Cromatografia a scambio ionico (IEX) accoppiata alla diffusione della luce multi-angolo (MALS) per la caratterizzazione e la separazione delle proteine
5 aprile 2019
Questo protocollo descrive l'uso della cromatografia di scambio ionico ad alta specificità con dispersione della luce multi-angolo per un'accurata determinazione della massa molare di proteine, complessi di proteine e peptidi in un campione eterogeneo. Questo metodo è prezioso per la valutazione di qualità, anche per quanto riguarda la caratterizzazione di oligomeri nativi, carica varianti ed esempi di misto-proteina.
Questo protocollo presenta i MAL a scambio ionico, un nuovo metodo per il controllo e la caratterizzazione della qualità delle proteine, il controllo di qualità che è essenziale per la coerenza e l'integrità dei risultati nella ricerca sulle scienze della vita e nello sviluppo di prodotti farmaceutici. Il MALS a scambio ionico determina la purezza delle proteine, lo stato oligomerico, l'omogeneità, l'identità, la conformazione, la struttura, le modifiche post-traslazione e altre proprietà. Le misurazioni non sono distruttive e vengono effettuate in soluzione in condizioni tampone quasi fisiologiche.
Questo metodo determina con precisione la massa molare di proteine o peptidi, lo stato oligomerico e il grado di coniugazione, ad esempio le glicoproteine. Può anche essere applicato alle proteine di membrana. IEX separa le macromolecole dalla loro carica superficiale.
Lo scambio di anion, AIEX e lo scambio di cationi, CIEX, le matrici si legano rispettivamente in modo negativo e positivo. Con una netta separazione tra popolazioni proteiche che condividono una massa o una forma relativamente vicina, IEX-MALS determina con successo la massa molare di ogni singolo stato proteico in un campione di miscela. Per iniziare, utilizzare un filtro da 0,1 micrometri per filtrare tutti i reagenti, inclusi i tamponi di lavaggio ed eluizione.
Filtrare i primi da 50 a 100 millilitri di tampone in una bottiglia di scarto per eliminare il particolato dai filtri a secco. In una bottiglia pulita e sterile che è stata lavata accuratamente con acqua filtrata e tamponata per evitare che la polvere entri, filtrare il resto del tampone. Con pH-otto Tris buffer e cloruro di sodio 50 millimolare, diluire un campione di BSA a sei milligrammi per millilitro in modo che il pH e la forza ionica consentano il legame alla colonna di scambio ionico.
Utilizzare una siringa per iniettare almeno da 0,3 a 0,5 milligrammi di BSA in una colonna da un millilitro per ottenere un'analisi MALS di buona qualità. Per avviare un esperimento MALS a scambio ionico, aprire New, Experiment from Method nel software MALS e selezionare il metodo online dalla cartella light scattering dei metodi di sistema. Se il modulo DLS è disponibile e i dati DLS devono essere acquisiti, selezionare il metodo online dalla sottocartella Light Scattering, With QELS.
Per impostare i parametri, nella sezione Configurazione impostare innanzitutto la portata dell'esecuzione nella sezione Pompa generica sulla portata utilizzata nell'FPLC come 1,5 millilitri al minuto. Nella sezione Solvente immettere o verificare i parametri tampone. Sotto la sezione Iniettore, immettere il nome della proteina come BSA, l'incremento dell'indice di rifrazione come 0,185 millilitri per grammo e il coefficiente di estinzione UV alla lunghezza d'onda di 280 nanometri come 0,66 litri per grammo per centimetro.
Nella scheda Campione immettere la concentrazione del campione proteico come sei milligrammi per millilitro, quindi inserire il volume del campione per iniezione anche come 170 microlitri. Nella scheda Raccolta di base della sezione Procedure selezionare la casella di controllo Trigger sull'applicazione automatica e impostare la durata dell'esecuzione su 70 millilitri in modo che la raccolta dei dati venga continuata per almeno cinque minuti dopo che la sfumatura ha raggiunto il valore finale. Quindi, nel software FPLC, creare un nuovo esperimento nella scheda Editor metodi.
