In tempo reale In Vitro monitoraggio dell'attivazione del recettore Odorant da un Odorant in fase gassosa

Il nostro protocollo consente di misurare il rilevamento e la discriminazione degli odori volatili con un pannello di recettori odoranti. Questo metodo apre la possibilità di sviluppare biosensori a base di recettore degli odori. Questa tecnica consente il monitoraggio in vitro in tempo reale dell'attivazione del recettore degli odori sulle molecole odoranti in fase di vapore.

Colma il divario tra approcci in vitro e in vivo. Questo metodo può essere utilizzato per comprendere la cinetica degli eventi che portano alla percezione degli odori, incluso il ruolo degli enzimi metabolici mucosi. Per iniziare, preparare M10 e M10 PSF secondo il manoscritto.

Le cellule sono coltivate in 10 millilitri di PSF M10 a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Osserva il piatto della coltura al microscopio a contrasto di fase. Quando raggiunge il 100% di confluenza, dividere le cellule a una concentrazione inferiore aspirando il supporto e lavando delicatamente le cellule con 10 millilitri di PBS.

Quindi aspirare il PBS e aggiungere tre millilitri di tripside-EDTA. Lasciare che reagisca per circa un minuto fino a quando le cellule si dissociano dal piatto. Aggiungere cinque millilitri di M10 per inattivare la tripina e pipettare su e giù per staccare le celle attaccate al piatto.

Trasferire gli otto millilitri di sospensione cellulare dal piatto a un tubo da 15 millilitri e centrifugare il tubo a 200 volte G per cinque minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in cinque millilitri di PSF M10 tubazione su e giù per rompere qualsiasi massa cellulare. Evitare di creare bolle nel tubo.

Per ottenere il 20% di confluenza di cellule, aggiungere nove millilitri di PSF M10 in un nuovo piatto di coltura cellulare da 1.000 millimetri e trasferire un millilitro della soluzione cellulare risosopensa. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Questo piatto, seduto al 20% di confluenza, raggiungerà il 100% di confluenza in 48 ore.

Posizionare il piatto sotto un microscopio a contrasto di fase da osservare. Prendi 1/10 del piatto di coltura di confluenza cellulare al 100%. Aspirare il supporto e lavare delicatamente le cellule con 10 millilitri di PBS.

Quindi trattare le cellule con tripsiderina-EDTA e M10, centrifugare e trattare di nuovo con M10 PSF come precedentemente eseguito. Per realizzare una piastra da 96 porri, aggiungere 500 microlitri dai cinque millilitri di cellule rimostrate a 5,5 millilitri di PSF M10 freschi. Mescolare le celle e M10 PSF senza generare bolle d'aria.

Pipetta 50 microlitri delle celle sospese diluite in ogni pozzo della piastra da 96 pozza utilizzando una pipetta multicanale. Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. In primo luogo, posizionare la piastra a 96 pozzetti coltivata durante la notte sotto un microscopio a contrasto di fase, osservare la confluenza cellulare e assicurarsi che sia compresa tra il 30% e il 50%Preparare una prima miscela di trasfezione in un tubo da 1,5 millilitri che contiene i plasmidi comuni all'intera piastra secondo il manoscritto.

Rho-pCi è un controllo negativo vettoriale vuoto, e Olfr1377 è un controllo positivo noto per rispondere all'acetofenone odorante testato. Dividere il mix in due miscele di trasfezione contenenti uno dei plasmidi di controllo. Preparare un secondo mix di trasfezione contenente 500 microlitri di MEM e 20 microlitri di lipofectamina 2000 reagente.

Aggiungere bene metà del secondo mix a ciascun serbatoio e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Incubare il tubo per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere cinque millilitri di M10 per una piastra da 96 po'.

Aggiungere bene 2,5 millilitri in ogni serbatoio e mescolare delicatamente. Sostituire l'M10 PSF nella piastra da 96 po' placcata in precedenza con 50 microlitri del supporto di trasfezione finale. Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Quindi aprire la porta del luminometro e inserire il tubo collegato alla pompa per vuoto. Aspirare la camera del luminometro durante la notte. Dopo la trasfezione, osservare la piastra a 96 porri sotto un microscopio a contrasto di fase per assicurare una confluenza cellulare tra il 60% e il 100%Preparare la soluzione di stimolazione della soluzione di sale bilanciato di Hank contenente 10 millimolare di HEPES e cinque millimolare di D-glucosio.

