Name: Identificare gli amminoacidi sovraproduttori utilizzando marcatori rari-codoni-ricchi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Scopri un metodo alternativo efficiente per identificare sovraproduttori di amminoacidi utilizzando marcatori ricchi di codoni rari. Questa tecnica offre accuratezza, sensibilità e alto throughput simultaneamente.

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Il lavoro è stato sostenuto congiuntamente dalla National Natural Science Foundation of China (n. 21676026), dal National Key R&D Program of China (grant n. 2017YFD0201400) e dalla China Postdoctoral Science Foundation (n. 2017M620643). I lavori dell'UCLA Institute of Advancement (Suzhou) sono stati sostenuti dalle sovvenzioni interne della provincia di Jiangsu e del Parco Industriale di Suzhou.

1. Costruzione dei plasmidi che esprimono i geni marcatori rari-codoni-ricchi
<ol><li>Selezionare un gene marcatore contenente un numero appropriato di codoni comuni per l'amminoacido mirato. NOTA: Per L-leucine, il gene di resistenza alla kanamicina kanR, che contiene 29 codoni di leucina, di cui 27 sono codoni comuni, viene utilizzato per la costruzione del sistema di selezione13. Il gene gfp, che contiene 17 codoni comuni su 19 codoni leule, o il gene di codifica delle proteine viola prancerpurple (ppg), che ospita 14 codoni comuni di leucina, viene utilizzato per il sistema di screening (supplementari tabella 1 ).</li>
	<li>Sostituire i codoni comuni nei geni marcatori con il codone raro sinonimo. Per L-leucine, sostituire i suoi codoni in kanR, gfpo ppg con il raro codon CTA, generando kan R-R-RCs, gfp-RCo ppg-RC, rispettivamente13 ( Tabella supplementare 1). NOTA: La frequenza del codone raro nei geni marcatori influenzerà la severità del sistema di selezione o screening. In generale, l'aumento del numero di codoni rari aumenterà la severità del sistema di selezione o screening. Per ottenere la giusta forza di selezione o screening, progettare una serie di geni marcatori che ospitano diversi numeri di codoni rari e confrontarne gli effetti.</li>
	<li>Genera elementi costitutivi dei geni marcatori rari ricchi di codoni utilizzando strumenti come GeneDesign14 (http://54.235.254.95/gd/) per la sintesi genica. In alternativa, ordinare i geni marcatori dai servizi di sintesi genica commerciale.<ol>
<li>Nella pagina GeneDesign, scegliete Progettazione blocchi predefiniti (sovrapposizione lunghezza costante).</li>
		<li>Incollate le sequenze dei geni marcatori rari-codoni nella casella Sequenza.</li>
		<li>Definire la lunghezza di sovrapposizione tra gli oligos dell'assieme; tenere presente che il valore predefinito 40 bp funziona bene per la maggior parte delle sequenze. NOTA: Consultare il manuale online per ulteriori istruzioni sulle impostazioni degli altri parametri.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante Progetta blocchi predefiniti e ordinare gli oligonucleotidi elencati nella pagina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sintetizza i geni raramente modificati dal sistema di reazione a catena della polimerasi (PCR) sintesi accurata15.</li>
	<li>Ligate il raro-codon-rich kanR-RC al vettore pET-28a, gfp-RC a pSB1C3, e ppg-RC a CPB-37-44116. NOTA: Le mappe pET-28a e pSB1C3 plasmid sono disponibili nel database di plasmide online SnapGene (tabella supplementare 1); la mappa plasmica CPB-37-441 è disponibile sul sito web delle proteine cromogeniche ATUM.<ol>
<li>Sul ghiaccio, aggiungere il vettore e i frammenti del marcatore in un rapporto molare di 1:1 a 7,5 l di miscela di assemblaggio (vedere Tabella dei materiali) ad un volume totale di 10 l. Incubare il campione a 50 gradi centigradi per 1 h.</li>
		<li>Trasformare 5 -L del prodotto di assemblaggio in 50 -L di celle competenti (vedi Tabella deiMateriali) a 42 gradi centigradi per 30 s.</li>
