Name: Modellare il cancro al seno tramite uniniezione intraduttiva di adenovirus che esprime la creminazione nella ghiandola mammaria del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Impara a modellare il cancro al seno tramite iniezione intraduttale di adenovirus Cre nella ghiandola mammaria del topo. Questo metodo consente la manipolazione specifica di eventi oncogenici in modo controllato e riduce la necessità di complesse strategie di allevamento.

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Questo lavoro è stato supportato dalla concessione R01 CA222560 dei National Institutes of Health (NIH) e dal Department of Defense Breakthrough Award W81XWH-18-1-0037.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) di Brigham e Women's Hospital.
1. Generazione e manutenzione di topi sxed
<ol><li>Ottenere il knockout condizionale flossed rilevante per il cancro al seno (ad esempio, Trp53tm1Brn [noto come Trp53L/L], Brca1tm1Aash [Brca1L/L]) o linee di topo knock-in condizionali (ad esempio, Gt(ROSA)26Sortm1(Pik3ca-H1047R)Egan) dal repository del Jackson Laboratory (JAX) o del NCI Mouse Models of Human Cancer Consortium (MMHCC). Inoltre, per facilitare la ricerca di MEC che subiscono una ricombinazione mediata da Cre, una linea condizionale Cre-reporter può essere ottenuta anche da JAX (ad esempio, Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos [indicato come R26Y]).</li>
	<li>Alleva topi omozygosi Trp53L/L con topi reporter omozici R26Y o con topi omozici che trasportano gli alleluci del reporter R26Y e qualsiasi ulteriore knockout condizionale scisso o alleli knock-in per diversi modelli murini, per ottenere la progenie maschile e femminile di F1.</li>
	<li>I topi maschi e femmine intercross ehetozigous F1 per ottenere topi femminili composti F2 che sono omozici per ogni allele (come topi sperimentali), così come le femmine omozygous R26Y-solo omozygous (come topi di controllo). I topi Genotipo F2 basati sui primer PCR e sulle condizioni di ciclismo elencati di seguito, impostando due reazioni PCR standard da 20 ll (utilizzando Taq 5X Master Mix) in due diversi tubi PCR, uno con i primer R26Y e l'altro con il Trp53L primer. Utilizzare topi adulti (in genere tra i 2 e i 4 mesi) per tutti gli allevamenti.<ol>
<li>Per R26Y, eseguire la PCR a 94 gradi centigradi per 3 min, quindi a 94 gradi centigradi per 30 s, 60 gradi centigradi per 30 s e 72 s per 1 min per 35 cicli, seguiti da 72 gradi centigradi per 3 min e mantenendo a 14 gradi centigradi. Utilizzare primer (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (ii) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; (iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG. NOTA: una singola banda PCR di 250 bp indica un omozigote R26Y, una singola banda PCR di 500 bp indica un tipo selvaggio (WT) e due bande PCR (R26Y: 250 bp, WT: 500 bp) indicano un R26Y heterozygote (Figura 1A). Per Trp53L, eseguire la PCR a 94 gradi centigradi per 3 min, quindi a 94 gradi centigradi per 30 s, 60 gradi centigradi per 30 s e 72 s per 1 min per 35 cicli, seguiti da 72 gradi centigradi per 3 min e mantenendo a 14 gradi. Utilizzare primer (i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; (ii) p53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC. NOTA: una singola banda PCR di 370 bp indica un omoytàgote Trp53L/L, una singola banda PCR di 288 bp indica un Trp53 // eterozygote (Figura 1B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione preoperatoria
<ol><li>Autoclave tutti gli strumenti chirurgici 1 giorno prima dell'intervento chirurgico.</li>
	<li>Preparare lo 0,1% blu bromofenolo in salina con buffer fosfato (PBS) e conservarlo a 4 gradi centigradi. Diluire l'Ad-Cre che verrà utilizzato per l'iniezione intraducttale nel mezzo DMEM con 0,01 M CaCl2 e bromofenolo blu ad un rapporto di 1:10 (cioè la miscela di iniezione). NOTA: L'Ad-Cre utilizzato qui è stato ottenuto dall'Università dell'IowaViral Vector Core, con un titolo di titoli a titolo virale di 10 -1011 dollari pfu/mL.</li>
	<li>Anestesizzare il topo femminile (generazione F2 come descritto nel passaggio 1.2, età che vanno da 3 a 4 settimane di età per adulto) utilizzando una camera isoflurane e applicare unguento per gli occhi. Durante la procedura, anestesizzare il topo continuamente assicurandosi inala 1–2,5% isoflurane in ossigeno. Controllare la profondità dell'anestesia almeno ogni 15 min eseguendo un pizzico di punta. Monitorare attentamente il mouse per qualsiasi cambiamento della frequenza respiratoria, regolando il livello di isoflurane di conseguenza, se necessario.</li>
	<li>Iniettare la melossia come analgesia sottocutaneamente ad una dose di 5 mg/kg, prima della procedura chirurgica.</li>
