Name: Identificazione dei recettori Orexin ed Endocannabinoidi nei pesci zebra per adulti utilizzando i metodi di immunoperossiasi e immunofluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Scopri i protocolli di immunoperossidasi e immunofluorescenza per localizzare i recettori Orexin ed Endocannabinoidi nel pesce zebra adulto. Questo metodo consente di studiare l'espressione proteica in patologie come l'obesità indotta dalla dieta.

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Questo studio è stato sostenuto da Fondi Ricerca di Ateneo (FRA)2015-2016, Università del Sannio.

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Preparazione del campione
La preparazione del campione è il primo passaggio critico in IHC. Un protocollo affidabile consente la manutenzione della morfologia cellulare, dell'architettura dei tessuti e dell'antigenicità. Questo passaggio richiede la corretta raccolta dei tessuti, la fissazione e la sezionamento22,23. Lo scopo della fissazione è quello di preservare il tessuto e ridurre l'azione di enzimi tissuta...

L'immunohistochimica (IHC) è una tecnica classica ben consolidata utilizzata per identificare i componenti cellulari o tissutali (antigeni) dall'interazione antigene-anticorpo1,2. Può essere utilizzato per identificare la localizzazione e la distribuzione di biomolecole bersaglio all'interno di un tessuto. L'IHC utilizza reazioni immunologiche e chimiche per rilevare gli antigeni nelle sezioni tissutali3. I principali marcatori utilizzati per la visualizzazione delle interazioni antigene-anticorpo includono coloranti fluorescenti (immunofluorescenza) e reazioni di colore enzimatico-substrato (immunoperossiasi), entrambe coniugate agli anticorpi4. Utilizzando l'osservazione microscopica è possibile determinare la localizzazione del tessuto etichettato, che corrisponde approssimativamente alla localizzazione dell'antigene bersaglio nel tessuto.
Esistono due metodi per le reazioni fluorescenti o cromogeniche per rilevare le proteine: il metodo di rilevamento diretto, in cui l'anticorpo primario specifico è etichettato direttamente; e il metodo di rilevamento indiretto, in cui l'anticorpo primario è non coniugato mentre l'anticorpo secondario porta l'etichetta5,6,7. Il metodo indiretto ha alcuni vantaggi, che è principalmente la sua amplificazione del segnale. Inoltre, a differenza di altre tecniche molecolari e cellulari, con l'immunofluorescenza, è possibile visualizzare la distribuzione, la localizzazione e la coespressione di due o più proteine espresse in modo differenziale all'interno di cellule e tessuti7. La scelta del metodo di rilevamento utilizzato dipende dai dettagli sperimentali.
Ad oggi, IHC è ampiamente utilizzato nella ricerca di base come uno strumento potente ed essenziale per comprendere la distribuzione e la localizzazione dei biomarcatori e la profilazione generale di diverse proteine nel tessuto biologico dall'uomo agli invertebrati8, 9 (in vie , 10 del sistema , 11. La tecnica aiuta a visualizzare una mappa dell'espressione proteica in un gran numero di organi animali normali e alterati e diversi tipi di tessuto, mostrando possibili down o up-regolazione dell'espressione indotta da cambiamenti fisiologici e patologici. IHC è una tecnica altamente sensibile che richiede precisione e la corretta scelta dei metodi per ottenere risultati ottimali12. Prima di tutto, molti fattori diversi come la fissazione, la reattività incrociata, il recupero dell'antigene e la sensibilità degli anticorpi possono portare a falsi segnali positivi e falsi negativi13. La selezione degli anticorpi è uno dei passi più importanti in IHC e dipende dalla specificità dell'antigene e dalla sua affinità con le proteine e le specie in esame7.