		<li>Recuperare le cellule nel SOC (brodo super ottimale con repressione del catabolito) medio a 37 gradi centigradi per 1 h, piastrasu LB (brodo di lisogenia) mezzo di agar, e incubare a 37 gradi durante la notte.</li>
		<li>Inoculare la colonia nel mezzo LB e incubare a 37 gradi centigradi per 8 h.</li>
		<li>Isolare il plasmide utilizzando un kit commerciale preferito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ottimizzazione delle condizioni di selezione
<ol><li>Rendere il ceppo genitore utilizzato per la mutagenesi in cellule competenti17.</li>
	<li>Trasformare 50 l delle celle competenti con 1 l of plasmid che trasporta il tipo selvaggio kanRe trasformare un altro insieme di celle competenti con il plasmide contenente kan R-RC29 con tutto il codone leucina sostituito dal raro codon CTA.</li>
	<li>Aggiungere 950 l di MEZZO SOC e incubare il campione in uno shaker a 250 giri/min a 37 gradi centigradi per 1 ora.</li>
	<li>Piastra 100 -L della coltura cellulare sul mezzo agar LB contenente 50 g-mL-1 kanamycin, e incubarlo a 37 gradi centigradi per circa 8 h fino a quando non appaiono colonie.</li>
	<li>Scegli le colonie che ospitano il kanR di tipo selvaggio e il kanR-RC29, ricco di codoni e usali per inoculare 5 mL di cinque volte mezzo LB diluito (0,2x LB) contenente 50 g-mL-1 kanamycin. Incubare i campioni in uno shaker a 250 giri/min a 37 gradi centigradi. NOTA: il supporto è fondamentale per il sistema di selezione. Dovrebbe contenere abbastanza carbonio e azoto per consentire l'espressione della proteina di resistenza agli antibiotici dal gene wild-type piuttosto che dai derivati rari-codoni-modificati. In questo caso, la concentrazione di L-leucina nel mezzo 1x LB è troppo alta per inibire completamente l'espressione proteica dal kan Rraro-ricco di codone . Pertanto, un mezzo LB diluito con un fattore di diluizione come 5 viene utilizzato per generare una chiara differenza nelle espressioni proteiche dal tipo selvatico e dai geni rari-ricchi di codoni.</li>
	<li>Trasferire 200 l di ciascuna coltura cellulare su una piastra di 96 pozzetto in triplice copia a punti temporali definiti (ad esempio, 8 h, 16 h e 24 h). Misurare l'OD600 (densità ottica a 600 nm) utilizzando un lettore di lamiere. NOTA: Se non è possibile rilevare una diminuzione della cellula OD600 per i ceppi che ospitano i geni marcatori rari-codoni-ricchi rispetto all'OD600 del ceppo che ospita i geni marcatori di tipo selvatico, cercare di aumentare la quantità di codone raro nel o utilizzare un mezzo più diluito.</li>
	<li>Eseguire il test dell'alimentazione degli amminoacidi per verificare se le espressioni dei geni marcatori rari-codoni-ricchi (ad esempio, kanR-RC29) possono essere ripristinate aumentando la concentrazione degli amminoacidi mirati. NOTA: Per la selezione dei produttori di L-leucina, l-leucina viene utilizzata per l'alimentazione.<ol>
<li>Inoculare i ceppi che ospitano il gene del marcatore kanR-RC29 in 5 mL di 0,2x LB (contenenti 50 g-mL-1 kanamycin) con o senza la fornitura di 1 g L-1 L-leucina. Inoculare altri 5 mL dello 0,2x LB con ceppi che ospitano il kanR di tipo selvaggio come controllo. Incubare i campioni in uno shaker a 250 giri/min a 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Misurare l'OD600 per ogni coltura in punti temporali definiti (ad esempio, 15 h, 17 h, 19 h e 22 h).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ottimizzazione delle condizioni di screening
<ol><li>Trasformare 50 -L del ceppo padre utilizzato per la mutagenesi con 1 -L di plasmide (50ng-L -1) che trasporta il gfp di tipo selvatico o il tipo selvaggio ppg. Inoltre, trasformare la deformazione padre con i derivati rari-ricchi di codone dei geni marcatori.</li>
	<li>Aggiungere 950 l di MEZZO SOC e incubare il campione in uno shaker a 250 giri/min a 37 gradi centigradi per 1 ora.</li>