Per l'esperimento iniziale, creare un gradiente lineare di sale o pH, mentre per il metodo ottimizzato creare un gradiente più specifico o un programma graduale secondo il manoscritto. Includere un segnale di impulso nel metodo che attiverà la raccolta dei dati nel software MALS. Quindi, aprire la valvola della pompa e lavare con idrossido di sodio 0,5 molare per rimuovere le impurità fortemente legate, seguito da un lavaggio tampone di neutralizzazione.
Quindi, lavare la colonna con tris buffer pH otto, la valvola A con tampone di lavaggio e la valvola B con tampone di eluizione. Utilizzare il tampone di lavaggio con la bassa concentrazione di sale come lavaggio finale per risciacquare la colonna, per consentire il legame della proteina alla matrice della colonna. Prima dell'iniezione del campione, dopo il lavaggio e al termine dell'eluizione, la linea di base di dispersione della luce deve essere stabilizzata per garantire un basso rumore e una diluizione completamente pura.
Usando una siringa, posizionare il campione proteico nel ciclo. Avviare l'esperimento prima nel software MALS cliccando sul pulsante Esegui e poi nel software FPLC. I dati saranno raccolti dopo aver ricevuto il segnale di impulso dallo strumento FPLC tramite il rilevatore MALS.
Se il MALS a scambi ionici viene eseguito manualmente con una modalità di flusso continuo anziché con un metodo autonomo, applicare gli stessi parametri dell'esecuzione e le stesse istruzioni descritte in precedenza. Una volta che il metodo finale è stato verificato ed eseguito, eseguire esattamente lo stesso metodo utilizzando un'iniezione vuota caricando il buffer anziché l'esempio. È importante che la temporizzazione tra l'impulso di iniezione automatica e la sfumatura della corsa vuota sia identica a quella dell'esecuzione del campione.
Per iniziare l'analisi, nella sezione Procedure del software MALS, utilizzare la scheda Despiking e il livello Normale per smussare i cromatogrammi. Se mostrano molto rumore, imposta il livello su Pesante. Nella vista Baseline definire la linea di base per tutti i segnali, inclusi i rivelatori LS, UV e RI.
Nella vista Picchi definire i picchi per l'analisi. Verificare i valori corretti del valore di incremento RI dn/dc e del coefficiente di estinzione UV per la proteina sotto ogni picco. Sotto la vista Massa molare e Raggio dalla vista Dispersione luce, analizzate la massa molare e il raggio utilizzando il modello Zimm e il grado di adattamento pari a zero.
Se QELS è disponibile, sotto la vista Rh da QUELS, osservare i valori Rh e la qualità di adattamento della funzione di correlazione. Il segnale RI cambia significativamente durante la corsa MALS a scambio ionici a causa dell'aumento della concentrazione di sale. Per sottrarre il segnale di base dall'iniezione in bianco, aprire sia la proteina che gli esperimenti MALS a scambio ionica vuoto.
Fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome dell'esperimento proteico, scegliere Applica metodo e scegliere la cartella Sottrazione baseline dalla finestra di dialogo del file. Selezionare il metodo online per l'analisi standard della massa molare. Nella visualizzazione Sottrazione baseline fare clic su Importa vuoto per importare i segnali dell'esecuzione vuota.
In Strumenti controllare tutti i rilevatori da sottrarre. Per calibrare il sistema MALS a scambio ionica con monomero BSA, in visualizzazione Procedure e configurazione, allineare i picchi. Nella vista Normalizzazione immettere 3,0 nanometri come valore Rg per eseguire la normalizzazione.
Quindi, in Allargamento banda nella stessa scheda Configurazione, scegliere il picco e utilizzare il pulsante Esegui adattamento per abbinare i segnali UV e LS al segnale RI. Il grafico dei risultati viene visualizzato nella vista Raccordo risultati (Results Fitting). Modificare le scale dell'asse e altri parametri del grafico facendo clic con il pulsante destro del mouse sul grafico, selezionando Modifica e quindi facendo clic sul pulsante Avanzate.