	<li>Esporre il sito chirurgico capezzolo applicando diverse gocce di crema per la rimozione dei peli; rimuovere la crema eccessiva e i capelli sciolti con asciugamani morbidi di carta. NOTA: Eseguire questo passaggio in un'area separata da quella in cui deve essere eseguito l'intervento chirurgico. La rasatura non è raccomandata per evitare danni ai capezzoli. Prestare attenzione per rimuovere l'agente depilatorio chimico in modo tempestivo. Lasciare l'agente acceso troppo a lungo può provocare ustioni chimiche sulla pelle</li>
	<li>Disinfettare prima il sito chirurgico con iodofori, seguito dal 70% di alcol, e terminare con un'applicazione finale di scrub iodophors. Fate questo in un movimento circolare dal centro dell'area di lavoro verso la periferia utilizzando una spugna di garza o applicatore con punta di cotone. Ripetere il ciclo 3x–4x.</li>
</ol>3. Iniezione intraduttiva
<ol><li>Utilizzare tecniche asettiche per tutta la procedura chirurgica.</li>
	<li>Fare un sito di incisione sulla pelle ad una lunghezza di 1 cm tra i due quattro MG inguinali (Figura 2). Separare con cura il lembo della pelle (con la MG) dal peritoneo parietale in modo da visualizzare l'albero duttale mammario.</li>
	<li>Tenere con attenzione il capezzolo con le pinze del Orologiaio e rimuovere il capezzolo esterno senza tagliare la pelle vicina, utilizzando una forbice a micro-dissezione.</li>
	<li>Caricare il numero di 3-5 dollari di miscela di iniezione Ad-Cre in una siringa Hamilton da 25 litri con un ago a viscito metallico da 33 G. Stimare il volume della miscela di iniezione nella siringa in base al colorante blu incluso nella miscela. NOTA: Utilizzare un volume più piccolo (ad es., 3 o L) quando si iniettano in MG di femmine di 3-4 settimane e un volume maggiore (ad esempio, 10 l) quando si iniettano in MG di femmine che allattano.</li>
	<li>Tenere delicatamente il bordo del lembo della pelle con una pinzetta curva fine e iniettare lentamente la miscela di iniezione Ad-Cre nel capezzolo, monitorando nel frattempo la diffusione del colorante blu nell'albero duttale di mammiferi. Mantenere il tasso di iniezione il più basso possibile per evitare danni al lume duttale. NOTA: il liquido iniettato (come illustrato dal colorante blu bromofenolo incluso) che si diffonde in tutto l'albero duttale senza fuoriuscire nel compartimento stroforme indica un'iniezione intraducttale di successo.</li>
	<li>Ritirare delicatamente l'ago dal capezzolo per evitare perdite del liquido iniettato.</li>
	<li>Esaminare il lato distale (cioè lontano dal capezzolo) della MG o l'area circostante del capezzolo iniettato. Si noti che gonfiore tintura blu (cioè, colorante diffusione nel vicino stroma) indica un'iniezione di grasso mammario piuttosto che un'iniezione intraduttiva di successo.</li>
	<li>Chiudere le ferite chirurgiche (dal punto 3.2) nella pelle con le clip della ferita.</li>
</ol>4. Assistenza postoperatoria
<ol><li>Rimuovere il mouse dall'anestesia e posizionarlo su una piastra di riscaldamento all'interno di una gabbia pulita per il recupero.</li>
	<li>Somministrare la melossicama sottocutaneamente a 5 mg/kg di nuovo, 24 h dopo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Monitorare le condizioni generali dell'animale e cercare segni di infezione nel sito di incisione per 5 giorni.</li>
	<li>Le clip della ferita vengono rimosse 7-10 giorni dopo l'intervento chirurgico.</li>
</ol>5. Monitoraggio dello sviluppo del tumore mammario
<ol><li>Monitorare i topi iniettati due volte alla settimana dalla palpazione per qualsiasi segno di sviluppo del tumore mammario.</li>
	<li>Una volta che il tumore è palpabile, monitorare il topo ogni giorno e misurare la dimensione del tumore fino a raggiungere l'endpoint sperimentale, come determinato dalla dimensione (ad esempio, raggiungendo il 10–15% del peso corporeo del topo) o dalla condizione (ad esempio, ulcerata o necrotica) del tumore, o dal condizioni di salute generali del topo (ad es. comatosi, moribond).</li>
	<li>Eutanasia il topo per asfissia di anidride carbonica, seguita da un metodo secondario (ad esempio, lussazione cervicale).</li>
	<li>Isolare i tessuti tumorali mammari e analizzarli per citometria di flusso, immunofluorescenza o profilazione dell'espressione (ad esempio, mediante sequenziamento dell'RNA [RNAseq] o microarray), come descritto in precedenza12.</li>
	<li>Eseguire l'analisi citometrica del flusso mediante l'analisi per le cellule negative del lignaggio (Lin-: negativo per i marcatori di lignaggio CD45 [marcatore leubucito], CD31 [marcatore di cellule endoteliali]e TER119 [marcatore di eritrocite]) e analizzare le cellule nel tumore in base alla loro espressione di YFP, CD24 e CD29.</li>
</ol>