	<li>Piastra 100 L della coltura cellulare sul supporto agar LB contenente gli antibiotici appropriati (25 g-mL-1 clorambionico per il plasmide gfp che trasporta un marcatore R cm, o 50 g-mL -1 kanamycin per il ppg un indicatore kan R) e incubare durante la notte a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Scegli una colonia che ospita il tipo selvaggio gfp o ppg e una colonia che ospita il corrispondente derivato raro-ricco di codone, e trasferiscili a 5 mL del mezzo LB correttamente diluito individualmente. Incubare i campioni in uno shaker a 250 giri/min a 37 gradi centigradi. NOTA: Per E. coli ceppi che ospitano la leucina rara-codon-ricca gfp-RC o ppg-RC,il mezzo LB non diluito (1x LB) può essere utilizzato per creare differenze significative nelle espressioni del tipo selvatico e il marcatore raro-codon-ricco Geni. Inoltre, i promotori inducibili vengono utilizzati per guidare le espressioni dei geni marcatori di screening. Iniziare l'induzione quando le cellule entrano nella fase esponenziale per ottenere migliori discriminazioni.</li>
	<li>Per i marcatori di fluorescenza, trasferire 200 L di ciascuna coltura cellulare in una piastra nera a fondo chiaro 96 in triplice copia a punti temporali definiti (ad esempio, 2 h, 4 h e 6 h). Misurare l'OD600 e la fluorescenza e calcolare l'intensità della fluorescenza (il rapporto tra fluorescenza e OD600). Per i marcatori cromogenici, misurare lo sviluppo del colore delle colture cellulari. NOTA: Se non è possibile rilevare intensità di fluorescenza inferiori per i ceppi che ospitano il gfp-RC rispetto a quello dei ceppi che ospitano il tipo selvaggio gfp, o se non è possibile rilevare un colore più chiaro per le cellule che esprimono la proteina viola dal ppg-RC che dal gene wild-type, cercare di aumentare il numero di codon rari sui geni marcatori o utilizzare un mezzo più diluito.</li>
	<li>Eseguire il provvedimento di alimentazione (vedere i passaggi 2.7.1 e 2.7.2). Misurare l'intensità della fluorescenza o lo sviluppo del colore in punti temporali definiti (ad esempio, 12 h, 18 h e 24 h).</li>
</ol>4. Identificazione dei sovraproduttori di amminoacidi
<ol><li>Inoculare 100 - L della cultura dei mutanti in 5 mL di LB medio (2% v/v) e incubarlo in uno shaker a 250 rpm a 37 s fino a quando i valori di OD600 raggiungono 0,4.</li>
	<li>Rendere i mutanti in cellule competenti17.</li>
	<li>Trasformare 50 l delle cellule mutanti con 1 L del plasmide (50 ng-L-1) portando il marcatore di selezione kanR-RC29 o i marcatori di screening gfp-RC o ppg-RC. Aggiungere 950 l di mezzo SOC e ruotare il campione in uno shaker a 37 gradi centigradi per 1 h.</li>
	<li>Selezionare i prodotti amnominoacidi.<ol>
<li>Centrifugare la coltura cellulare a 4.000 x g per 5 min, eliminare il supernatante e aggiungere 5 mL di 0,2x lB medio contenente 50 g-mL-1 kanamycin. Incubare il campione in uno shaker a 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Piastrare la coltura durante la notte (ad es., 100 l, dipende dalla densità cellulare della coltura) su un mezzo agar da 0,2 x LB contenente 50 -g-mL-1 kanamicina e incubare a 37 gradi centigradi per 12 h. NOTA: Le colonie sviluppate sono i candidati degli amminoacidi mirati sovraproduttori e, in questo caso, gli sovraproduttori di L-leucina.</li>
	</ol></li>
	<li>Scherma i sovranni di amminoacidi.<ol>
<li>Piastrare il numero appropriato di cellule (ad es., 100 l) che ospitano il marcatore di screening (come descritto al punto 4.3) sul supporto lB agar contenente l'antibiotico appropriato (25 g-mL-1 cloramhenicol per lo screening con gfp-RC e 50 g-mL -1 kanamicicina per lo screening con ppg-RC) e incubare a 37 gradi centigradi per 8 h.</li>
