Name: CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteina-mediato Precision Gene Editing da Elettroporazione Tube (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Scopri l'editing genico preciso con CRISPR/Cas9 RNP mediante elettroporazione in tubo su cellule iPSC umane e fibroblasti di coniglio. Questo metodo senza virus garantisce elevata sopravvivenza cellulare e efficienza clinica.

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Questo lavoro è stato supportato dai National Institutes of Health (r21OD023194 a JX). Questo lavoro ha utilizzato i servizi di base supportati dal Center for Advanced Models for Translational Sciences and Therapeutics (CAMTraST) presso il Centro Medico dell'Università del Michigan.

Tutte le procedure di manutenzione, cura e uso degli animali sono state esaminate e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Michigan.
1. Preparazione delle cellule
<ol><li>
Acquisire iPSC umani (ACS-1030) dalla American Type Culture Collection (ATCC). Coltura iPScs su matrice extracellulare artificiale con supporto di coltura cellulare privo di alimentatori (vedi Tabella dei materiali) in un incubatore di coltura cellulare (5% CO2 a 37 gradi centigradi) seguendo le istruzioni del fornitore.
	<ol>
<li>2 h prima della trasfezione, trattare gli iPSCs con 10 M associati al Rho, coiliato-coile contenente proteina chinasi (ROCK) inibitore Y27632 (uso del quale riduce l'apoptosi di hiPSC umani dissociati e aumenta la sopravvivenza e l'efficienza di clonazione di hiPSCs senza che influiscono sulla loro pluripotenza).</li>
		<li>Durante la traduzione, dissociare gli iPSC con la soluzione di distacco cellulare (vedere Tabella dei materiali) in singole cellule a 37 s per 5 min. Conta il numero di cellulare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stabilire una coltura di cellule fibroblaste di coniglio utilizzando una coltura primaria di biopsie di tessuto cutaneo dell'orecchio di coniglio, come descritto in precedenza10.
	<ol>
<li>Una biopsia cutanea dell'orecchio di 0,5 cm x 0,5 cm si ottiene dalla punta dell'orecchio del coniglio. Rasare i capelli dal tessuto oculare.</li>
		<li>Risciacquare 2x con la salina con buffer di fosfato (DPBS) con il 5% di penicillina-streptomicina. Trasferire il tessuto dell'orecchio in un nuovo piatto di coltura dei tessuti di 6 cm, quindi tagliare il tessuto a pezzetti ( 1,0 mm x 1,0 mm). Aggiungere qualche goccia di siero bovino fetale per evitare che il tessuto si secchi.</li>
		<li>Stendere il tessuto triturato in un piatto di coltura dei tessuti di 10 cm, quindi aggiungere 10 mL di mezzo di coltura. Le cellule fibroblaste di coniglio sono coltivate nel Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) con il 10% di siero bovino fetale. Mettere il piatto di coltura dei tessuti nell'incubatrice di coltura cellulare (5% CO2 a 37 gradi centigradi).</li>
		<li>Da tre a cinque giorni dopo la placcatura, utilizzare la trippsina-EDTA per digerire le cellule a 37 gradi centigradi per 2 minuti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Progettazione e sintesi di gRNA e Oligos donatore
<ol><li>Per ogni gene, guida di progettazione RNA basato sulla sequenza del locus mirato utilizzando uno strumento online (ad esempio, <http://crispor.tefor.net/>).</li>
	<li>Incollare nella sequenza di DNA di interesse.</li>
	<li>Selezionare un genoma e un motivo protospaziale adiacente (PAM). Le possibili sequenze guida nelle sequenze di DNA di input verranno visualizzate nella pagina di output. Si raccomanda di selezionare il gRNA con una maggiore efficienza prevista e minori potenziali fuori bersaglio.</li>
	<li>Sintetizzare il DNA di un fornitore commerciale per la trascrizione di gRNA. Eseguire la trascrizione in vitro di gRNA utilizzando un kit di sintesi gRNA secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Purificare il gRNA utilizzando una micro colonna di purificazione dell'RNA inclusa nel kit di sintesi del gRNA. Misurare la concentrazione, quindi conservare i gRNA a -80 gradi centigradi.</li>