<ol><li>Wagner, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-mediated+gene+deletion+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cre-mediated gene deletion in the mammary gland.</a> Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).</li>
<li>Selbert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+BLG-Cre+mediated+gene+deletion+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland.</a> Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).</li>
<li>Jonkers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+tumor+suppressor+activity+of+BRCA2+and+p53+in+a+conditional+mouse+model+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer.</a> Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).</li>
<li>van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RUNX1%2C+a+transcription+factor+mutated+in+breast+cancer%2C+controls+the+fate+of+ER-positive+mammary+luminal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells.</a> eLife. 3, e03881(2014).</li>
<li>Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Long-Lived+Luminal+Subpopulation+Enriched+with+Alveolar+Progenitors+Serves+as+Cellular+Origin+of+Heterogeneous+Mammary+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors.</a> Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+mutation+of+Brca1+in+mammary+epithelial+cells+results+in+blunted+ductal+morphogenesis+and+tumour+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation.</a> Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETV6-NTRK3+fusion+oncogene+initiates+breast+cancer+from+committed+mammary+progenitors+via+activation+of+AP1+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex.</a> Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+loss+of+BRCA1+and+p53+in+mice+induces+mammary+tumors+with+features+of+human+BRCA1-mutated+basal-like+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).</li>
<li>Molyneux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+basal-like+breast+cancers+originate+from+luminal+epithelial+progenitors+and+not+from+basal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).</li>
<li>Koren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+induces+multipotency+and+multi-lineage+mammary+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours.</a> Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).</li>
<li>Van Keymeulen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+multipotency+by+oncogenic+PIK3CA+induces+breast+tumour+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity.</a> Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).</li>
<li>Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+p53+loss+in+mouse+luminal+cells+causes+clonal+expansion+and+development+of+mammary+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours.</a> Nature Communications. 8, 14431(2017).</li>
<li>Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+Tracing+of+Mammary+Epithelial+Cells+Using+Cell-Type-Specific+Cre-Expressing+Adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses.</a> Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).</li>
<li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer%3A+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li>
<li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li>
<li>The Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+history+of+21+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The life history of 21 breast cancers.</a> Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).</li>
<li>Abba, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+Portrait+of+High-Grade+Ductal+Carcinoma+In+Situ%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ.</a> Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il successo di questo approccio per indurre tumori mammari provenienti da diverse sottopopolazioni di MEC si basa non solo sulla scelta di promotori specifici del tipo di cellula appropriati (per guidare l'espressione Cre), ma anche sulla procedura di iniezione intraduttiva stessa. L'idea alla base di questo approccio è che i virus Ad-Cre iniettati sono conservati nell'albero duttale, che è una struttura nascosta con lumen, e quindi, solo i MEC sono esposti ai virus e sono infettati da Ad-Cre. A causa dello spazio limita...

