Un modello di Xenotrapianto a parte del paziente di melanoma

Il PDX ha rivoluzionato gli studi preclitici sperimentali sul cancro. Ora possiamo imitare, in laboratorio, ciò che sta accadendo nei pazienti. E ora possiamo lavorare su come superare la resistenza e su come, a lungo termine, possiamo aumentare la sopravvivenza dei pazienti.

A dimostrare la procedura sarà Min Xiao. Per iniziare, trasferire il tessuto di melanoma precedentemente raccolto in una piastra di Petri sterile. Lavorando con forbici chirurgiche, bisturi e forcep, rimuovere prima il tessuto normale dal tessuto normale il più possibile.

E poi rimuovere il tessuto necrotico identificato dal tessuto bianco pallido situato centralmente all'interno del tumore. Quindi usa un bisturi per suddividere un pezzo tumorale iniziale in pezzi approssimativamente uguali per l'impianto chirurgico del topo. Se il tessuto tumorale è troppo duro per la dissociazione meccanica, utilizzare un bisturi per tritare i pezzi tumorali il più finemente possibile per formare un liquame.

Trasferire il liquame in un tubo da 50 millilitri con la soluzione salina bilanciata di Hank fredda senza ioni di calcio e magnesio. Centrifuga a 220 volte g per quattro minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il supernatante, sospendere di nuovo il liquame in 10 millilitri di mezzi di digestione riscaldati e freschi per un grammo di tessuto tumorale.

Posizionare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 20 minuti e mescolare vigorosamente ogni cinque minuti con una pipetta usa e getta. Lavare il liquame utilizzando fino a 50 millilitri di HBSS, centrifugare a 220 volte g per quattro minuti a quattro gradi Celsius, quindi rimuovere il supernatante. Aggiungere cinque millilitri di tampone TEG pre-riscaldato per grammo di tessuto tumorale, agitare per sospendere delicatamente e posizionare il tubo a 37 gradi Celsius per due minuti, senza mescolare.

Per temprare la triptina, aggiungere almeno un volume uguale di mezzi di colorazione a freddo e centrifuga a 220 volte g per quattro minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il supernatante, aggiungere 10 millilitri di mezzi di colorazione per un grammo di tessuto tumorale e sospendere di nuovo il pellet pipettando su e giù. Filtrarlo attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri per ottenere una sospensione a cella singola per l'iniezione del mouse.

Per impiantare l'escissione chirurgica o il tessuto di biopsia chirurgica, radere prima i capelli dalla parte bassa della schiena dei topi anestetizzati NSG da sei a otto settimane, lasciando un'area di circa 1,5 centimetri a tre centimetri senza capelli. Preparare i pezzi tumorali e dividere i liquami tumorali in un Petri in singoli tumuli per l'impianto chirurgico. Usando una lama bisturi, fai un'incisione lunga circa cinque millimetri al centro della parte posteriore del mouse.

Con un paio di forcep, vita lungo la pelle sul lato dell'incisione di fronte all'operatore. Con le forbici d'altra parte, separare la pelle dallo strato muscolare tagliando delicatamente la membrana fasciale con piccoli tagli a forbice, creando così una tasca per il tessuto tumorale. Utilizzare una lama bisturi per raccogliere un mandrino tumorale, così come un singolo tumulo di tessuto liquami tumorali, e posizionare delicatamente il tessuto nella tasca creata.

Quindi aggiungere 100 microlitri di matrice extracellulare artificiale sul tumulo del tessuto tumorale in tasca. Usando due paia di forcep, tirare su l'incisione su entrambe le estremità in modo che i bordi della ferita si uniranno. Quindi applicare una o due clip della ferita per chiudere la ferita.

Iniettare per via sottocutanea da uno a cinque milligrammi per chilogrammo di analgesico. Quando la guarigione è completamente, dopo circa sette giorni, rimuovere le clip della ferita. Monitora i topi una volta alla settimana per verificare la presenza di tumori palpabili.

Una volta che i tumori raggiungono il volume desiderato, utilizzare le forcep chirurgiche per sollevare la pelle adiacente al tumore del topo eutanasiato e fare un taglio orizzontale usando forbici curve. Utilizzare una tecnica di separazione smussata per mobilitare la pelle su entrambi i lati del tumore e sul tumore, esponendo il tumore. Usa le forbici e una lama bisturi per separare il tumore dalla fascia.

Tagliare il tumore e trasferirlo in una piastra di Petri sterile. Tagliare il tumore a piccoli pezzi e rimuovere il tessuto necrotico dal tumore. Per bancare il tessuto tumorale per l'impianto futuro, prendere da due a tre piccoli pezzi tumorali e tritarli in pezzi più piccoli di uno per un millimetro.

Trasferire tutto il tessuto tritato in un vile criogenico a due millilitri. Aggiungere un millilitro di mezzi di congelamento e mescolare bene. Posizionare i flaconcini in un contenitore di congelamento cellulare a base di isopropanolo pre-raffreddato su ghiaccio secco, conservare il contenitore in un congelatore meno 80 gradi Celsius durante la notte, quindi trasferire le fiale allo stoccaggio di azoto liquido.

Per spezzare il tessuto congelante per i test a valle, posizionare i pezzi di tessuto tumorale in una fiala criogenica, mettere immediatamente il vile criogenico nell'azoto liquido e conservare le fiale in un congelatore meno 80 gradi Celsius. Quando sono stati confrontati tre diversi metodi di crescita del tessuto tumorale, la sospensione a singola cellula delle cellule tumorali con l'uso della digestione enzimatica ha avuto più successo. Oltre a consentire una crescita tumorale più rapida, è stato anche sufficiente che un tumore iniziale fosse espanso in 10-20 topi, mentre il metodo del mandrino tumorale e del liquame può essere espanso solo in cinque-10 topi.

I modelli di xenoinnesto derivati dal paziente melanoma spesso riflettono la sensibilità al farmaco che il paziente ha mostrato durante la terapia. Uno xenograft derivato dal paziente con melanoma che inizialmente rispondeva a un inibitore del BRAF, ma alla fine ricaduto, mostrava anche una sensibilità iniziale all'inibizione della proteina BRAF, oltre all'inibitore della chinasi MEK, ma i tumori alla fine fallivano. È fondamentale prendersi cura quando si prepara il tessuto PDX per le banche, in quanto ciò garantirà il successo nelle future espansioni PDX, negli studi terapeutici e nella caratterizzazione.

Con il materiale PDX, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula, il sequenziamento dell'esoma intero e la caratterizzazione proteomica, sono tra i molti metodi che il nostro laboratorio sfrutta per sezionare la resistenza alla terapia. La tecnica PDX consente ai ricercatori di indagare la resistenza alla terapia utilizzando cellule tumorali che ricapitolano meglio la biologia tumorale in un paziente umano rispetto ai modelli tumorali tradizionali coltivati in plastica. Questo vantaggio consente approfondimenti più predittivi.

I ricercatori dovrebbero sempre fare attenzione e utilizzare precauzioni di livello di biosicurezza due quando maneggiano tessuti tumorali derivati da un paziente umano.