	<li>Progettare un modello di donatore ssODN per ogni sito di mutazione. Gli ssODN possono essere sintetizzati da fornitori commerciali come IDT. In generale, ogni ssODN è 120-160 nucleotidi (nt) di lunghezza, costituito da 60-80 nt nel braccio omologia sinistro e 60-80 nt nel braccio omologia destro. Per evitare la retaglio del DNA modificato, una mutazione silenziosa al PAM dovrebbe essere introdotta nello ssODN quando possibile. Il sito di taglio CRISPR deve essere situato il più vicino possibile al cambiamento genomico previsto.</li>
</ol>3. Elettroferazione tubolare di Cas9 RNP e ssODNs
<ol><li>Preparare le celle come descritto nella sezione 1.</li>
	<li>Risospendere 2-3 x 105 cellule in 20 - L di buffer di elettroporazione. Pipetta su e giù con attenzione per produrre una sospensione a cella singola.</li>
	<li>Per la trasfezione Cas9 RNP, premix 2 g di proteina Cas9-NLS con 0,67 g di gRNA a temperatura ambiente (RT) per 10-15 min. Successivamente, mescolare delicatamente il complesso RNP formato insieme a 2 g di ssODN con le cellule.</li>
	<li>Trasferire la miscela cellulare in un tubo di elettroporazione da 20 litri utilizzando punte di pipetta di adattamento universali fornite dal kit di elettroporazione dei tubi. Per ottenere una migliore elettroporazione, cercare di evitare la formazione di bolle d'aria durante il trasferimento.</li>
	<li>Posizionare il tubo di elettroporrazione nello slot dell'elettroporatore e premere "Vai" per terminare. Seguire i parametri suggeriti dal produttore per ogni tipo di cella. Ad esempio, per gli iPSC umani e le cellule fibroblaste del coniglio, il set di tensione è 420 V e il tempo di impulso è di 30 ms. Un ciclo di elettroporazione riuscito è indicato dal rapporto di impulso sullo schermo del display dell'elettroporatore.</li>
	<li>Dopo l'elettroporazione, trasferire le cellule iPS umane a 1 mL di un mezzo di coltura preriscaldato Y-27632 descritto nella parte di coltura cellulare. Per le cellule fibroblaste di coniglio, trasferirle in DMEM con siero bovino fetale 10%.</li>
	<li>Piastrare le cellule risospese in un pozzo di una piastra di coltura cellulare 12 pozzi.</li>
	<li>Cambiare il mezzo di coltura ogni giorno. Y-27632 viene rimosso dal mezzo di coltura iPSC umano 24 h post-elettroporazione.</li>
</ol>4. Analisi degli eventi di modifica genica
<ol><li>Raccogliere le cellule 72 h dopo l'elettroporazione. Cellule digeritrici dalla piastra di coltura utilizzando trypsin-EDTA per cellule fibroblaste di coniglio o soluzione di distacco cellulare per iPSC umani. Dopo la centrifuga, risospendere le cellule con 350 mL di tampone di lisi (1 M Tris HCl, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA; pH 8,0, 10% SDS, aggiungere 20L di 20 mg/mL di proteine di proteine K stock per 1 mL di buffer di lisi), quindi incubare a 55 gradi centigradi.</li>
	<li>Estrarre il DNA genomico con fenolo-cloroformio utilizzando procedure standard.</li>
	<li>Amplifica i frammenti di DNA da 100 a 200 bp contenenti regione mirata utilizzando la polimerasi del DNA ad alta fedeltà, quindi purifica i frammenti di DNA dai gel utilizzando un kit di estrazione gel o direttamente da prodotti PCR utilizzando un mini kit PCR SV.</li>
	<li>Per determinare l'efficienza dell'editing genico mediante il sequenziamento delle colonie batteriche, ligasizzare i prodotti PCR purificati in un vettore pCR4-TOPO utilizzando un kit di clonazione TOPO TA. Raccogliere casualmente cloni batterici, quindi sequenziare gli inserti utilizzando un primer di sequenziamento universale fornito dal kit di clonazione TOPO TA.</li>
	<li>Per determinare l'efficienza dell'editing genico mediante il sequenziamento profondo, inviare i prodotti PCR purificati (100-200 bp) dal passaggio 4.3 per il sequenzio dell'amplificatore CRISPR in un nucleo di sequenziamento del DNA.</li>
</ol>

<ol><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Cytosolic+Delivery+of+CRISPR%2FCas9-Ribonucleoprotein+for+Efficient+Gene+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing.</a> ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).</li>
<li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome+editing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).</li>
