CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteina-mediato Precision Gene Editing da Elettroporazione Tube
20 giugno 2019
Presentato qui è un protocollo per l'efficiente editing genico mediato da ribonucleoproteina CRISPR/Cas9 nelle cellule dei mammiferi utilizzando l'elettroporazione dei tubi.
Fornire in modo sicuro ed efficace elementi Cas9 nelle cellule è fondamentale per le terapie basate sull'editing genico. I protocolli che mostriamo qui mostrano un nuovo approccio in quella direzione. Il protocollo utilizza un nuovo metodo di elettroporazione chiamato elettroporazione del tubo.
Ciò porta ad alti tassi di sopravvivenza cellulare e tassi di editing genico. Il metodo di elettroporazione del tubo è virus, farmaco e l'arricchimento del reporter libero. Questi sono preferiti nelle applicazioni cliniche, quindi con le terapie basate sull'editing genico.
Il metodo è universalmente applicabile a molti tipi di cella. Ad esempio, le cellule ematopoietiche umane, le cellule T primarie e altre cellule possono essere modificate usando il nostro metodo. Questo metodo di elettroporazione del tubo utilizza un tubo sottile.
Se sei un utente per la prima volta, puoi provare GFP ad esprimere DNA plasmide. A dimostrare la procedura sarà Linyuan Ma, un postdoc del mio laboratorio. Per avviare questa procedura acquisire iPSC umani dalla American Type Culture Collection.
Coltura gli iPSC su matrice extracellulare artificiale con mezzo di coltura cellulare privo di alimentatori in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica seguendo le istruzioni del fornitore. Due ore prima della trasfezione trattare gli iPSC con bobina arrotolato associata a Rho micromolare contenente inibitore della protein chinasi Y-27632. Durante la trasfettazione, dissociare gli iPSC con la soluzione di distacco cellulare a singole cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Quindi contare il numero di celle. Per stabilire una coltura cellulare di fibroblasti di coniglio ottenere una biopsia della pelle dell'orecchio dalla punta di un orecchio di coniglio. Risciacquare il tessuto due volte con DPBS contenente il 5%di penicillina-streptomicina.
Trasferire il tessuto dell'orecchio risciacquato in un nuovo piatto di coltura tissutale di sei centimetri e tagliare il tessuto a piccoli pezzi, ognuno di circa uno per un millimetro. Aggiungere alcune gocce di FBS per evitare che il tessuto si asciughi. Dopo questo, stendere il tessuto triturato in un piatto di coltura tissutale di 10 centimetri e aggiungere 10 millilitri di mezzo di coltura.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per tre o cinque giorni. Da tre a cinque giorni dopo la placcatura utilizzare Trypsin-EDTA per digerire le cellule a 37 gradi Celsius per due minuti, quindi contare il numero di celle. Dopo aver progettato e sintetizzato i gRNA e gli oligo donatori, preparare le cellule come descritto in precedenza.
Rimescolare da 20 a 30.000 cellule in 20 microlitri di tampone di elettroporazione. Pipetta su e giù con cura per produrre una singola sospensione cellulare. Per la trasfezione Cas9 RNP, pre-mescolare due microgrammi di proteina Cas9 NLS con 0,67 microgrammi di gRNA a temperatura ambiente per 10-15 minuti.
Mescolare delicatamente il complesso RNP formato con due microgrammi di ssODN con le cellule. Utilizzando punte di pipetta universali dal kit di elettroporazione, trasferire la miscela cellulare in un tubo di elettroporazione a 20 microliter. Posizionare il tubo di elettroporazione nella fessura dell'elettroporatore e premere andare a finire.
Un ciclo di elettroporazione riuscito è indicato dal rapporto di impulso sullo schermo dell'elettroporatore. Dopo l'elettroporazione trasferire le cellule iPS umane in un millilitro di Y-27632 pre-riscaldato contenente il mezzo di coltura come descritto in precedenza. Quindi placcare le cellule rimostrate in un pozzo di una piastra di coltura cellulare di 12 po '.
Continua a coltivare il piatto, assicurandoti di cambiare il mezzo di coltura ogni giorno. Y-27632 viene rimosso dal mezzo di coltura iPSC umano 24 ore dopo l'elettroporazione. 72 ore dopo l'elettroporazione, raccogliere le cellule.
Per le cellule fibroblatrici di coniglio, utilizzare Trypsin-EDTA per digerire le cellule dalla piastra di coltura. Per gli iPSC umani utilizzare la soluzione di distacco cellulare per digerire le cellule dalle piastre di coltura. Centrifugare brevemente i campioni a 1000 giri/min per cinque minuti e rimescolare le cellule con 350 millilitri di tampone dilisi.