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di sviluppare un nuovo approccio di modellazione del cancro al seno basato su un'iniezione intraduttiva di Ad-Cre nel topo MG. L'approccio genetico basato sulla ricombinazione Cre/loxP è stato ampiamente utilizzato per modellare il cancro al seno umano nei topi. La prima generazione di modelli di topo di carcinoma mammario a base di Cre/loxP viene generata utilizzando topi transgenici che esprimono Cre-expressing sotto il controllo di promotori specifici del MEC (ad esempio, MMTV-Cre per i MEC luminosi e una porzione di MEC basali, Wap-Cre e Blg-Cre per progenitori luminali e MEC luminali alveolar, K14-Cre per basale e una porzione di MEC luminali1,2,3,4,5)6, 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9. , tuttavia, sebbene queste linee transgeniche Del Cre consentano il controllo spaziale dell'espressione Cre (cioè in diversi sottoinsiemi di MEC), non consentono il controllo temporale dell'espressione Cre e della manipolazione genetica mediata da Cre/loxP. La seconda generazione di modelli di topo di carcinoma mammario basati su Cre/loxP utilizza approcci inducibili per l'attività/espressione del creme (ad esempio, l'uso della fusione del recettore Cre-estrogeno [CreER], che può indurre la ricombinazione Cre/loxP solo dopo la somministrazione di tamoxifene) e di conseguenza, questi strumenti genetici consentono controlli spaziali e temporali dell'attivazione di eventi oncogeni nei MEC (ad esempio, modelli basati su K8-CreER- e K5-CreER)10,11,12 . In entrambe le generazioni di modelli di topo di cancro al seno, come promotori utilizzati per guidare l'espressione Cre o CreER (ad esempio, Krt8, Krt5) possono anche essere attivi nelle cellule epiteliali di altri organi (cioè, sono specifiche di tipo di cellula ma non specifiche dell'organo) o hanno un'espressione che perde in tipi di cellule diverse dalle cellule epiteliali (ad esempio, MMTV, che ha un'attività che perde nelle cellule ematopoietiche del midollo osseo), questi approcci possono portare allo sviluppo di tumori indesiderati in altri organi. Se questi tumori inaspettati causano letalità nei topi colpiti, lo scopo originale della modellazione del cancro al seno in questi topi può essere vietato (ad esempio, eventi oncogeni MMTV-Cre-driven può portare a neoplasie ematopoietiche e morte precoce dei topi , a causa della perdita del promotore MMTV nelle cellule ematopoietiche)4.
Qui segnaliamo un approccio di modellazione del cancro al seno nei topi che consente la manipolazione sia tipo di cellula che organo-specifica degli eventi oncogeni in modo controllato materialmente. Questo approccio si basa su un'iniezione intraduttiva di Ad-Cre nelle MG del topo (ed è, quindi, specifico dell'organo). L'espressione del creme può essere controllata utilizzando diversi promotori specifici del MEC incorporati nel vettore adenovirale (ad esempio, Krt8 per MEC luminali, Krt5 per i MEC basali, ottenendo così la specificità del tipo di cellula). L'induzione del cancro nelle MG può essere controllata temporaneamente mediante un'iniezione di Ad-Cre nei topi di età diverse, a partire da 3-4 settimane di età (pageratale) allo stadio adulto.

