Name: Raccolta di tessuti di pipistrelli per -Omics Analyses e Primary Cell Culture (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: Scopri il protocollo di raccolta tessuti da pipistrelli per analisi genomiche, trascrittomiche e proteomiche. Questo metodo non letale preserva campioni di alta qualità per studi molecolari e colture cellulari primarie.

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Ringraziamo il Centro de Ecologàa y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sonchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Visquez, Harold Porocarrero sarria, Jorge Ruàz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, il tessuto Fanny Cornejo e Fanny Fernànez Melo per la realizzazione di raccolta in Perù possibile. Ringraziamo anche tutti i membri del Grupo Jaragua e di Yolanda Leàn per aver reso possibile la raccolta dei tessuti nella Repubblica Dominicana, così come a Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, e tutti alla Stazione di Ricerca Biologica La Selva in Costa Rica, per aver reso campionamento possibile. Ringraziamo Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe per l'accesso e la raccolta di campioni di punzoni sulle ali di Phyllostomus scolorire i pipistrelli per la generazione della coltura cellulare. Phyllostomus scolorire pipistrelli provenienti da una colonia riproduttiva nel Dipartimento Biologia II del Ludwig-Maximilians-Università di Monaco. L'ottenimento e la rivasa dei pipistrelli è stato rilasciato dall'ufficio veterinario del distretto di Monaco. LMD, SJR, KTJD e LRY sono stati finanziati da NSF-DEB 1442142. LMD è stato finanziato da NSF-DEB 1838273. LRY è stato finanziato dalla NSF-PRFB 1812035. SCV e PD sono stati finanziati da un Max Planck Research Group Award e da una borsa di ricerca Human Frontiers Science Program (HFSP) Research (RGP0058/2016). SJR, JHTP e KTJD sono stati finanziati dal Consiglio europeo della ricerca (ERC Starting grant 310482 [EVOGENO]) assegnato al SJR, ECT è stato finanziato dalla sovvenzione del Consiglio europeo della ricerca (ERC-2012-StG311000).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo discusso in questo manoscritto descrive le migliori pratiche di campionamento per varie analisi molecolari ad alto throughput di pipistrelli. Tutti gli studi -omics di successo richiedono tessuto di alta qualità, ma il campionamento del tessuto pipistrello, così come altri organismi non modellati, si verifica spesso in condizioni di campo che non possono essere fissate agli stessi standard di quelli di un ambiente di laboratorio controllato. Il campionamento avviene spesso in postazioni remote, con risorse ...

<table><tbody><tr><td>Provette Eppendorf Safelock da 1,5 mL</td><td>Fischer Scientific 10509691</td><td></td><td>Provette sterili da 1,5 mL utilizzate durante il protocollo di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Provette da 15 mL Provette</td><td>sterili Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td>Provette sterili da 15 mL utilizzate durante il protocollo di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Crioviali da 2 mL Fiale</td> criogeniche <td>Thomas</td><td>Scientific 1154P75</td><td>per tessuti da conservare in azoto liquido</td></tr><tr><td>Punzone per biopsia da 3 mm</td><td>Medline</td><td>Punzone</td> per <td>biopsia ad ala MIL3332 per coltura cellulare</td></tr> piastra a <tr><td>6 pozzetti</td><td>Greiner</td><td>83.392</td><td>Vaso di coltura</td></tr><tr><td>Reagente tissutale Allprotect</td><td>Qiagen</td><td>76405</td><td>per campioni fecali; soluzione stabilizzante dei tessuti</td></tr><tr><td>Vetrini per contacellule TC10/TC20 contacellule a doppia camera</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td>Camere per il conteggio delle cellule con il contatore cellulare automatizzato TC20 di Bio-Rad</td></tr><tr><td>Collagenasi IV</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>7909</td><td>Per la dissociazione delle cellule primarie</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td>Previene la cristallizzazione dell'acqua durante il congelamento delle cellule.</td></tr><tr><td>DMEM&ndash; Terreni di coltura Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190169</td><td>Soluzione salina bilanciata utilizzata per il lavaggio delle cellule</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Fischer Scientific</td><td>10270106</td><td>Integratore sieristico per colture cellulari in vitro di cellule eucariotiche</td></tr><tr><td>Sale di gentamicina solfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1264-250MG</td><td>Antibiotico per terreni di coltura</td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0050</td><td>Contenitore di congelamento che fornisce 1 &deg; C/min Velocità di raffreddamento</td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>Sigma</td><td>P7793</td><td>Provette di avvolgimento ecc. per sigillare</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina (penna-streptococco), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140130</td><td>Antibiotico per terreni di coltura</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 10x, pH 7,4</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td>tampone salino utilizzato per il lavaggio e la conservazione del tessuto osseo; diluire a 10x utilizzando acqua deionizzata</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM7021</td><td>Soluzione stabilizzante dell'RNA</td></tr><tr><td>Genetech</td><td></td><td>83931-250mL</td><td>scompone gli enzimi che portano alla degradazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Gel di silice</td><td>Fisher Scientific</td><td>7631-86-9</td><td>Agente essiccante</td></tr><tr><td>TC20 Contatore cellulare automatizzato</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Contatore cellulare automatizzato</td></tr><tr><td>Blu di tripano</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td>Colorazione cellulare utilizzato per valutare la vitalità cellulare</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>Per la dissociazione delle cellule durante la scissione</td></tr></tbody></table>

