Microscopia di imaging iperspettrale di eccitazione-scanning per discriminare in modo efficiente i segnali di fluorescenza
22 agosto 2019
L'imaging spettrale è diventata una soluzione affidabile per l'identificazione e la separazione di più segnali di fluorescenza in un singolo campione e può facilmente distinguere i segnali di interesse dallo sfondo o dall'autofluorescenza. L'imaging iperspettrale a scansione dell'eccitazione migliora questa tecnica diminuendo il tempo necessario di acquisizione dell'immagine aumentando contemporaneamente il rapporto segnale-rumore.
Questo protocollo è significativo in quanto descrive un metodo che può essere utilizzato per separare diversi segnali fluorescenti in un singolo campione. Rispetto ai metodi tradizionali, l'eccitazione-scansione può aumentare la velocità dell'esperimento e migliorare la sensibilità dei dati. Utilizzando diverse fonti di illuminazione come un laser supercontinuo, questo metodo può essere applicabile ai sistemi di microscopio confocale a scansione laser o disco rotante.
Quando si eseguono scansioni di eccitazione, microscopia a imaging spettrale, è importante verificare che il picco di eccitazione di ogni etichetta fluorescente si verifichi a una lunghezza d'onda diversa. Per iniziare, impostare un microscopio a fluorescenza invertito e una fotocamera come descritto nel protocollo di testo. Quindi caricare il campione sul palco.
Dal menu a discesa della finestra principale del micromanager, selezionare 475 nanometri per la visualizzazione iniziale del campione. Quindi fare doppio clic nella casella accanto all'esposizione e immettere 100 per impostare il tempo di esposizione su 100 millisecondi. Infine, fai clic dal vivo per visualizzare l'esempio.
Ora clicca su Auto. Pulsante dell'intervallo di visualizzazione dell'intensità automatica per portare i valori minimo e massimo in intervalli visivi significativi. Quindi, utilizzare le manopole di messa a fuoco del microscopio per mettere a fuoco il campione.
Una volta messa a fuoco, regolare la posizione del campione in modo che il bordo si trova al centro del campo visivo. Quindi mettere a punto la messa a fuoco. L'esempio è a fuoco quando le caratteristiche del bordo nell'immagine appaiono nitide.
Ora, apri lo strumento di acquisizione multidimensionale. Nel menu, fate clic sul pulsante di caricamento e scegliete un'impostazione preimpostata contenente un intervallo di lunghezze d'onda appropriato per l'acquisizione spettrale. Una volta confermate le impostazioni di acquisizione, spostarsi in un'area vuota del campione e fare clic su acquisisci per raccogliere uno stack di immagini spettrali contenente sfondo e rumore da utilizzare per la sottrazione in un secondo momento.
Quindi, spostati sul campione per trovare le regioni più luminose. È probabile che i campioni abbiano una fluorescenza più intensa lontano dal bordo del campione. Una volta posizionata la regione più luminosa, prendi una singola pila di immagini.
Carica l'immagine acquisita nell'immagine J e usa la funzione di misura di Image J per confermare che nessuna lunghezza d'onda contiene pixel sovraesposti. Se è necessario un tempo di esposizione ridotto a causa della sovraesposizione, l'immagine di sfondo deve essere riascritta anche con un nuovo tempo di esposizione. Se è stato rilevato che una delle immagini contiene il limite di rilevamento verso l'alto della fotocamera, regolare il tempo di esposizione della scansione spettrale per garantire che il segnale massimo in tutto l'intervallo spettrale non superi l'intervallo dinamico della fotocamera.
Con un tempo di esposizione adeguato ora determinato, posizionare un campione senza etichetta sul palco. Acquisire dati di immagine spettrale dal campione senza etichetta per determinare se esiste un'autofluorescenza sottostante. Quindi, posizionare un campione con etichetta singola sul palco.
Acquisire dati di immagine spettrale da ciascuno dei campioni con etichetta singola da utilizzare come controlli spettrali per costruire una libreria spettrale. Eseguire la scansione per ogni campione di controllo utilizzando un intervallo di lunghezze d'onda identico, il tempo di esposizione e le impostazioni della fotocamera. Quindi, posizionare una diapositiva contenente il campione sperimentale al microscopio.
Selezionare un campo visivo con celle etichettate in modo appropriato e acquisire i dati dell'immagine spettrale dall'esempio utilizzando le impostazioni di acquisizione determinate. Correggere le immagini a una risposta spettrale piatta sottraendo lo spettro di sfondo dall'immagine campione e moltiplicando l'immagine per il coefficiente di correzione. Qui, uno script MATLAB viene utilizzato per elaborare rapidamente le immagini.