<table><tbody><tr><td>Ago calibro 33</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>stile di punta 3 smussati</td></tr><tr><td>7mm Reflex Clip</td><td>Braintree Scientific</td><td>RF7 CS</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus, Ad-K5-Cre</td><td>University of Iowa Viral Vector Core</td><td>Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547)</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus, Ad-K8-Cre</td><td>University of Iowa Viral Vector Core</td><td>Ad5mK8-nlsCre</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol</td><td>Fisher</td><td>HC800-1GAL</td><td>Preparare al 70% in uso</td></tr><tr><td>CD31 biotinilato</td><td>eBiosciences</td><td>13-0311-85</td><td></td></tr><tr><td>CD45 biotinilato</td><td>eBiosciences</td><td>13-0451-85</td><td></td></tr><tr><td>biotinilato TER119</td><td>eBiosciences</td><td>13-5921-85</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>CD24-AF-700</td><td>BD Pharmingen</td><td>564237</td><td></td></tr><tr><td>CD24-PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0242-83</td><td></td></tr><tr><td>CD29-APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-0291-82</td><td></td></tr><tr><td>CD29-PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0291-82</td><td></td></tr><tr><td>Lozione per la rimozione dei capelli</td><td>Nair</td><td></td><td>9 Oz</td></tr><tr><td>Siringa Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>7636-01</td><td>0,025 mL</td></tr><tr><td>Iodofori</td><td>Betadine</td><td></td><td>10% Povidone-iodio</td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Baxter</td><td>NDC 10019-360-40</td><td>1-2,5%</td></tr><tr><td>Loxicam</td><td>Norbrook</td><td>NDC 55529-040-10</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Lubrificante Unguento per gli occhi</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-062-35</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per micro-dissezione</td><td>Pentair</td><td>9M</td><td>Pinze per orologiaio</td></tr><tr><td></td><td>Dumont</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>Taq 5X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0285L</td><td></td></tr></tbody></table>

modellare il cancro al seno tramite un'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime la creminazione nella ghiandola mammaria del topo

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Il cancro al seno è una malattia eterogenea, probabilmente a causa di complesse interazioni tra diverse cellule di origine ed eventi oncogeni. I modelli di topo sono fondamentali per ottenere informazioni approfondite su questi processi complessi. Sebbene molti modelli murini siano stati sviluppati per studiare i contributi di vari eventi oncogeni e cellule di origine alla tumorigenesi mammaria, questi modelli spesso non sono di tipo cellulare o organo specifico o non possono indurre l'avvio della tumorigenesi mammaria in un modo controllato temporaneamente. Qui descriviamo un protocollo per generare un nuovo tipo di modelli di topo di cancro al seno basati sull'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime Cre (Ad-Cre) nelle ghiandole mammarie del topo (MG). A causa dell'iniezione diretta di Ad-Cre nei dotti mammari, questo approccio è specifico di MG, senza alcuna induzione indesiderata del cancro in altri organi. La procedura di iniezione intraduttiva può essere eseguita nei topi in diverse fasi del loro sviluppo di MG (quindi, permette il controllo temporale dell'induzione del cancro, a partire da 3-4 settimane di età). La specificità del tipo di cellula può essere ottenuta utilizzando diversi promotori specifici del tipo di cellula per guidare l'espressione Cre nel vettore adenovirale. Dimostriamo che le cellule epiteliali mammarie luminali e basali (MEC) possono essere strettamente mirate per la manipolazione genetica basata su Cre/loxP tramite un'iniezione intraduttiva di Ad-Cre sotto il controllo del promotore Keratin 8 o Keratin 5, rispettivamente. Incorporando un reporter Cre condizionale (ad esempio, Reporter Inducibile in Cre/loxP Rosa26-YFP), mostriamo che i MEC presi di mira da Ad-Cre, e le cellule tumorali da essi derivate, possono essere rintracciati seguendo le cellule reporter-positive dopo l'iniezione intraductale.