Incubare durante la notte a 55 gradi Celsius. Il giorno dopo estrarre il DNA genomico con fenolo-cloroformio utilizzando procedure standard. Amplifica da 100 a 200 basi coppie di frammenti di DNA provenienti da gel utilizzando un kit di estrazione del gel o direttamente da prodotti PCR utilizzando un mini kit PCR SV.
Per determinare l'efficienza di editing genico mediante sequenziamento delle colonie batteriche, utilizzare un kit di clonazione TOPO-TA per ligare i prodotti PCR purificati in un vettore PCR4-TOPO. Raccogli casualmente cloni batterici e sequenzia gli inserti utilizzando un primer di sequenziamento universale fornito dal kit di clonazione TOPO-TA. Per determinare l'efficienza di editing genico mediante sequenziamento profondo, inviare i prodotti PCR purificati precedentemente ottenuti per il sequenziamento dell'amplicon CRISPR in un nucleo di sequenziamento del DNA.
In questo studio viene utilizzato efficacemente un metodo di elettroporazione del tubo per fornire CRISPR/Cas9 RNP e ssODN a cellule di coniglio e umane, portando a un editing genico robusto e preciso. In primo luogo, le mutazioni C231Y e Q235X sono prodotte nel gene IL2RG, e la mutazione R150G è prodotta nel gene SPR nelle cellule fibroblasti di coniglio. I progetti specifici di sgRNA e i tassi di editing genico determinati dalla clonazione di TA batterica sono mostrati qui.
Il locus IL2RG C231, dei 28 cloni sequenziati, si porta la precisa mutazione C231Y, quattro portano mutazioni di inserimento o cancellazione, e i restanti 23 sono di tipo selvaggio. Al locus IL2RG Q235, dei 27 cloni sequenziati, due portano la precisa mutazione Q235X, tre portano una mutazione indelebile e gli altri sono di tipo selvaggio. Al locus SPG R150, dei 20 cloni sequenziati, cinque portano la precisa mutazione genica R150, 10 portano mutazioni indele, e gli altri sono di tipo selvaggio.
L'elettroporazione del tubo viene quindi utilizzata per fornire Cas9 RNP e ssODN agli iPSC umani e indirizzare loci clinicamente rilevanti nei geni EGFR, Mybpc3 e HBB. Al locus EGFR, il 15,68% degli alleli porta le mutazioni puntili precise, il 22,75% porta mutazioni indeli e il restante 61,57% è di tipo selvaggio. Al locus Mybpc3, il 37,92% porta la precisa cancellazione TGAA a quattro coppie di basi, il 2,24% porta mutazioni indele e il restante 59,84% è di tipo selvaggio.
Al locus HBB, l'11,5% porta la mutazione E6V precisa, il 35,4% porta mutazioni indele e il restante 65% è di tipo selvatico. Cas9 RNP è la forma preferita di Cas9 a causa delle sue dimensioni più piccole rispetto al DNA plasmide. L'elettroporazione del tubo è un metodo efficace per fornire Cas9 RNP.
Siamo particolarmente interessati all'utilizzo dell'elettroporazione del tubo di Cas9 RNP nelle celle T primarie per applicazioni CAR T.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la modifica genica mediata da ribonucleoproteine CRISPR/Cas9 in cellule di mammifero mediante elettroporazione in provetta. Questo nuovo metodo migliora la sopravvivenza cellulare e i tassi di modifica genica, ed è privo di virus e farmaci.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Modifica genetica
- Tecnologia CRISPR/Cas9
- Biologia cellulare
Sfondo
- La consegna efficiente degli elementi Cas9 è fondamentale per la modifica genica.
- L'elettroporazione in provetta è un nuovo metodo che migliora l'efficienza di consegna.
- Il metodo è applicabile a diversi tipi cellulari, inclusi iPSC umani e fibroblasti di coniglio.
- Alti tassi di sopravvivenza ed efficienza nella modifica genica sono essenziali per applicazioni cliniche.
Scopo dello studio
- Dimostrare un nuovo metodo di elettroporazione in provetta per la modifica genica.
- Raggiungere elevate percentuali di modifica in cellule mammifere.
- Fornire un protocollo privo di interventi virali o farmacologici.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di colture di iPSC umane e di fibroblasti di coniglio.
- Trasfezione mediante RNP Cas9 e oligonucleotidi donatori.
- Elettroporazione mediante un metodo specifico con provette.
- Valutazione dell'efficienza della modifica genica mediante sequenziamento.