Quindi, generare la libreria spettrale. Per ottenere i migliori risultati, normalizzare ogni membro finale alla banda di lunghezza d'onda della massima intensità determinando quale banda di lunghezza d'onda ha il valore più intenso e dividendo la misurazione ad ogni banda di lunghezza d'onda per quel valore massimo. Quindi salvare i dati spettrali come file dat.
Al termine, unmix i dati dell'immagine spettrale. Il passaggio di unmixing genererà un'immagine di abbondanza per ogni etichetta fluorescente, dove l'abbondanza è la quantità di segnale fluorescente relativo nell'immagine dall'etichetta prospettica. Quindi, apri ogni immagine non mixed per ispezionare visivamente la distribuzione dei componenti puri.
Confrontare la grandezza dell'immagine di errore con quella delle immagini non mixate. Se la grandezza dell'immagine di errore è simile alle immagini di abbondanza non mixed, i segnali nei dati dell'immagine spettrale potrebbero non essere accuratamente contabili. Infine, verificare che non vi siano strutture residue non identificate confrontando l'immagine di errore con le immagini non mixate.
Se eseguito correttamente, il processo di unmixing spettrale consente la separazione di una pila di immagini spettrali nei rispettivi contributi da ogni etichetta di fluorescenza. Qui, un set di immagini spettrali non mixed con singole immagini che evidenziano l'autofluorescenza liscia delle cellule muscolari delle vie aeree, una sonda GCaMP e un'etichetta mitocondriale. Vi è un elevato errore associato alle regioni nucleari e perinucleari delle cellule che indica che gli spettri misurati di tali regioni non sono ben contabiliggiati dagli spettri della biblioteca spettrale.
Gli spettri puri raccolti da cellule etichettate che sono anche autofluorescenti probabilmente contamineranno il profilo spettrale per il componente puro. Qui, si può vedere la differenza di unmixing con spettri puri contaminati da autofluorescenza, rispetto agli spettri puri corretti dopo la sottrazione scalata. Una corretta acquisizione dei dati è essenziale quando si diagnosticano campioni sensibili in quanto possono sopravvivere solo a una singola sessione di imaging a differenza dello sfondo e dei controlli che possono essere ricreati.
Assicurarsi che le impostazioni hardware e di acquisizione corrette siano predeterminate il più possibile. Come passo successivo, i video creati da dati time-lapse acquisiti utilizzando questo sistema possono essere utilizzati per tracciare le sorgenti fluorescenti in luoghi discreti nel tempo come la localizzazione del secondo segnale messenger. Prestare attenzione quando si utilizzano potenti sorgenti luminose per evitare l'esposizione agli occhi.
Inoltre, assicurati di indossare guanti adeguati quando maneggia etichette biologiche.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per separare segnali fluorescenti multipli in un singolo campione mediante imaging iperspettrale con scansione dell'eccitazione. Questa tecnica aumenta la velocità degli esperimenti e migliora la sensibilità dei dati rispetto ai metodi tradizionali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microscopia a fluorescenza
- Tecniche di imaging
- Elaborazione del segnale
Sfondo
- I segnali di fluorescenza possono essere difficili da distinguere a causa del rumore di fondo.
- I metodi tradizionali di imaging possono essere lenti e meno sensibili.
- L'imaging iperspettrale con scansione dell'eccitazione offre una soluzione a queste sfide.
- Possono essere utilizzate diverse sorgenti di illuminazione per ottenere risultati migliori.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per separare segnali di fluorescenza multipli.
- Aumentare la velocità e la sensibilità degli esperimenti di imaging a fluorescenza.
- Dimostrare l'applicabilità di questo metodo a diversi sistemi di microscopia.
Metodi Utilizzati
- Configurazione di un microscopio a fluorescenza invertito e della telecamera.
- Utilizzo di un laser supercontinuo come sorgente di illuminazione.
- Caricamento dei campioni sullo stage del microscopio.
- Verifica dei picchi di eccitazione a diverse lunghezze d'onda per ogni marcatore fluorescente.
Risultati principali
- La scansione di eccitazione con imaging iperspettrale riduce significativamente il tempo di acquisizione.
- Il rapporto segnale-rumore migliorato potenzia la qualità dei dati.
- Il metodo è adattabile a sistemi confocali a disco rotante o a scansione laser.
- È stata dimostrata una separazione efficace di segnali fluorescenti multipli.
Conclusioni
- L'imaging iperspettrale con scansione di eccitazione è uno strumento prezioso per i ricercatori.
- Questo metodo può portare a un imaging fluorescente più efficiente e sensibile.
