Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana

In questo protocollo, possiamo identificare le interazioni tra proteine e DNA, rivelando la regolazione trascrizionale del gene. Questo aiuta a capire i meccanismi molecolari nelle cellule. Modifichiamo i protocolli preesist esistenti e poi stabiliamo protocolli di dosaggio semplici e più chiari.

Basta seguire il protocollo dal primo passo in modo che il test possa essere fatto con successo. Per preparare la cromatina retittata, in una cappa aspirante aggiungere quattro millilitri di coltura cellulare 1%VCaP e 0,229 millilitri del 18,5% di PFA a un piatto di sei centimetri. Ruotare delicatamente il piatto per distribuire la PFA in modo uniforme.

Incubare a temperatura ambiente per esattamente 10 minuti. Quindi, aggiungere 0,47 millilitri di soluzione di glicina 1,25-molare al piatto e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti per interrompere ulteriori collegamenti incrociati. Dopo aver lavato le celle secondo il manoscritto, raschiare le cellule e trasferire la sospensione cellulare in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.

Centrifugare il tubo con la sospensione cellulare a 3.000 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente per recuperare il pellet cellulare. Utilizzare una pipetta per rimuovere completamente il PBS. Registrare il numero di cella per tubo e conservare il pellet di cella a meno 80 gradi Celsius.

Per eseguire lalisi cellulare, scongelare prima i pellet di cellule VCaP immagazzinati sul ghiaccio. Aggiungere 300 microlitri del tampone dilisi cellulare ChIP preparato integrato con PIC ad ogni tubo e rimescolare accuratamente il pellet. Vortice il tubo per 15 secondi e incubare la sospensione sul ghiaccio per 10 minuti.

Centrifuga a 9.000 volte g per tre minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere completamente il supernatante e aggiungere 300 microlitri di tampone di digestione MNasi per rimescolare il pellet. Diluire la MNasi con tampone di digestione MNasi in un tubo da 1,5 millilitri per produrre 50 unità di gel per microlitro.

Aggiungere la MNasi diluita alla sospensione e incubare a 37 gradi Celsius per esattamente 10 minuti. Impostare la miscelazione per inversione ogni 2 minuti e mezzo. Per terminare la digestione della MNasi, aggiungere 30 microlitri di EDTA 0,5 molare a pH otto e vortice brevemente.

Dopo l'incubazione per cinque minuti sul ghiaccio, centrifugare a 9.000 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere completamente il supernatante e rimescolare il pellet in 300 microlitri del tampone di diluizione ChIP preparato integrato con PIC. Quindi, su un sonicatore dotato di una sonda microtip, impostare le condizioni di sonicazione su ampiezza due, tempo elaborato 15 secondi, impulso ON cinque secondi e impulso OFF 30 secondi.

Sonicare la sospensione sul ghiaccio. Disegnare un microlitro della sospensione e individuare su un vetro scorrevole. Al microscopio, osservare per assicurarsi che la struttura cellulare sia quasi rotta.

Centrifugare il tubo a 9.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius e trasferire il supernatante in un nuovo tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri. Salvare 20 microlitri della cromatina digerita in un tubo a vite da 1,5 millilitri per un ulteriore trattamento e conservare il resto a meno 80 gradi Celsius. In primo luogo, in ogni tubo a vite da 1,5 millilitri, aggiungere 75 microlitri di acqua, quattro microlitri di cloruro di sodio molare e un microlitro di proteinasi K.To rimuovere il legame incrociato tra proteine e DNA, aggiungere 20 microlitri di cromatina digerita da ogni condizione di digestione della MNasi a un tubo a vite.

Chiudere saldamente il cappuccio, mescolare completamente e incubare il tubo a 65 gradi Celsius durante la notte. Al mattino, dopo aver centrifugato il tubo a due o 3.000 volte g per alcuni secondi, aggiungere 100 microlitri di PCI. Vortice vigorosamente per formare un'emulsione.

Centrifugare nuovamente il tubo alla massima velocità per 30 secondi a temperatura ambiente. Quindi, preparare due tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri per condizione. Aggiungere 100 microlitri di PCI a un unico tubo.

Aggiungere 10 microlitri di acetato di sodio trimolare a pH 5.2 e due microlitri di glicogeno ad un altro tubo. Dal tubo estratto dalla centrifuga, disegnare attentamente la fase superiore contenente DNA e aggiungerla al tubo contenente PCI. Vortice vigorosamente e centrifugare il tubo alla massima velocità per 30 secondi a temperatura ambiente.

Successivamente, trasferire la fase superiore al tubo contenente acetato di sodio e glicogeno preparato in precedenza. Aggiungere 250 microlitri di etanolo e mescolare per inversione. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.

Centrifugare il tubo alla massima velocità per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Confermare i pellet sul fondo del tubo. Rimuovere con cura il supernatante in modo da non disturbare il pellet e aggiungere 500 microlitri di 70%etanolo.