Recentemente, abbiamo ottimizzato la tecnica IHC per rilevare i membri dei sistemi orexin/ipocretin e endocannabinoidi nel tessuto ringiovanito del pesce zebra. Ci siamo concentrati principalmente sulla fissazione, l'incorporamento dei tessuti utilizzando due approcci diversi, il sezionamento e il montaggio (che possono influenzare la risoluzione e il dettaglio durante l'analisi microscopica) e il blocco (per prevenire falsi positivi e ridurre lo sfondo)14. Altre caratteristiche importanti sono la specificità dell'anticorpo e la selettività e riproducibilità dei singoli protocolli IHC. La chiave per fornire la specificità degli anticorpi è l'uso di controlli negativi (compresi gli anticorpi primari o i tessuti che è noto per non esprimere le proteine bersaglio) e controlli positivi (compresi i tessuti che è noto per esprimere le proteine bersaglio)15 . La selezione degli anticorpi per l'IHC viene effettuata in base alla loro specificità delle specie (la probabilità con cui reagiscono con l'antigene di interesse) e ai sistemi di rilevazione antigene-anticorpo utilizzati4,5,6 ,7. Nel caso dell'immunoperossia, il colore della reazione è determinato dalla selezione del cromogeno precipitante, di solito diaminobenzidina (marrone)16. D'altra parte, immunofluorescencence utilizza anticorpi coniugati con un fluorophor per visualizzare l'espressione delle proteine in sezioni di tessuto congelato e consente una facile analisi di più proteine rispetto al sistema di rilevamento cromogenico 5 Del numero 3( , 7.
Nella tecnica dell'immunoperossiasi, l'anticorpo secondario viene coniugato alla biotina, una molecola del linker in grado di reclutare una molecola di reporter cromatogeno [complesso avidino-biotina (ABC)], che porta all'amplificazione del segnale di colorazione. Con il metodo reporter ABC, l'enzima perossidasi reagisce con 3,3'-diaminobenzidina (DAB), producendo una colorazione intensamente marrone dove l'enzima si lega all'anticorpo secondario, che può quindi essere analizzato con un microscopio luminoso ordinario. La colorazione ABC, a causa dell'alta affinità dell'avidina per la biotina, produce una reazione rapida e ottimale, con pochi anticorpi secondari attaccati al sito della reattività primaria dell'anticorpo. Questo metodo di rilevamento cromogenico consente l'analisi densitometrica del segnale, fornendo dati semiquantitativi basati sulla correlazione dei livelli di segnale marrone con i livelli di espressione delle proteine18.
Con le tecniche di immunofluorescenza, il rilevamento simultaneo di più proteine è possibile grazie alla capacità di fluorocromi diversi di emettere luce a lunghezze d'onda uniche, ma è importante scegliere con attenzione i fluorocromi per ridurre al minimo la sovrapposizione spettrale 5. Inoltre, l'uso di anticorpi primari in diverse specie ospiti riduce al minimo le difficoltà relative alla reattività incrociata. In questo caso, ogni anticorpo secondario specifico della specie riconosce solo un tipo di anticorpo primario. I reporter fluorescenti sono piccole molecole organiche, compresi i derivati commerciali, come i coloranti Alexa Fluor.
Molti modelli animali sono utilizzati per comprendere particolari condizioni fisiologiche e patologiche. Ad oggi, è stabilito che molte vie metaboliche sono conservate nel corso dell'evoluzione. Pertanto, gli studi IHC in organismi modello come il pesce zebra possono fornire informazioni sulla genesi e il mantenimento delle condizioni patologiche e non patologiche17. L'obiettivo di questa relazione è illustrare i protocolli IHC che possono essere eseguiti sul tessuto del pesce zebra adulto e utilizzati per ottenere immagini dettagliate della distribuzione e localizzazione di OXA, OX-2R e CB1R a livello periferico e centrale. Sono riportati anche protocolli per l'applicazione di due principali metodi indiretti IHC nei tessuti periferici e centrali del pesce zebra adulto. Descritto è il metodo indiretto, che consente l'amplificazione del segnale nei casi in cui un anticorpo secondario viene coniugato a un tintura fluorescente (metodo di immunofluorescenza) o reporter enzimatico (metodo immunoperossidasi). Entrambi i metodi cromogenici e fluorescenti di rilevamento possiedono vantaggi e svantaggi. Riportato in questo protocollo è l'uso di IHC, principalmente immunofluorescenza, nel pesce zebra adulto, un modello animale ampiamente utilizzato per studiare i sistemi che sono evolutivi conservati in diverse condizioni fisiologiche e patologiche.