Rimuovere il mezzo di trasfezione dalla piastra da 96 po 'e lavare le cellule aggiungendo 50 microlitri di soluzione di stimolazione fresca ad ogni pozzo. Per diluire la soluzione di reagente GloSensor cAMP, pipettare 2,75 millilitri della soluzione di stimolazione in un tubo da cinque millilitri e aggiungere 75 microlitri della soluzione reagente cAMP. Rimuovere la soluzione di stimolazione dai pozzi e aggiungere 25 microlitri di soluzione reagente cAMP diluita ad ogni pozzo.

Incubare la piastra di 96 po 'a temperatura ambiente in un ambiente buio e privo di odori per due ore. In primo luogo, diluire l'acetofenone odorante all'1% in 10 millilitri di olio minerale e limitare il tubo. Prima della fine del tempo di incubazione del reagente cAMP, aggiungere 25 microlitri della soluzione di odorante ad ogni pozzo in una nuova piastra da 96 porri.

Quindi posizionare questa piastra odorante nella camera del luminometro per cinque minuti per equilibrare la camera con molecole di odoro volatili. Impostare il luminometro per registrare la luminescenza con zero secondi di ritardo durante 20 cicli di misurazione della piastra di 90 secondi, con 0,7 secondi di intervallo tra i cicli. Poco prima di leggere la piastra, rimuovere la piastra odorante dalla camera.

Nella piastra da 96 porri contenente le cellule trasfette, aggiungere 25 microlitri di odorante nello spazio tra i pozzi e rimettere rapidamente la piastra nella camera. Avviare la misurazione della luminescenza di tutti i pozzi per 20 cicli entro 30 minuti. Dopo la misurazione della luminescenza, rimuovere l'odore rimanente all'interno del luminometro aspirando ampiamente gli odori nella camera di lettura per almeno due ore.

Sostituire con aria fresca inviando aria compressa per cinque minuti prima di incubare l'odore successivo per evitare la contaminazione incrociata dei volatili dell'odore. Per iniziare l'analisi dei dati, esportare i dati dal software del luminometro. Mediare le repliche dello stesso OR per ogni tempo di registrazione.

Per calcolare la risposta OR normalizzata a qualsiasi controllo finale, dividere il valore medio vettoriale vuoto nel valore medio OR ad ogni tempo di registrazione. Normalizzare ogni risposta OR alla propria attività basale dividendo la risposta OR media a zero secondi per ogni risposta di tempo di registrazione. Per ottenere un singolo valore di risposta OR per la curva di ogni OR, sommare tutti i valori di luminescenza di ogni tempo di registrazione per ogni OR al fine di ottenere l'area sotto la curva.

In questo esperimento, l'attivazione in tempo reale delle RO dei topi su stimolo odorante al vapore è stata monitorata su 20 cicli di misurazione. Un controllo vettoriale vuoto è stato utilizzato per garantire che le attività indotte da odori delle RO testate fossero specifiche. I dati per ogni pozzo sono stati prima normalizzati al valore medio di controllo vettoriale vuoto per ogni ciclo.

Quindi, per confrontare le diverse risposte delle RO, i dati sono stati normalizzati ai livelli di OR di attività basale in questo saggio. I valori di attivazione singola per ogni OR sono stati calcolati calcolando l'area sotto la curva per ogni OR sommando i valori di emissione di tutti i cicli di misurazione. Inoltre, le risposte dose-dipendenti possono essere misurate utilizzando dosi di odori crescenti.

È stata registrata la risposta di Olfr1377 alla stimolazione dell'acetofenone a cinque concentrazioni. Solo le tre concentrazioni più elevate sono state in grado di attivare Olfr1377. La stimolazione del composto puro mostra una tendenza a diminuire la risposta or nel tempo, probabilmente a causa della tossicità cellulare.

Durante il passaggio, è necessario aggiungere l'odore diluito tra il pozzo ed essere preparati ad avviare rapidamente la registrazione della piastra. Il tempo tra l'aggiunta di odori e il monitoraggio dovrebbe essere ridotto al minimo e costante tra due esperimenti. Nelle cellule atri ci sono materiale rischioso, quindi ricorda di smaltire le cellule nei dispensari appropriati.