I risultati di genotipizzazione PCR rappresentativi per gli alleli R26Y e Trp53L sono illustrati nella Figura 1.
Anche se, in linea di principio, tutti i 10 MG possono essere sottoposti alla procedura di iniezione intraducttale, praticamente, i due quattro MG inguinali sono tipicamente selezionati per l'iniezione, a causa della loro accessibilità più facile e di dimensi...

L'obiettivo di questo protocollo è descrivere un nuovo approccio di modellazione del cancro al seno basato sull'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime Cre nelle ghiandole mammarie dei topi. Questo approccio consente la manipolazione sia di tipo cellulare che di un organo degli eventi oncogeni in modo controllato temporaneamente.

Modellare il cancro al seno tramite un'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime la creminazione nella ghiandola mammaria del topo

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Questo protocollo aiuterà i ricercatori a generare un nuovo tipo di modello di topo per ricapitolare lo sviluppo del cancro al seno umano da diversi sottoinsiemi di cellule epiteliali mammarie. Questa tecnica consente ai ricercatori di generare modelli di topi del cancro al seno nel tessuto dello stadio di sviluppo in modo specifico di tipo cellulare e senza la necessità di un allevamento estensivo di topi. Per iniziare questa procedura, generare, mantenere e anestetizzare topi flox come descritto nel protocollo di testo.Portare il mouse in un'area separata da dove deve essere eseguito l'intervento chirurgico. Dopo aver confermato l'anestesia eseguendo un pizzico di dito, iniettare Meloxicam come analgesia per via sottocutanea a una dose di cinque milligrammi per chilogrammo per prepararsi alla procedura chirurgica. Esporre il sito chirurgico del capezzolo applicando diverse gocce di crema per la depilazione.Rimuovere la crema eccessiva e i capelli sciolti con asciugamani di carta morbidi. La rasatura non è raccomandata per evitare danni ai capezzoli. Disinfettare il sito chirurgico con iodofori prima seguito dal 70% di alcol e terminare con un'applicazione finale di iodofori scrub

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In questo articolo discutiamo su come stabilire un modello di cancro al seno nei topi femmina iniettando cellule di cancro al seno nel cuscinetto adiposo mammario. Il protocollo di esempio illustra l'iniezione ortotopica.

Iniezione ortotopica nel cuscinetto adiposo mammario: stabilire il cancro al seno nei topi

Questo video descrive una tecnica di iniezione intraduttale in cui forniamo una miscela per iniezione nei dotti delle ghiandole mammarie di topo.

Iniezione intraduttale: erogazione di una miscela per iniezione nei dotti della ghiandola mammaria del topo

Un protocollo per la consegna intraduttale non invasiva di reagenti acquosi alla ghiandola mammaria topo è descritto. Il metodo si avvale di iniezione localizzato nei capezzoli delle ghiandole mammarie destinati dotti mammari in particolare. Questa tecnica è adattabile per una varietà di composti compresi siRNA, agenti chemioterapici e piccole molecole.

Iniezione intraduttale per Localizzato Drug Delivery per il mouse ghiandola mammaria

Attivazione di mutazioni latenti con adenovirus-Cre nei risultati mammarie sistema duttale in un carcinoma mammario metastatico clinicamente rilevante. Incorporazione di un promotore YFP consente di tenere traccia di cellule tumorali metastatiche distali. Questo modello è utile per studiare metastasi latente, immunità anti-tumorale, e per la progettazione di nuove immunoterapie per trattare il cancro al seno.