<table><tbody><tr><td>Anti CB1</td><td>Abcam</td><td>ab23703</td><td></td></tr><tr><td>Anti OX-2R</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-OXA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc8070</td><td></td></tr><tr><td>Aquatex</td><td>Merck</td><td>1,085,620,050</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio biotinilato anti-capra</td><td>Vector Lab</td><td>BA-5000</td><td></td></tr><tr><td>acido citrico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Nikon Nikon</td><td>Eclipse Ti2</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystem</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera digitale</td><td>Leica Biosystem</td><td>DFC320</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera digitale per microscopio confocale</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi2</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti goat Alexa fluor 488-coniugato secondario anticorpi</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>Asino anti capra Alexa fluor 594-anticorpi secondari coniugati</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Asino anti coniglio Alexa fluor 488-anticorpi secondari coniugati</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Asino anti coniglio Alexa fluor 594-anticorpi secondari coniugati</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>VWR</td><td>20.821.330</td><td></td></tr><tr><td>Composto per sezione congelata</td><td>Leica Biosystem</td><td>FSC 22 Mezzi</td><td></td>per sezioni congelate</tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31642</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>20.252.290</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB</td><td>Vector lab</td><td>SK4105</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica Biosystem</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica Biosystem</td><td>RM2125RT</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Siero di coniglio normale</td><td>Cera</td> di paraffina Vector lab <td>S-5000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carlo Erba</td><td>46793801</td><td></td></tr><tr><td>Paraphormaldeyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>citrato di sodio diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka Analytical</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>VectaStain Kit Elite ABC</td><td>Vector lab</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>Xilene Puro</td><td>Carlo Erba</td><td>392603</td><td></td></tr></tbody></table>

identificazione dei recettori orexin ed endocannabinoidi nei pesci zebra per adulti utilizzando i metodi di immunoperossiasi e immunofluorescenza

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

L'immunohistochimica (IHC) è una tecnica altamente sensibile e specifica coinvolta nella rilevazione di antigeni bersaglio nelle sezioni tissutali con anticorpi etichettati. Si tratta di un processo multifase in cui l'ottimizzazione di ogni passo è fondamentale per ottenere il segnale specifico ottimale. Attraverso l'IHC, è possibile rilevare la distribuzione e la localizzazione di biomarcatori specifici, rivelando informazioni sulla conservazione evolutiva. Inoltre, L'IHC consente di comprendere i cambiamenti di espressione e distribuzione dei biomarcatori in condizioni patologiche, come l'obesità. L'IHC, principalmente la tecnica dell'immunofluorescenza, può essere utilizzato nel pesce zebra adulto per rilevare l'organizzazione e la distribuzione di molecole conserve filogeneticamente conservate, ma un protocollo IHC standard non è estasblished. Orexin ed endocannabinoidi sono due sistemi altamente conservati coinvolti nel controllo dell'assunzione di cibo e patologia dell'obesità. Riportati qui sono protocolli utilizzati per ottenere informazioni sul peptide orexin (OXA), recettore dell'orexin (OX-2R), e il recettore cannabinoide (CB1R) localizzazione e distribuzione nell'intestino e nel cervello di normali e indotti dalla dieta obeso (DIO) modelli di pesce zebra adulti. Sono inoltre descritti i metodi per l'immunoperossiasi e la doppia immunofluorescenza, nonché la preparazione di reagenti, la fissazione, l'incorporazione di paraffina e la crioprotezione del tessuto del pesce zebra e la preparazione per una fase endogena di blocco dell'attività e controstatura. L'insieme completo dei parametri è ottenuto da precedenti esperimenti IHC, attraverso i quali abbiamo dimostrato come l'immunofluorescenza può aiutare con la comprensione di OX, OX-2R, e distribuzione CB1R, localizzazione, e conservazione dell'espressione nel pesce zebra adulto Tessuti. Le immagini risultanti con intensità del segnale altamente specifico hanno portato alla conferma che i pesci zebra sono modelli animali adatti per studi immunohistochimici di distribuzione, localizzazione e conservazione evolutiva di biomarcatori specifici condizioni fisiologiche e patologiche. I protocolli qui presentati sono consigliati per gli esperimenti IHC nel pesce zebra adulto.

I dati rappresentativi per la colorazione immunoperossia sono riportati nella figura 1 e nella figura 2. L'analisi immunoistochimica della distribuzione OX-A e OX-2R nell'intestino del pesce zebra adulto ha mostrato diversi siti di localizzazione di OX-A e OX-2R e il loro aumento nell'espressione nelle cellule intestinali del pesce zebra DIO. Una colorazione marrone intensa per OX-A è stata osservata nelle cellule dell'intestino mediale e anteriore (<strong clas...