Per avere più opzioni di visualizzazione, selezionate la scheda Grafico EASI e nella parte superiore della finestra del menu a discesa Visualizza (Display), selezionate Massa molare (Molar Mass) o Rh Q.Tutti i risultati (Rh Q.All), inclusi massa molare, raggio, livello di purezza e altri, sono disponibili nella vista Report nella sezione Risultati. Utilizzare il pulsante Progettazione report per aggiungere altri risultati o parametri, nonché figure, al report. In questo esperimento, la BSA è stata analizzata su MALS a scambio ionici usando una colonna analitica di scambio ionici.
I cromatogrammi mostravano l'UV a 280 nanometri, la diffusione della luce ad un angolo di 90 gradi, l'indice di rifrazione e le curve di conducibilità insieme alla massa molare di ogni picco. Un ampio gradiente lineare costituito da 30 volumi di colonna da 75 millimolare a cloruro di sodio 350 millimolare separava i monomeri BSA dai dimeri e dagli oligomeri più alti. L'analisi MALS a valle ha portato ad una massa molare monomero calcolata di 66,8 kilodalton e ad una massa molare dimero calcolata di 130 kilodalton.
Basato sulla conducibilità tampone ai picchi elusi, il gradiente è stato cambiato in un programma diverso, un lungo passo di cloruro di sodio 175 millimolare, seguito da un gradiente lineare da 175 millimolare a 500 millimolare cloruro di sodio. Il nuovo gradiente migliorò notevolmente la risoluzione e produsse un'eccellente separazione tra monomero BSA e specie oligomeriche superiori. Un programma graduale di cloruro di sodio da 200 millimolare e 250 millimolare è stato applicato per concentrarsi anche sulle specie ad alto oligomerico.
Ha portato ad un'eccellente separazione tra monomero BSA, dimero e trimer. Seguendo questa procedura, metodi come la spettrometria di massa, l'attività SDS-PAGE e i test di stabilità possono essere eseguiti su ogni variante separata dallo scambio ionica per identificare e caratterizzare ulteriormente ciascuno di essi. Abbiamo scoperto che mals a scambio ionica estende la potenza dell'analisi MALS a campioni che non possono essere completamente analizzati da SEC-MALS.
La separazione per carica risolve specie distinte che coelevano in SEC.
Panoramica
Questo protocollo presenta la cromatografia a scambio ionico con diffusione della luce a multiangolo (IEX-MALS) per la determinazione accurata della massa molare di proteine e peptidi. È essenziale per il controllo di qualità e la caratterizzazione nelle scienze della vita e nello sviluppo farmaceutico.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Chimica clinica
- Analisi delle proteine
- Sviluppo farmaceutico
Sfondo
- IEX-MALS è un metodo innovativo per la valutazione della qualità delle proteine.
- Determina diverse proprietà come purezza e stato oligomerico.
- Il metodo è non distruttivo e opera in condizioni fisiologiche.
- È in grado di analizzare miscele complesse di proteine e peptidi.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per la caratterizzazione delle proteine.
- Garantire coerenza e integrità nei risultati della ricerca.
- Facilitare l'analisi di glicoproteine e proteine di membrana.
Metodi Utilizzati
- La cromatografia a scambio ionico separa le proteine in base alla carica superficiale.
- La diffusione della luce a multiangolo misura la massa molare in soluzione.
- L'allestimento sperimentale include il filtraggio dei reagenti e la preparazione dei tamponi.
- La raccolta dei dati prevede configurazioni specifiche del software per l'analisi.
Risultati principali
- Il metodo determina con precisione la massa molare e gli stati oligomerici.
- Separisce efficacemente popolazioni proteiche con caratteristiche simili.
- La stabilizzazione della linea di base è fondamentale per dati affidabili.
- I risultati possono essere analizzati per diverse proprietà delle proteine.
Conclusioni
- IEX-MALS è uno strumento prezioso per la caratterizzazione delle proteine.
- Il metodo migliora il controllo di qualità nei prodotti biotecnologici.