		<li>Inoculare il supporto LB contenente l'antibiotico appropriato (vedere il passaggio 4.5.1) con ogni singola colonia dalla piastra. Incubare i campioni in uno shaker a 250 giri/min a 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Misurare l'OD600 e la fluorescenza e calcolare l'intensità della fluorescenza se viene utilizzato gfp-RC. Misurare lo sviluppo del colore delle colture cellulari se si utilizza ppg-RC. Si noti che i ceppi che presentano una maggiore intensità di fluorescenza o un colore più profondo di quello del ceppo genitore sono i prodotti aminoacidi candidati e, in questo caso, gli overproduttori L-leucine. NOTA: Lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza è adatto anche per identificare i produttori alti monocellulari quando i rari geni delle proteine fluorescenti ricchi di codoni vengono utilizzati per lo screening.</li>
	</ol></li>
	<li>Verificare la prodottisia degli amminoacidi dei ceppi candidati.<ol>
<li>Inoculare 5 mL di lB medio con ciascuno dei ceppi candidati e lasciare che le cellule crescono durante la notte in uno shaker a 250 giri/mm a 37 .</li>
		<li>Raccogliere le cellule da 1 mL della coltura cellulare con centrifugazione a 4.000 x g per 2 min. Scartare il supernatante e riattendere il pellet con 1 mL di acqua sterile.</li>
		<li>Inoculare 20 mL di mezzo M9 contenente il 4% di glucosio con 200 l della sospensione cellulare e incubare in uno shaker da 250 mL a 250 giri/ma a 37 gradi centigradi per 24 ore.</li>
		<li>Centrifuga 1 mL del mezzo di coltura a 4.000 x g per 5 min. Trasferire 200 l del supernatante in un tubo pulito da 1,5 mL. Preparare soluzioni L-leucine (HPLC (cromatografia liquida ad alte prestazioni) di 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 e 1 g L-1 come standard.</li>
		<li>Aggiungete 100 luna di 1 mM di triethylamine e 100-L di 1 M di isothiocyanate fenile al super-nato e agli standard, mescolarli delicatamente e incubarli a temperatura ambiente per 1 h18. AVVISO: La trietilamina e l'isothiocyanato fenilpossono causare gravi ustioni cutanee e danni agli occhi ed è dannoso se inalato. Indossare guanti e una maschera e, se possibile, eseguire questo passaggio in un cappuccio fumi.</li>
		<li>Aggiungete 400 l di n-exane allo stesso tubo e vortice per 10 s. Filtrare la fase inferiore contenente i derivati degli amminoacidi attraverso una membrana di politetrafluoroetilene di 0,2 m. AVVISO: n-exane può causare irritazione della pelle. Indossare guanti e indumenti protettivi. Se viene a contatto con la pelle, sciacquare la pelle con molta acqua.</li>
		<li>Preparare la fase a mobile mescolando acetato di sodio da 0,1 M (pH 6,5) e acetonitrile in un rapporto volumetrico 99.3:0.7. Preparare l'acetonitrile (80% v/v) come fase mobile B. Filtrare tutte le fasi mobili attraverso le membrane di politetrafluoroetilene da 0,2 m. AVVISO: L'acetonitricolo è dannoso se inalato e può causare irritazioni cutanee e agli occhi. Indossare guanti e indumenti protettivi ed eseguire questo passaggio in una cappa di fumi.</li>
		<li>Eseguire 1 l del campione su un ultra-HPLC dotato di una colonna C18 secondo il programma di elusione nella tabella 1 con una portata di 0,42 ml-min-1 e una temperatura della colonna di 40 gradi centigradi. Rileva gli amminoacidi mirati a 254 nm con un rilevatore di array di diodi e calcola le loro concentrazioni mappando le aree di picco alla curva standard.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tempo (min)</td>
			<td>Fase Mobile A (%)</td>
			<td>Fase mobile B (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 (in vie</td>
			<td>98 (di base)</td>
			<td>2 Il nome del sistema</td>
		</tr>
<tr>
<td>3.5 3:</td>
			<td>70 del sistema di</td>
			<td>30 milio</td>
		</tr>
<tr>
<td>7 (in questo stato</td>
			<td>43 (di cine)</td>
			<td>57 del sistema</td>
		</tr>
<tr>
<td>7.1 La</td>
			<td>0 (in vie</td>
			<td>100 del sistema</td>
		</tr>
<tr>
<td>11 Del sistema di</td>
			<td>98 (di base)</td>
			<td>2 Il nome del sistema</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Programma di elusione per la quantificazione degli amminoacidi.