raccolta di tessuti di pipistrelli per -omics analyses e primary cell culture

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

Con l'avanzare delle tecnologie di sequenziamento ad alto consumo, i metodi standardizzati per l'acquisizione e la conservazione di tessuti di alta qualità consentono l'estensione di questi metodi agli organismi non modellati. Una serie di protocolli per ottimizzare la raccolta dei tessuti dai pipistrelli è stata sviluppata per una serie di approcci di sequenziamento ad alta velocità. Qui sono descritti i protocolli per la cattura dei pipistrelli, i dati demografici desiderati da raccogliere per ogni pipistrello e metodi ottimizzati per ridurre al minimo lo stress su un pipistrello durante la raccolta dei tessuti. In particolare sono descritti metodi per la raccolta e il trattamento dei tessuti per ottenere (i) DNA per analisi genomiche ad alto peso molecolare, (ii) RNA per trascrittomi specifici dei tessuti e (iii) proteine per analisi a livello proteomico. Infine, anche delineato è un metodo per evitare il campionamento letale creando colture cellulari primarie praticabili da clip ali. Una motivazione centrale di questi metodi è quella di massimizzare la quantità di potenziali dati molecolari e morfologici per ogni pipistrello e suggerire modi ottimali per preservare i tessuti in modo che mantengano il loro valore man mano che in futuro si sviluppano nuovi metodi. Questa standardizzazione è diventata particolarmente importante con l'emergere di iniziative volte a sequenziare i genomi delle specie a livello cromosomico e privo di errori, in cui sono emerse più parti scientifiche che guidano il sequenziamento di diversi livelli tassonomici, in cui sono emerse più parti scientifiche che guidano il sequenziamento di diversi livelli tassonomici. Gruppi. I protocolli qui descritti definiscono i metodi ideali per la raccolta dei tessuti e la conservazione dei tessuti per Bat1K, il consorzio che sta sequenziando i genomi di ogni specie di pipistrello.

Dna Per le analisi standard a basso peso molecolare (LMW), il DNA è stato estratto da tre specie di pipistrelli neotropicali. Campioni di tessuti sono stati raccolti sul campo dalla Repubblica Dominicana e dal Costa Rica, seguendo i protocolli descritti in questo documento. A seguito della dissezione, piccoli pezzi (&lt;0,5 cm nella sezione più sottile) di tessuti misti (cervello, fegato e intestino) sono stati collocati in soluzione stabilizzante dell'RNA, congelati f...

Questo è un protocollo per la preparazione ottimale dei tessuti per analisi genomiche, trascrittomiche e proteomiche di pipistrelli catturati in natura. Esso comprende protocolli per la cattura pipistrello e la dissezione, la conservazione dei tessuti, e la coltura cellulare del tessuto pipistrello.

Raccolta di tessuti di pipistrelli per -Omics Analyses e Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

In questo video, forniamo una guida passo dopo passo alla raccolta dei pipistrelli in modo umano, destinata a ridurre al minimo l'impatto sulle popolazioni e massimizzare il valore scientifico. I vantaggi del nostro approccio sono che massimizziamo la quantità di potenziali dati molecolari e morfologici per ogni pipistrello, conserviamo i tessuti per mantenere il loro valore futuro e riduciamo al minimo la raccolta di individui selvatici. I protocolli di dissezione sono difficili da dimostrare verbalmente.Molte delle tecniche di preparazione dei tessuti che presentiamo qui sono meglio comunicate visualizzando come vengono identificati diversi organi, e quindi correttamente sezionati e conservati. Preparare tutte le fiale prima di iniziare eventuali dissezioni per evitare ritardi. Per l'RNA, mettere da parte il numero di fiale necessarie per ogni campione.Etichettare ogni tubo con il tipo di tessuto che verrà raccolto, nonché le informazioni standard sull'identificazione del campione. Riempire le fiale 50% piene di soluzione stabilizzante dell'RNA e raffreddare a quattro gradi celsius. Fare attenzione a non riempire completamente le fiale con soluzione stabilizzante dell'RNA, poiché