Avvio del carcinoma metastatico della mammella dalla Targeting del duttale con Adenovirus-Cre: A Novel modello di topo transgenico di cancro al seno

Il cancro è una malattia complessa che è influenzata dal tessuto circostante il tumore nonché pro- locale e anti-infiammatori mediatori. Pertanto, modelli iniezione ortotropici, anziché modelli sottocutanee possono essere utili per studiare la progressione del cancro in un modo che imita migliori patologia umana.

Iniezione ortotopico di cellule di carcinoma mammario nel mammaria Fat Pad di Mice per studiare la crescita del tumore.

Qui, presentiamo un protocollo per impiantare cellule di cancro al seno nel cuscinetto grasso mammario in modo semplice, meno invasiva e facile da maneggiare, e questo modello di cancro al seno ortotopico del topo con un ambiente adeguato cuscinetto grasso mammario può essere utilizzato per approfondire vari aspetti della cancro.

Orthotopic iniezione delle cellule di cancro al seno in topi cuscinetto grasso mammario

I modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) e i modelli murini trapiantabili geneticamente modificati ricapitolano fedelmente la malattia umana e sono modelli preferiti per la ricerca di base e traslazionale sul cancro al seno. Qui, viene descritto un metodo per trapiantare ortotopicamente frammenti di tumore al seno nel cuscinetto di grasso mammario per studiare la biologia del tumore e valutare la risposta al farmaco.

Trapianto ortotopico di tumori al seno come modelli preclinici per il cancro al seno

Descriviamo un modello murino di xenotrapianto di metastasi cerebrali di cancro al seno generate tramite iniezione di vena della coda di una linea cellulare di carcinoma mammario infiammatorio amplificata endogenamente da HER2.

Modellazione delle metastasi cerebrali tramite iniezione di vena della coda di cellule infiammatorie del cancro al seno

Viene descritto un metodo di iniezione intraduttale di reagenti per una soluzione ablativa a base di etanolo all'albero duttale mammario di topo per l'imaging in vivo e la prevenzione del cancro al seno. L'iniezione direttamente nell'apertura del capezzolo consente di colpire le cellule epiteliali mammarie con un danno tissutale collaterale minimo.

Somministrazione intraduttale e visualizzazione a raggi X della soluzione ablativa a base di etanolo per la prevenzione e il trattamento locale del cancro al seno in modelli murini

Viene descritta una procedura per la consegna di una soluzione ablativa chimica all'albero duttale mammario del ratto per il trattamento preventivo guidato da immagini del cancro al seno. Le cellule epiteliali mammarie possono essere mirate con danni tissutali collaterali minimi attraverso l'incannulamento direttamente nell'apertura del capezzolo e l'infusione intraduttale di una soluzione ablativa a base di etanolo al 70%.

Visualizzazione a raggi X del trattamento ablativo intraduttale a base di etanolo per la prevenzione del cancro al seno in modelli di ratto

Il presente protocollo descrive l'iniezione intraduttale di vettori virali attraverso la tettarella per fornire geni di interesse nelle cellule epiteliali mammarie.

In vivo Consegna genica nelle cellule epiteliali mammarie di topo attraverso l'iniezione intraduttale mammaria

Impara a modellare il cancro al seno tramite iniezione intraduttale di adenovirus Cre nella ghiandola mammaria del topo. Questo metodo consente la manipolazione specifica di eventi oncogenici in modo controllato e riduce la necessità di complesse strategie di allevamento.

Modellare il cancro al seno tramite uniniezione intraduttiva di adenovirus che esprime la creminazione nella ghiandola mammaria del topo (Video) | JoVE Journal

Modellare il cancro al seno tramite un'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime la creminazione nella ghiandola mammaria del topo

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