- Fornisce informazioni sulla struttura e sulle modifiche delle proteine.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La cromatografia a scambio ionico abbinata alla diffusione della luce a multiangolo (IEX-MALS) consente una separazione precisa e la caratterizzazione della massa molare di varianti proteiche che eluiscono contemporaneamente nei metodi di esclusione dimensionale, risolvendo una lacuna critica nel controllo qualità dei prodotti biofarmaceutici. Risolvendo le specie oligomeriche in base alla carica superficiale, l'IEX-MALS supporta la riduzione del rischio meccanicistica delle proteine terapeutiche e aumenta la fiducia predittiva nelle valutazioni precoci della sviluppabilità. Questo metodo offre un valore traslazionale fornendo dati ortogonali su purezza, omogeneità e modifiche post-traduzionali in condizioni prossime a quelle fisiologiche, informando direttamente la selezione del composto leader e la strategia formulativa.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi degli stati oligomerici delle proteine e delle loro varianti di carica per chiarire le relazioni struttura-funzione nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Fornisce dati quantitativi sulla massa molare delle singole specie proteiche in miscele, supportando campagne di screening guidate da ipotesi.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce una separazione risolta alla baseline di popolazioni proteiche con massa o dimensione simili, consentendo una quantificazione accurata di monomero, dimero e oligomeri superiori.
- Valore operativo: Genera profili di separazione basati sulla carica riproducibili, compatibili con sistemi FPLC automatizzati per l'analisi ad alto rendimento di varianti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Valuta l'omogeneità proteica e lo stato di coniugazione (ad esempio, glicoproteine) in condizioni di soluzione che preservano la conformazione nativa, supportando la valutazione di sviluppabilità preclinica.
- Valore operativo: Produce dati ortogonali complementari rispetto alla SEC-MALS, aumentando la fiducia nella coerenza da lotto a lotto durante lo sviluppo del processo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
IEX-MALS si inserisce nel continuum dalla scoperta alla fase preclinica come strumento di caratterizzazione che segue l'espressione e la purificazione iniziali, permettendo decisioni informate prima di impegnarsi nell'ottimizzazione del lead o negli studi di formulazione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi risolvendo le varianti di carica e le forme oligomeriche che potrebbero influenzare l'interazione con il bersaglio o la stabilità.
- Screening: Fornisce frazioni proteiche purificate pronte per il saggio, con massa molare definita, per analisi successive di legame o attività.
- Analisi: Fornisce massa molare, raggio di girazione e parametri di purezza ottenuti da rilevatori a dispersione della luce e ad indice di rifrazione, per analisi comparative tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Permette la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica caratterizzando attributi critici di qualità come l'aggregazione e la glicosilazione.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come metodo di piattaforma riutilizzabile, applicabile a diversi bersagli proteici, inclusi anticorpi monoclonali, enzimi e proteine di membrana.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica distinguendo le specie co-eluite mediante separazione basata sulla carica e determinazione della massa molare assoluta.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità del metodo attraverso protocolli standardizzati di preparazione dei tamponi, stabilizzazione della linea di base e sottrazione del bianco.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto fornendo precocemente informazioni sulle impurezze correlate al prodotto e sull'eterogeneità conformazionale.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati in base al rischio, basandosi su una caratterizzazione ortogonale di purezza, stato oligomerico e profili di varianti di carica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in cromatografia, teoria della diffusione della luce e analisi dei dati mediante adattamento del modello di Zimm.
- Presuppone l'accesso a sistemi FPLC abbinati a rivelatori MALS, DLS e ad indice di rifrazione, insieme a colonne appropriate (ad esempio, a scambio anionico).
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda la filtrazione dei tamponi, la preparazione dei campioni e la programmazione dei gradienti, al fine di garantire la riproducibilità.
- Comporta considerazioni di adattamento in base alle diverse proprietà delle proteine, come la regolazione dei gradienti di pH e di sale per risolvere specifiche varianti di carica.
- Comprende limitazioni pratiche, come la necessità di stabilizzazione della linea di base e sottrazione del bianco per correggere la deriva del segnale RI durante i gradienti di sale.