<li>Miller, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Viral+CRISPR%2FCas+Gene+Editing+In+Vitro+and+In+Vivo+Enabled+by+Synthetic+Nanoparticle+Co-Delivery+of+Cas9+mRNA+and+sgRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Non-Viral CRISPR/Cas Gene Editing In Vitro and In Vivo Enabled by Synthetic Nanoparticle Co-Delivery of Cas9 mRNA and sgRNA.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 56 (4), 1059-1063 (2017).</li>
<li>Finn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Administration+of+CRISPR%2FCas9+Lipid+Nanoparticles+Achieves+Robust+and+Persistent+In+Vivo+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing.</a> Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).</li>
<li>Liang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell-targeted+delivery+of+CRISPR%2FCas9+by+aptamer-functionalized+lipopolymer+for+therapeutic+genome+editing+of+VEGFA+in+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tumor cell-targeted delivery of CRISPR/Cas9 by aptamer-functionalized lipopolymer for therapeutic genome editing of VEGFA in osteosarcoma.</a> Biomaterials. 147, 68-85 (2017).</li>
<li>Luo, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-Specific+in+Vivo+Gene+Editing+Using+Cationic+Lipid-Assisted+Polymeric+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Macrophage-Specific in Vivo Gene Editing Using Cationic Lipid-Assisted Polymeric Nanoparticles.</a> ACS Nano. 12 (2), 994-1005 (2018).</li>
<li>Wang, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+gene+editing+via+CRISPR%2FCas9+delivery+by+membrane-disruptive+and+endosomolytic+helical+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nonviral gene editing via CRISPR/Cas9 delivery by membrane-disruptive and endosomolytic helical polypeptide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4903-4908 (2018).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+homology-directed+gene+editing+by+CRISPR%2FCas9+in+human+stem+and+primary+cells+using+tube+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11649(2018).</li>
<li>Du, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effect+of+young+oocytes+for+rabbit+somatic+cell+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Beneficial effect of young oocytes for rabbit somatic cell nuclear transfer.</a> Cloning Stem Cells. 11 (1), 131-140 (2009).</li>
<li>Allenspach, E., Rawlings, D. J., Scharenberg, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllenspach%2C+E+%22GeneReviews%28R%29%22">GeneReviews(R)</a>. Adam, M. P., et al. , (1993).</li>
<li>Friedman, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFriedman%2C+J+%22GeneReviews%28R%29%22">GeneReviews(R)</a>. Adam, M. P., et al. , (1993).</li>
<li>Hidaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+T790M+mutations+are+present+on+the+same+EGFR+allele+as+activating+mutations+in+patients+with+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Most T790M mutations are present on the same EGFR allele as activating mutations in patients with non-small cell lung cancer.</a> Lung Cancer. 108, 75-82 (2017).</li>
<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+a+pathogenic+gene+mutation+in+human+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos.</a> Nature. 548 (7668), 413-419 (2017).</li>
<li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+and+Pneumocystis+Infections+in+the+Lungs+of+Gene-Knockout+Rabbits+with+Severe+Combined+Immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bacterial and Pneumocystis Infections in the Lungs of Gene-Knockout Rabbits with Severe Combined Immunodeficiency.</a> Frontiers in Immunology. 9, 429(2018).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+immunodeficient+rabbits+by+multiplex+embryo+transfer+and+multiplex+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Production of immunodeficient rabbits by multiplex embryo transfer and multiplex gene targeting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12202(2017).</li>
</ol>

J. C. lavora presso Celetrix LLC, produttore dell'elettroporatore a tubi. L. M., L. J., J. S., D. Y., J. , Y. E. C., e J. X. non dichiarano interessi concorrenti.