Risultati principali
- Consegna efficace dei componenti CRISPR/Cas9 a diversi tipi cellulari.
- Alti tassi di editing genico preciso in loci bersaglio.
- Mutazioni dimostrate nei geni IL2RG e SPR in fibroblasti di coniglio.
- Efficacia dell'editing in iPSC umane in loci clinicamente rilevanti.
Conclusioni
- L'elettroporazione in provetta è un metodo efficace per la modifica genica.
- Il metodo consente elevati tassi di sopravvivenza cellulare e di modifica genica.
- È adatto ad applicazioni cliniche grazie alla sua efficienza e sicurezza.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La consegna efficiente e sicura dei componenti CRISPR/Cas9 rappresenta un collo di bottiglia fondamentale nello sviluppo della terapia genica. L'elettroporazione in provetta consente una modifica ad alta precisione in iPSC umane e cellule primarie clinicamente rilevanti, senza l'uso di vettori virali o reagenti di trasfezione a base farmacologica, riducendo i rischi di immunogenicità e supportando flussi di lavoro scalabili e compatibili con le buone pratiche di produzione (GMP). Questo approccio soddisfa direttamente la necessità di ridurre i rischi meccanicistici nei programmi di editing genetico in fase iniziale, fornendo risultati di modifica quantitativi e riproducibili in loci rilevanti per le malattie.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente la validazione funzionale di mutazioni associate a malattie nei geni IL2RG, SPR, EGFR, Mybpc3 e HBB per confermare i meccanismi patogenetici.
- Valore operativo: Permette la rapida generazione di linee cellulari isogeniche per la riduzione del rischio del bersaglio e l'analisi del percorso in fibroblasti di coniglio e iPSC umane.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce tassi di editing quantificabili e precisi (3,57%-37,92%) mediante clonaggio TA batterico e sequenziamento profondo, consentendo il confronto tra condizioni e analisi dose-risposta.
- Valore operativo: Fornisce risultati di editing standardizzati e riproducibili in diversi tipi cellulari, favorendo la prontezza dell’assay per piattaforme di screening basate su CRISPR.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Genera modelli di malattia clinicamente rilevanti (ad esempio HBB E6V per l'anemia falciforme, mutazioni di EGFR) per test preclinici di efficacia e sicurezza.
- Valore operativo: Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica utilizzando lo stesso metodo di editing, riducendo la variabilità nel passaggio traslazionale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
L'elettroporazione in provetta si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo una modifica precisa del genoma per la validazione di bersagli, lo sviluppo di saggi e la generazione di modelli di malattia.
- Discovery Biology: Supporta la verifica di ipotesi mediante l’introduzione precisa di mutazioni responsabili di malattie, per chiarire la funzione genica e il coinvolgimento nelle vie biologiche.
- Screening: Fornisce letture quantitative della modifica genica che permettono di confrontare l’efficacia delle gRNA, la progettazione dei modelli donatori e le condizioni di elettroporazione.
- Analytics: Offre risultati misurabili (tassi di mutazione precisi, frequenze di indel) tramite sequenziamento, per supportare decisioni di fattibilità nella validazione del bersaglio.
- Translational Research: Genera modelli isogenici di iPSC umane con mutazioni clinicamente rilevanti, utili per studi meccanicistici e di tossicità preclinici.
- Enterprise Reuse: Stabilisce una piattaforma di editing riutilizzabile e non virale, applicabile a diversi tipi cellulari e aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: La modifica con elevata precisione riduce l'ambiguità meccanicistica nella convalida degli obiettivi e nei test fenotipici.
- Valore operativo: Il rilascio senza virus né farmaci migliora la scalabilità, riduce gli oneri normativi e favorisce una produzione costante.
- Valore strategico: Permette una priorizzazione degli obiettivi basata sui dati, collegando l'efficienza della modifica ai risultati fenotipici.
- Impatto sul portafoglio: Facilita l'avanzamento dei programmi di editing genico corretto rispetto ai rischi, grazie a modelli di malattia convalidati e riproducibili.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare primaria, nella manipolazione delle iPSC e nell'ottimizzazione dell'elettroporazione.
- Dipende dall'accesso a sistemi di elettroporazione a tubo e a tamponi compatibili.
- Necessita di protocolli standardizzati per la progettazione e la validazione di gRNA e ssODN.
- Richiede capacità di sequenziamento (clonale o sequenziamento profondo) per la valutazione dell'efficienza di editing.
- Le prestazioni possono variare tra i diversi tipi cellulari primari, richiedendo un'ottimizzazione preliminare.