- Applicazioni future potrebbero estendersi a diversi campi della ricerca biologica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'imaging iperspettrale con scansione dell'eccitazione affronta un collo di bottiglia fondamentale nei flussi di lavoro di scoperta basati sulla fluorescenza: l'incapacità di risolvere rapidamente e con elevata sensibilità segnali sovrapposti provenienti da più sonde in campioni biologici complessi. Migliorando la velocità di acquisizione e il rapporto segnale-rumore, questo metodo aumenta l'affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi e nella riduzione del rischio meccanicistico, in particolare negli screening fenotipici in fase iniziale in cui la separazione dei segnali è fondamentale. La compatibilità con piattaforme microscopiche standard favorisce un'integrazione scalabile nei flussi di imaging aziendali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'interrogazione di ipotesi terapeutiche isolando i segnali di fluorescenza provenienti da sonde distinte, chiarificando il coinvolgimento delle vie e la specificità del bersaglio.
- Valore operativo: Riduce l'ambiguità meccanicistica attraverso la separazione spettrale, supportando la validazione funzionale del bersaglio mediante deconvoluzione quantitativa del segnale.
- Valore predittivo: Migliora la fiducia nell'identificazione dei composti promettenti riducendo i falsi positivi derivanti dall'overlap spettrale o dall'interferenza della autofluorescenza.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per lo screening successivo generando librerie spettrali che garantiscono letture riproducibili e quantitative.
- Scalabilità: Consente il riutilizzo della piattaforma in diversi progetti attraverso flussi di lavoro standardizzati di acquisizione e separazione spettrale, riducendo il tempo necessario per lo sviluppo di nuovi saggi.
- Output quantitativo: Genera immagini di abbondanza per ciascun fluorocromo, permettendo un confronto preciso dell'intensità del segnale tra diverse condizioni ai fini della selezione dei risultati positivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Mantiene la fedeltà del segnale dalla fase di scoperta attraverso i modelli preclinici correggendo l'autofluorescenza e la contaminazione spettrale.
- Avanzamento basato sul rischio: Supporta decisioni di proseguimento o interruzione fornendo dati di canale puliti e non sovrapposti che riflettono il vero segnale biologico piuttosto che artefatti.
- Riduzione del rischio meccanicistica: Isola i segnali provenienti da organelli o compartimenti (ad esempio, mitocondri, citosol) per validare l'interazione con il bersaglio in sistemi rilevanti per la malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino all'ottimizzazione del composto attivo, in cui letture multiplex di fluorescenza vengono utilizzate per valutare il meccanismo d'azione, la tossicità e la modulazione del percorso metabolico. Permette un passaggio affidabile tra i team di biologia e di analisi fornendo output di imaging standardizzati e quantificabili.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi risolvendo i segnali provenienti da più marcatori (ad esempio GCaMP, colorante mitocondriale, autofluorescenza) nell'immagine di cellule vive.
- Screening: Migliora la prontezza del saggio attraverso l'acquisizione spettrale riproducibile e la sottrazione del fondo, aumentando il fattore Z e la sicurezza nell'identificazione dei risultati positivi.
- Analisi: Fornisce mappe di abbondanza separate e metriche di errore che consentono il confronto statistico dei contributi dei fluorocromi tra gruppi sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla validazione preclinica assicurando che i segnali di fluorescenza utilizzati come biomarcatori non siano alterati da interferenze spettrali o da autofluorescenza.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una libreria spettrale centralizzata e una procedura operativa standard (SOP) per l'acquisizione iperspettrale, promuovendo la coerenza tra progetti e riducendo lo sviluppo ridondante di metodi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità spettrale e migliorando la fedeltà del segnale.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la produttività grazie a un'acquisizione più rapida e a una calibrazione standardizzata mediante illuminazione supercontinua.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo di ottenere più dati per campione e riducendo le ripetizioni di imaging dovute a una scarsa separazione del segnale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio fornendo dati di imaging più puliti e interpretabili per le fasi decisionali tra scoperta e stadi preclinici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a fluorescenza, imaging spettrale e strumenti di elaborazione delle immagini come ImageJ e MATLAB.
- Dipende da sorgenti di illuminazione regolabili (ad esempio, laser supercontinuo) e da rivelatori dotati di dinamica e sensibilità sufficienti.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le impostazioni di acquisizione, i tempi di esposizione e la generazione di librerie spettrali, al fine di ottenere risultati riproducibili.
- Deve tenere conto della autofluorescenza nei campioni biologici, richiedendo misure di controllo e sottrazione spettrale per evitare contaminazione degli spettri delle singole componenti pure.
- È limitato dai rischi di fototossicità nelle applicazioni su cellule vive, richiedendo una gestione accurata dell'esposizione per preservare la vitalità del campione durante l'acquisizione.