Il metodo di elettroporazione dei tubi è stato efficace nel fornire RNP e ssODN CRISPR/Cas9 alle cellule di coniglio e esseri umani, portando a un robusto editing genetico preciso (PGE). La differenza principale tra TE e altri dispositivi di elettroporazione convenzionali è l'uso di un tubo, in cui due elettrodi si trovano nella parte superiore e inferiore del tubo e il campione viene caricato per intero e poi sigillato su elettroporazione (Figura 1). Al contrario, in una cuvette convenzionale, gli elettrodi sono ai lati e il campione non è completamente sigillato durante l'elettroporazione. Questo nuovo design riduce la generazione di bolle d'aria e comprime le dimensioni delle bolle d'aria, che di conseguenza migliora anche la distribuzione della tensione elettrica, e di conseguenza porta a una riduzione della morte cellulare e ad un'elevata efficienza di trasfezione9. Nel presente lavoro, alti tassi di PGE (15%-37%) sono stati raggiunti mirando ai geni EGFR, Mybpc3 e HBB negli iPSC umani. Questi risultati sono coerenti con una precedente relazione in cui sono stati raggiunti tassi elevati di PGE nelle cellule staminali umane9.
Le mutazioni che causano malattie sono state prese di mira nei geni IL2RG e SPR nelle cellule di coniglio. Recentemente, i conigli knockout IL2RG sono stati prodotti come modelli per l'immunodeficienza combinata grave legata all'X umana (SCID-X1)16,17. Il lavoro attuale mostra che le mutazioni IL2RG del paziente (ad esempio, C231Y e Q235X) possono essere generate in modo efficiente nelle cellule del coniglio, dimostrando la fattibilità della creazione di modelli di coniglio SCID-X1 che trasportano mutazioni del paziente. È stato anche dimostrato che le mutazioni di SPR R150G possono essere create in modo efficiente nelle cellule di coniglio. Questa mutazione causa deficit motori e cognitivi nei bambini12. Questi modelli di coniglio di mutazione IL2RG e SPR, una volta generati, possono servire come preziosi modelli preclinici per gli studi traslazionali. Possono anche essere utilizzati per stabilire terapie basate sull'editing genico per queste malattie monogeniche.
Una preoccupazione per le applicazioni di editing genico mediato da CRISPR/Cas9 sono gli eventi di editing off-target. I tassi Indel sono stati analizzati in corrispondenza dei siti top off-target previsti per gli sgRNA utilizzati nel presente studio (Tabella S1), utilizzando metodi descritti in precedenza9. In totale, sette potenziali loci top off-target sono stati analizzati per sg-rb-IL2RG-01, cinque per sg-rb-SPR, sette per sg-hEGFR, cinque per sg-hMybpc3 e sette per sg-hHBB), utilizzando i primer elencati nella tabella S2. Nessun indeldi fuori bersaglio è stato rivelato dai saggi T7E1 (Figura S1), che indicano rischi minimi off-target per l'editing genico mediato da CRISPR/Cas9 utilizzando questi sgRNA. Indica inoltre che il metodo di elettroporazione dei tubi stesso non causa o aumenta le modifiche fuori bersaglio. Tuttavia, gli sforzi dovrebbero essere dedicati a ridurre o eliminare le modifiche fuori target indesiderate. Il sequenziamento dell'intero genoma può essere necessario per escludere tali eventi per le cellule che sono destinate ad essere utilizzate in applicazioni cliniche.
A livello tecnico, i seguenti sono considerati fattori chiave per ottenere un'efficace modifica precisa del genoma mediante l'elettroporazione dei tubi CRISPR/Cas9 RNP. In primo luogo, si consiglia di selezionare uno sgRNA efficiente con il previsto basso potenziale di destinazione. È importante convalidare l'efficienza indel dello sgRNA selezionato prima di utilizzarlo per le applicazioni PEG. Non è raro che un software previsto un buon sgRNA non riesce al passaggio di convalida.