Centrifugare il tubo alla massima velocità per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere completamente il supernatante e asciugare il pellet per circa cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 20 microlitri di TE per sciogliere il pellet.

Misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro UV. Dopo la preparazione della cromatina digerita, scongelare tutti i campioni sul ghiaccio. Aggiungere 1200 microlitri del tampone di diluizione ChIP preparato integrato con PIC per diluire la cromatina digerita alla concentrazione di cinque microgrammi per 500 microlitri.

Aggiungere cinque microlitri della cromatina diluita digerita a un tubo a vite da 1,5 millilitri come campione di ingresso. Conservare il campione a meno 80 gradi Celsius. Aggiungere 500 microlitri ciascuno dei cromati digeriti diluiti a un tubo a vite da 1,5 millilitri come campione di immunoprecipitazione.

Aggiungere due microgrammi di anticorpo ad ogni tubo e chiudere il cappuccio. Incubare i tubi a quattro gradi Celsius durante la notte con miscelazione delicata su una piattaforma a dondolo. Al mattino, aggiungere 30 microlitri di perline magnetiche G di grado ChIP a ciascun tubo.

Incubare di nuovo i tubi a quattro gradi Celsius per due ore con miscelazione delicata. Successivamente, ruotare brevemente il tubo a due o 3.000 volte g e posizionare il tubo in un rack in polietilene contenente magneti al neodimio per un minuto. Quindi, rimuovere con cura il supernatante per aspirazione.

Successivamente, aggiungere 0,5 millilitri di tampone di lavaggio complesso immunitario a basso contenuto di sale a ciascun tubo. Vortice brevemente il tubo per disperdere le perline. Incubare il tubo a quattro gradi Celsius per cinque minuti con miscelazione delicata su una piattaforma a dondolo.

Ripetere il lavaggio con complesso immunitario ad alto sale e complesso immunitario al cloruro di litio secondo il manoscritto. Dopo aver rimosso completamente il supernatante rimanente, aggiungere 150 microlitri di tampone di eluizione al tubo. Vortice il tubo per disperdere completamente le perline.

Chiudere il cappuccio e incubare il tubo a 65 gradi Celsius per 30 minuti. Per disperdere accuratamente le perline, mescolare per inversione ogni cinque minuti. Durante l'incubazione, preparare un tubo a vite da 1,5 millilitri e aggiungere sei microlitri di cloruro di sodio molare a cinque molari e due microlitri di proteinasi K.Scongelare il campione di input dell'1% precedentemente preparato sul ghiaccio.

Aggiungere 150 microlitri di tampone di eluizione, sei microlitri di cloruro di sodio molare e due microlitri di proteinasi K al campione di input. Dopo l'incubazione del tubo contenente perline, girare verso il basso. Posizionare il tubo in un rack magnetico per un minuto e trasferire il supernatante al tubo a vite contenente cloruro di sodio e proteinasi K.Le microfotografie rappresentative di pellet di cellule reticolte prima e dopo la sonicazione mostrano differenze distinte.

Senza sonicazione, la struttura cellulare rimane intatta, indicando che la cromatina è presente nei nuclei. Una breve sonicazione rompe la struttura cellulare. La cromatina reticolata è stata preparata da cellule VCaP e digerita con varie quantità di MNasi.

Senza aggiungere MNasi, è apparso un modello di striscio con un peso molecolare molto elevato. L'aggiunta di MNasi ha dato un modello di scala, che mostra che la MNasi digerisce l'internucleosoma. Solo la condizione che ha prodotto frammenti di cromatina fino a 900 bp può essere considerata una corretta digestione, mentre un modello di digestione inappropriato mostra che la sovradigestione ha portato principalmente alla produzione mononucleosoma.

Il modello di digestione della cromatina nelle cellule VCaP indica una corretta digestione della cromatina. La più alta occupazione di H3K4metil3 è stata osservata intorno a 0,5 kilobase e un chilo a monte dell'AR-TSS. Le regioni situate a 19 kilobase e otto kb a monte e 12 kilobase a valle dell'AR-TSS, tuttavia, avevano poca occupazione di H3K4metil3, indicando che queste possono essere utilizzate come regioni negative.

Determinare la condizione di digestione della MNasi è la cosa più importante. Mantenere il numero di cellulare, il volume del buffer e la quantità enzimatica in ogni esperimento. La condizione deve essere identificata per ogni tipo di cella.

Possiamo eseguire il sequenziamento chip per l'occupazione globale dei fattori e le catture di conformazione della cromatina per determinare le interazioni tra lesioni genomiche distali. Questo metodo potrebbe rivelare i meccanismi di processo della trascrizione. Il saggio ChIP è un potente strumento per indagare la regolazione trascrizionale, ma è ingombrante e non riproducibile.

Il nostro metodo incoraggia i ricercatori a eseguire il test in modo semplice e di routine.