono le cellule miogeniche e i fibroblasti. Qui, le popolazioni cellulari vengono arricchite utilizzando lo smistamento cellulare attivato magneticamente basato sull'antigene CD56. La successiva immunomarcatura con anticorpi specifici e l'uso di tecniche di analisi delle immagini consentono la quantificazione delle caratteristiche citoplasmatiche e nucleari nelle singole cellule.

Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

Questo protocollo descrive l'isolamento di cellule staminali di derivazione adiposa di maiale (pADSC) da tessuti adiposi sottocutanei con esame della multipotenza. I pADSC multipotenti vengono utilizzati per delineare i processi di differenziazione degli adipociti e studiare la transdifferenziazione in più linee cellulari di mesenchima mesodermico o ulteriori linee di ectoderma ed endoderma per studi rigenerativi.

Isolamento e differenziazione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo sottocutaneo da Suini tessuti adiposi

Scopri l'isolamento e la propagazione di cellule staminali della polpa dentaria umana con un tasso di successo del 90%. Questo metodo valuta l'espressione della proteina prionica durante il differenziamento neuronale per applicazioni in medicina rigenerativa.

Isolamento, propagazione e lespressione della proteina del Prion durante il differenziamento di cellule staminali polpa dentaria umana (Video) | JoVE Journal

Isolamento, propagazione e l'espressione della proteina del Prion durante il differenziamento di cellule staminali polpa dentaria umana

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