Sono presentati qui i protocolli per la caratterizzazione immunohistochimica e la localizzazione di peptidi orexin, recettori dell'orexina e recettori endocannabinoidi nell'intestino e nel cervello dei modelli di obesità adulta (DIO) normali e indotta dalla dieta immunoperissiasi e metodi di doppia immunofluorescenza.

Identificazione dei recettori Orexin ed Endocannabinoidi nei pesci zebra per adulti utilizzando i metodi di immunoperossiasi e immunofluorescenza

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Attualmente, l'immunoistochimica viene utilizzata con frequenza crescente per identificare la presenza di specifici marcatori molecolari e i loro cambiamenti in caso di patologie, dando alla radice la possibilità di eseguire analisi quantitative. L'immunoistochimica, principalmente la tecnica dell'immunofluorescenza, viene utilizzata nel modello animale larvale e zebrafish adulto, ma poco si sa di un buon protocollo immunoistochimica standard per il pesce zebra. Qui descriviamo e illustriamo un protocollo che può essere utilizzato per studiare la conservazione evolutiva di importanti proteine nel pesce zebra adulto.Un buon protocollo per l'immunoistochimica nel pesce zebra adulto può aiutare a essere alla base dell'utilità di questo modello animale per studiare l'espressione morfologica e la distribuzione di biomolecole altamente conservate. Questo metodo può anche aiutare ad analizzare possibili alterazioni di queste biomolecole a causa di condizioni patologiche correlate alla fisiopatologia umana. A dimostrare la procedura sarà la Dott.ssa Lea Tunisi, dottoranda del mio laboratorio.Per iniziare questa procedura, trasferire i blocchi di tessuto congelato preparati a un criostato a meno 20 gradi Celsius. Tagliare il blocco in sezioni coronali o sagittali di 10 micrometri. Quindi, raccogliere i tessuti in sezioni seriali alternative su vetri adesivi adatti all'immunoistochimica e conservarli a meno 20 gradi Celsius fino a quando non sono pronti per procedere.In primo luogo, utilizzare una penna resistente ai solventi per delimitare l'area tissutale sullo scivolo. Risciacquare le sezioni tre volte per cinque minuti ciascuna utilizzando tampone fosfato 0,1 molare. Successivamente, sciogliere 0,3 millilitri di Tritone X-100 in 100 millilitri di tampone fosfato 0,1 molare per preparare Triton X-100 0,3%Sciogliere lo 0,1% di siero d'asino normale in tampone fosfato contenente 0,3%Tritone X-100 per preparare la soluzione di blocco.Incubare le sezioni con la soluzione di siero d'asino normale sciolto nel tampone di permeabilizzazione PB-Triton X-100 0,3% per 30 minuti a temperatura ambiente per permeabilizzare la membrana cellulare e bloccare i siti di legame non specifici. In primo luogo, sciacquare le sezioni tre volte per cinque minuti ciascuna con tampone di fosfato molare 0,1. Aggiungere il mix di anticorpi primari diluiti in PB-T e incubare le sezioni durante la notte in una scatola umida a temperatura ambiente.Il giorno dopo, sciacquare le sezioni tre volte per cinque minuti ciascuna con tampone fosfato molare 0,1. Incubare sezioni a temperatura ambiente per due ore in un'apposita miscela di anticorpi secondari diluiti in PB-T. Per iniziare, sciacquare le sezioni tre volte per cinque minuti ciascuna con tampone fosfato molare 0,1.Sciogliere 1,5 microlitri di DAPI in tre millilitri di tampone fosfato per preparare il colorante nucleare DAPI. Controsostenere le sezioni nel colorante. Quindi, utilizzare il supporto di montaggio per ricollare le diapositive per stabilizzare il tessuto e la macchia per un uso a lungo termine.I campioni fluorescenti possono essere conservati al buio a quattro gradi Celsius. Ripetere il protocollo di immunofluorescenza e omettere l'anticorpo primario o secondario, oppure sostituire l'antisiero primario o secondario con tampone fosfato per preparare il controllo negativo. Successivamente, ripetere il protocollo di immunofluorescenza e pre-assorbire ogni anticorpo primario con un eccesso del peptide relativo.Ripeti il protocollo