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Questa procedura descrive come stabilire colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino ed è seguita dalla trasfezione con il gene Pulser sistema di elettroporazione MXCell.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

Questo articolo descrive un protocollo per l'isolamento e il mantenimento delle colture primarie di fibroblasti della pelle e tessuto polmonare dei roditori selvatici.

Stabilire colture primarie di fibroblasti adulti dai roditori

Forniamo un protocollo dettagliato per la preparazione di cellule primarie dissociata...

Colture cellulari primarie da Drosophila Gastrula embrioni

Tegumento mammiferi contiene lipidi solventi estraibili che possono fornire le composizioni chimiche caratteristiche delle singole specie. Questo articolo presenta un metodo di routine per separare ampie classi lipidiche isolate da tessuti tegumentario mediante cromatografia su strato sottile e determinare il profilo triacylglyceride laser desorbimento / ionizzazione spettrometria di massa matrix-assisted tempo di volo.

Profiling Contenuti Triacylglyceride nella BAT tegumentario lipidi da preparativa cromatografia su strato sottile e MALDI-TOF

Descriviamo una procedura sperimentale semplice e rapido per la generazione di fibroblasti primari dalle orecchie e le code di topi. La procedura non richiede addestramento speciale animali e può essere utilizzato per la generazione di colture di fibroblasti da spighe conservati a temperatura ambiente per 10 giorni.

Generazione di primaria fibroblasti culture da orecchio e coda tessuti di topo

Qui descriviamo un protocollo per immunoprecipitazione efficiente della cromatina (ChIP) seguito da sequenziamento del DNA di alto-rendimento (ChIP-seq) del tessuto adiposo marrone (pipistrello) isolato da un mouse. Questo protocollo è adatto sia per mappatura modificazioni istoniche e indagando genoma localizzazione delle proteine non istoniche di interesse in vivo.

Immunoprecipitazione della cromatina del tessuto adiposo marrone murino

Questo protocollo descrive le procedure generali e controlli di qualità necessari per la preparazione di cellule singole mammifera adulte sane per le preparazioni di RNA-Seq unicellulare gocciolina-based, alta velocità di trasmissione. Parametri di sequenziazione, leggi l'allineamento e l'analisi bioinformatica di cella singola a valle sono inoltre forniti.

Gocciolina basati su codici a barre singola cella trascrittomica dei tessuti dei mammiferi adulti

Questo protocollo introduce una procedura operativa di laboratorio standard per il test diagnostico degli antigeni lyssavirus nei pipistrelli a Taiwan.

Procedura operativa standard per la sorveglianza lyssavirus della popolazione bat a Taiwan

Descriviamo un approccio per rilevare e catturare sottopopolazioni cellulari invasive in tempo reale. Il progetto sperimentale utilizza l'analisi cellulare in tempo reale monitorando i cambiamenti nell'impedenza elettrica delle cellule. Il cancro invasivo, le cellule immunitarie, endoteliali o stromali nei tessuti complessi possono essere catturati e l'impatto delle co-colture può essere valutato.

Rilevamento e acquisizione in tempo reale di sottopopolazioni cellulari invasive da co-colture

Qui presentiamo un protocollo per misurare in modo accurato e affidabile i metaboliti in rari tipi di cellule. I miglioramenti tecnici, tra cui un fluido di guaina modificato per la selezione cellulare e la generazione di campioni bianchi pertinenti, consentono una quantificazione completa dei metaboliti con un input di sole 5000 cellule per campione.

Metabolomica mirata su cellule primarie rare

Scopri il protocollo di raccolta tessuti da pipistrelli per analisi genomiche, trascrittomiche e proteomiche. Questo metodo non letale preserva campioni di alta qualità per studi molecolari e colture cellulari primarie.

Raccolta di tessuti di pipistrelli per -Omics Analyses e Primary Cell Culture

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