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<li>Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectinomycin+resistance+at+site+1192+in+16S+ribosomal+RNA+of+E.+coli%3A+an+analysis+of+three+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants.</a> Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).</li>
<li>Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+tRNA+recognition+of+a+tRNA+synthetase+by+a+single+amino+acid+change%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).</li>
<li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+selective+tRNA+aminoacylation+mechanism+based+on+a+single+G%E2%80%A2+U+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair.</a> Nature. 510 (7506), 507(2014).</li>
<li>Hoesl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li>
<li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+on+codon+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li>
<li>Huo, Y. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346(2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il numero di codoni rari nei geni marcatori e nel mezzo di selezione o screening è fondamentale per inibire le espressioni proteiche dai geni marcatori raramente-modificato codoni. Se non è possibile rilevare alcuna differenza significativa tra le espressioni proteiche dei geni marcatori di tipo selvatico e i loro derivati, l'aumento del numero di codoni rari o l'utilizzo di un mezzo limitato dai nutrienti può amplificare le differenze. Tuttavia, se l'effetto di inibizione è troppo forte, le espressioni proteiche non pos...

L'attuale produzione di amminoacidi dipende fortemente dalla fermentazione. Tuttavia, i titoli e le rese per la maggior parte dei ceppi di produzione di amminoacidi sono al di sotto delle crescenti richieste del mercato globale degli amminoacidi che vale miliardi di dollari1,2. Ottenere prodotti aminoacidi ad alte prestazioni sono fondamentali per l'aggiornamento dell'industria degli amminoacidi.
La strategia tradizionale per identificare i sovraproduttori di amminoacidi sfrutta i concorsi tra aminoacidi e i loro analoghi nella sintesi proteica3,4. Questi analoghi sono in grado di caricare i tRNA che riconoscono gli aminoacidi corrispondenti e quindi inibiscono gli allungamenti delle catene di peptidi, portando alla crescita arrestata o alla morte cellulare5. Un modo per resistere alle sollecitazioni analogiche è quello di aumentare le concentrazioni di aminoacidi intracellulari. Gli amminoacidi arricchiti supereranno gli analoghi per i tRNA finiti e garantiranno la corretta sintesi delle proteine funzionali. Pertanto, i ceppi che sopravvivono agli analoghi possono essere selezionati e sono probabilmente i sovraproduttori degli amminoacidi corrispondenti.
Sebbene si sia dimostrata efficace nella selezione di sovraproduttori di amminoacidi come L-leucina6, la strategia analogica soffre di gravi inconvenienti. Una delle principali preoccupazioni è la resistenza analogica originatadal processo di mutagenesi o attraverso mutazioni spontanee. I ceppi di resistenza possono sfuggire alla selezione bloccando, esportando o degradando gli analoghi5. Un'altra preoccupazione sono gli effetti collaterali tossici degli analoghi su altri processi cellulari7. Di conseguenza, i ceppi che sopravvivono alla selezione analogica potrebbero non essere i sovraproduttori di amminoacidi, mentre gli overproduttori desiderati potrebbero essere falsamente sterminati a causa degli effetti collaterali negativi.
Qui viene presentata una nuova strategia basata sulla legge del pregiudizio del codone al fine di ottenere identificazioni accurate e rapide dei sovraproduttori di amminoacidi. La maggior parte degli amminoacidi sono codificati da più di una tripletta nucleotide che è favorita in modo diverso dagli organismi ospiti8,9. Alcuni codoni sono raramente utilizzati nelle sequenze di codifica e sono indicati come i codoni rari. Le loro traduzioni in amminoacidi si basano sui tRNA cognati che trasportano gli aminoacidi corrispondenti. Tuttavia, i tRNA che riconoscono codoni rari di solito hanno abbondanza molto più basse rispetto ai tRNA dei codoni comuni10,11. Di conseguenza, questi rari tRNA hanno meno probabilità di catturare gli amminoacidi liberi nei concorsi con altri isoaccettatori, e le traduzioni delle sequenze rare ricche di codoni iniziano a rallentare o addirittura vengono terminate quando le quantità di aminoacidi sono limitate 10. Le traduzioni potrebbero, teoricamente, essere ripristinate se c'è un surplus di amminoacidi dopo aver caricato i sinonimi tRNA comuni a causa di sovraproduzioni o alimentamenti supplementari degli amminoacidi corrispondenti12. Se il gene raro ricco di codone codifica un marcatore di selezione o di screening, i ceppi che esibiscono i fenotipi corrispondenti possono essere facilmente identificati e sono probabilmente i sovraproduttori degli amminoacidi mirati.
La strategia di cui sopra viene applicata per stabilire una selezione e un sistema di screening per l'identificazione dei sovraproduttori di amminoacidi. Il sistema di selezione utilizza come marcatori i geni di resistenza agli antibiotici (ad esempio, kanR),mentre il sistema di screening utilizza le proteine fluorescenti di codifica dei geni (ad esempio, proteine fluorescenti verdi [GFP]) o cromogeniche (ad esempio, PrancerPurple). I geni marcatori in entrambi i sistemi vengono modificati sostituendo il numero definito dei codoni comuni per l'amminoacido mirato con la sua rara alternativa sinonimo. I ceppi nella libreria di mutazioni che ospitano il gene marcatore raro-codon-ricco sono selezionati o sottoposti a screening in condizioni adeguate, e gli overproduttori degli amminoacidi mirati possono essere facilmente identificati. Il flusso di lavoro inizia con la costruzione del sistema genetico marcatore raro-codon-ricco, seguita dall'ottimizzazione delle condizioni di lavoro, e quindi con l'identificazione e la verifica degli amminoacidi sovraproduttori. Questa strategia analogico-indipendente si basa sul dogma nella traduzione delle proteine ed è stata praticamente verificata per consentire identificazioni accurate e rapide dei sovraproduttori di amminoacidi. Teoricamente, potrebbe essere impiegato direttamente agli amminoacidi con codoni rari e a tutti i microrganismi. In tutto, la strategia basata su codone raro servirà come un'alternativa efficiente all'approccio analogico convenzionale quando non sono disponibili analoghi appropriati per specifici amminoacidi, o quando un alto tasso di falsi positivi è la preoccupazione principale. Il protocollo seguente utilizza codone raro leucina per dimostrare questa strategia nell'identificazione di Escherichia coli L-leucine iperproduttori.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile</td><td>Thermo</td><td>51101</td><td></td></tr><tr><td>EasyPure HiPure Plasmide MiniPrep Kit</td><td>Transgen</td><td>EM111-01</td><td></td></tr><tr><td>EasyPure Quick Gel Extraction Kit</td><td>Transgen</td><td>EG101-01</td><td></td></tr><tr><td>Gibson assemblaggio master mix</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalattopiranoside</td><td>Solarbio</td><td>I8070</td><td></td></tr><tr><td>L-leucina</td><td>Sigma</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>n-esano</td><td>Thermo</td><td>H3061</td><td></td></tr><tr><td>Fenil isotiocianato</td><td>Sigma</td><td>P1034</td><td></td></tr><tr><td>PrancerPurple CPB-37-441</td><td>ATUM</td><td>CPB-37-441</td><td></td></tr><tr><td>TransStar FastPfu Fly DNA polimerasi</td><td>Transgen</td><td>AP231-01</td><td></td></tr><tr><td>Trietilammina</td><td>Sigma</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografia liquida ad altissime prestazioni</td><td>Agilent</td><td>1290 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>Wild type C. glutamicum</td><td>ATCC</td><td>13032</td><td></td></tr><tr><td>XL10-Gold E. coli cellula competente</td><td>Agilent</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 colonna</td><td>Agilent</td><td>959759-902K</td><td></td></tr></tbody></table>