di immunofluorescenza su fette di cervello di topo per preparare il controllo positivo. Utilizzando un microscopio confocale dotato di uno stadio motorizzato X-Y-Z, una fotocamera digitale e un software di acquisizione e analisi, osservare e analizzare le sezioni immunostained. Acquisisci immagini digitali con gli obiettivi 5x, 20x e 40x.Scatta immagini di ogni sezione a basso ingrandimento in ciascuno dei canali disponibili per comporre un montaggio a basso ingrandimento. Normalizza le immagini a fluorescenza al massimo contrasto e sovrapposizione. In tutta l'area di interesse, raccogli pile seriali di immagini attraverso sei piani focali con gradini focali da uno a 1,8 micrometri.Eseguire questa raccolta per ogni canale separatamente. Successivamente, utilizzare il software di deconvoluzione dell'imaging per deconvolvere le immagini mediante l'applicazione di 10 iterazioni e comprimere le immagini seriali del piano Z in un'unica immagine di proiezione massima. Utilizzare un software di modifica delle immagini appropriato per regolare le micrografie in base alla luce e al contrasto.L'analisi immunoistochimica della distribuzione OX-A e OX-2R nell'intestino del pesce zebra adulto mostra diversi siti di localizzazione di OX-A e OX-2R e il loro aumento di espressione nelle cellule intestinali del pesce zebra DIO. Un'intensa colorazione marrone per OX-A si osserva nelle cellule dell'intestino mediale e anteriore. L'immunoespressione di OX-A dà segnali chiari nei diversi compartimenti intestinali, diminuendo dall'anteriore verso l'intestino mediale.Risultati simili sono osservati per l'immunoespressione OX-2R nell'intestino del DIO e controllare la dieta zebrafish. Un maggiore segnale OX-A nel pesce zebra adulto DIO è accompagnato dalla sovraespressione di OX-2R in altri compartimenti intestinali. Un'analisi accurata delle immagini immunofluorescenti mostra l'aumento della colocalizzazione OX-2R/CB1R nell'intestino del pesce zebra adulto DIO rispetto alla dieta di controllo zebrafish.Una situazione simile si osserva in diverse regioni cerebrali, come il telencefalo dorsale, l'ipotalamo, lo tectum ottico, il toro lateralis e il nucleo diffuso del lobo inferiore. Con la doppia immunosottenzione con colocalizzazione orexina-A e CB1R, si osserva che c'è stato un aumento della colocalizzazione nei neuroni origanoergici dell'ipotalamo, accompagnato da un aumento del segnale fluorescente orexin-A. Questi risultati mostrano come la doppia immunofluorescenza possa aiutare a identificare l'espressione proteica fisiologicamente conservata, la colocalizzazione delle proteine bersaglio e i cambiamenti di distribuzione e/o espressione in diverse condizioni patologiche.Usando l'immunofluorescenza, possiamo comprendere meglio la codistribuzione e la coespressione delle biomolecole, le loro possibili interazioni, e possiamo anche avere un'immagine visibile dei loro cambiamenti in caso di diverse patologie. Inoltre, la distribuzione neuroanatomica dell'espressione enzimatica metabolica o dei recettori può rivelare ulteriormente il ruolo della segnalazione proteica all'interno dei tessuti. L'attuale lavoro tecnico ha introdotto l'approccio dell'immunofluorescenza per studiare due sistemi altamente conservati, l'orexin e gli endocannabinoidi, utilizzando un modello di zebrafish adulto.Usando questo protocollo descritto qui per la prima volta nel cervello del pesce zebra adulto, la distribuzione anatomica e la coespressione dei recettori dell'orexin-2 e dei recettori endocannabinoide-CB1 non è stata determinata. Raccomandiamo i protocolli qui descritti per gli esperimenti di immunoistochimica e per rilevare la distribuzione spaziale e l'organizzazione dei recettori nei peptidi nei pesci zebra adulti per comprenderne meglio le funzioni.

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Identificazione dei recettori Orexin ed Endocannabinoidi nei pesci zebra per adulti utilizzando i metodi di immunoperossiasi e immunofluorescenza

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