identificare gli amminoacidi sovraproduttori utilizzando marcatori rari-codoni-ricchi

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Per soddisfare il mercato in continua crescita per gli amminoacidi, sono necessari ceppi di produzione ad alte prestazioni. I prodotti non amnopesonoari sono convenzionalmente identificati sfruttando i concorsi tra gli amminoacidi e i loro analoghi. Tuttavia, questo metodo basato su analogico è di bassa precisione e gli analoghi appropriati per gli amminoacidi specifici sono limitati. Qui, presentiamo una strategia alternativa che consente uno screening accurato, sensibile e ad alta velocità di produzione di amminoacidi utilizzando marcatori rari ricchi di codoni. Questa strategia è ispirata al fenomeno della distorsione dell'uso del codone nella traduzione delle proteine, per la quale i codoni sono classificati in comuni o rari in base alle loro frequenze di occorrenza nel DNA codificante. La traduzione di codoni rari dipende dai corrispondenti RNA di trasferimento rari (tRNA), che non possono essere completamente addebitati dagli amminoacidi cognati in condizioni di fame. Teoricamente, i tRNA rari possono essere addebitati se c'è un surplus di aminoacidi dopo aver caricato i sinonimi isoacceptors comuni. Pertanto, le traduzioni ritardate causate da codoni rari potrebbero essere ripristinate alimentando o sovrapproduzione intracellulari degli amminoacidi corrispondenti. In base a questa ipotesi, viene istituito un sistema di selezione o screening per l'identificazione dei sovraproduttori di amminoacidi sostituendo i codoni comuni degli amminoacidi mirati con le loro alternative rare sinonimi nei geni di resistenza agli antibiotici o nei geni codificare proteine fluorescenti o cromogene. Dimostriamo che le espressioni proteiche possono essere notevolmente ostacolate dall'incorporazione di codoni rari e che i livelli di proteine sono correlati positivamente con le concentrazioni di amminoacidi. Utilizzando questo sistema, gli sovraproduttori di aminoacidi multipli possono essere facilmente esaminati dalle librerie di mutazioni. Questa strategia basata su codone rara richiede solo un singolo gene modificato, e l'ospite è meno probabile che sfuggirà alla selezione rispetto ad altri metodi. Offre un approccio alternativo per ottenere i non amminoacidi sovraproduttori.

Per il sistema di selezione, si osserva una forte diminuzione dell'OD600 per i ceppi che ospitano il gene di resistenza agli antibiotici, ricco di codoni rari, rispetto al ceppo che ospita il gene di resistenza agli antibiotici di tipo selvatico quando viene coltivato in un medio(Figura 1a). Nelle stesse condizioni, la diminuzione della cellula OD600 diventa più evidente con l'aumentare del numero di codoni rari nel gene di resistenza ag...

Questo studio presenta una strategia alternativa al metodo tradizionale basato sull'analogico tossico nell'identificazione di sovraproduttori di amminoacidi utilizzando marcatori rari ricchi di codoni per ottenere contemporaneamente precisione, sensibilità e alta produttività.

Identificare gli amminoacidi sovraproduttori utilizzando marcatori rari-codoni-ricchi

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Questo metodo fornisce un'alternativa efficiente all'approccio convenzionale basato sull'analogico nell'ottenere sovraproduttori di amminoacidi. Questa tecnica sovracompia il metodo tradizionale basato sull'analogico fornendo precisione, sensibilità e alta produttività contemporaneamente. Questo metodo getta nuova luce sulla comprensione dei punti di forza della sovrapproduzione degli amminoacidi e sulla traduzione di codoni rari e potrebbe, teoricamente, essere applicato a tutti i microrganismi.Questo protocollo si basa principalmente su operazioni sperimentali molecolari di base che sono facili da seguire, ma possono richiedere più prove al fine di ottenere l'adeguata selezione di stringenze di sforzo. Una dimostrazione visiva di questa tecnica offre un apprezzamento diretto sulle prestazioni della selezione e un sistema di screening nell'identificazione dei produttori di amminoacidi. Per iniziare questa procedura, aggiungere il vettore nei frammenti marcatori, sul ghiaccio, in un rapporto molare da uno a uno a sette punti cinque microlitri di mix di assemblaggio a un volume totale di dieci microlitri.Incubare a 50 gradi Celsius per un'ora. Trasforma cinque microlitri del prodott

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Associazioni di genetica spesso rimangono inspiegabili a livello funzionale. Questo metodo si propone di valutare l'effetto del fenotipo-marcatori genetici associati sull'espressione genica analizzando cellule eterozigoti per SNP trascritte. La tecnologia permette la misura precisa di MALDI-TOF spettrometria di massa per quantificare allele-specifici prodotti primer extension.

Una allele-specifica espressione genica saggio per testare la base funzionale delle Associazioni di genetica

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Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis

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Un protocollo per la valutazione funzionale del Whole-Protein Saturazione mutagenesi biblioteche Utilizzando High-Throughput Sequencing

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Identificare gli amminoacidi sovraproduttori utilizzando marcatori rari-codoni-ricchi

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