In secondo luogo, per ottenere un'elevata PGE, si raccomanda di indurre una mutazione PAM al donatore ssODN quando possibile. La logica è che così facendo, il re-taglio CRISPR/Cas9 dopo l'integrazione del modello donatore è impedito. In alcuni casi, la PGE stessa introduce mutazioni PAM. In altri casi, è possibile introdurre mutazioni silenziose nella sequenza PAM. Nel caso in cui una mutazione PAM non sia possibile, si consiglia di cercare di includere diverse mutazioni silenziose nel donatore che corrisponde alla sequenza di sgRNA.
In terzo luogo, particolarmente rilevante per TE, è importante evitare la formazione di bolle d'aria durante il trasferimento di cellule e miscela di RNP al tubo di elettroporazione. Mentre la progettazione di un tubo TE riduce già al minimo la formazione di bolle d'aria, un'attenta manipolazione ridurrà ulteriormente e potrebbe anche completare evitare la formazione di bolle d'aria. Una guida di risoluzione dei problemi per i frequenti problemi che possono verificarsi nell'applicazione dell'elettroporazione dei tubi per la ribonucleoproteina CRISPR/Cas9 ha mediato un'editing genetico preciso mediato nella Tabella 2.
In conclusione, è dimostrato qui che l'elettroporazione dei tubi è un mezzo efficace per la consegna di RNP CRISPR/Cas9 e ssODN alle cellule dei mammiferi per ottenere alti tassi di PGE. Questa nuova tecnica di trasfezione TE e il suo robusto tasso preciso di editing genico possono facilitare lo sviluppo di applicazioni di editing genico.

CRISPR/Cas9 è la nucleasi programmabile più comunemente utilizzata per l'editing genico. Funziona attraverso il riconoscimento mediato dall'RNA a guida singola (sgRNA) di entrambe le sequenze bersaglio e una sequenza di motivi adiacenti (PAM) del protospaziale adiacente nel genoma. La nucleasi Cas9 genera una rottura del DNA a doppio filamento (DSB) situato tre nucleotidi a monte della sequenza PAM1. I DSB vengono riparati attraverso percorsi di fine non omologa (NHEJ) soggetti a errori o percorsi di riparazione (HDR). Per ottenere un'editing genetico preciso attraverso il percorso HDR, i modelli di donatori sono spesso forniti nel formato del DNA plasmide (pDNA) o dell'oligodoxynucleotide a filamento singolo (ssODN).
CRISPR/Cas9 e lo sgRNA possono essere consegnati alle cellule in tre formati: il complesso di ribonucleoproteina (RNP) della proteina Cas9 e gRNA2,3; Cas9 mRNA e sgRNA4,5; o DNA plasmide (pDNA) che contiene i promotori necessari, sgRNA guidato, e Cas9 regione di codifica6,7,8. Molti gruppi hanno dimostrato che quando CRISPR/Cas9 viene consegnato come RNP, l'efficienza dell'editing genico spesso supera quelle ottenute nei formati pDNA o mRNA, attribuibile alle dimensioni molto più piccole di RNP rispetto agli acidi nucleici9. Inoltre, è stato precedentemente dimostrato che una nuova macchina per l'elettropotenza dei tubi (TE) è particolarmente efficace nelle applicazioni di editing genico in diversi tipi di cellule9.
Nel presente lavoro è presentato un protocollo passo-passo nell'utilizzo di TE per la consegna di RNP CRISPR/Cas9 a cellule di mammiferi di specie diverse in diversi loci clinicamente rilevanti. Questa nuova tecnica di trasfezione TE e il fenomeno ad alto tasso di HDR possono trovare ampie applicazioni nella ricerca biomedica.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>792</td><td>Soluzione di distacco cellulare per iPSC umane, utilizzata per la prima volta nella fase 1.1.2.</td></tr><tr><td>Cas9 Nucleasi 3NLS</td><td>IDT</td><td>1074182</td><td>proteina Cas9, utilizzata per la prima volta nella fase 3.3.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11965092</td><td>Per colture cellulari, utilizzato per la prima volta nella fase 1.2.3.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>1708075</td><td>Per la preparazione di colture cellulari, utilizzato per la prima volta nella fase 1.2.2.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Lonza</td><td>51201</td><td>Per la produzione di tampone di lisi, utilizzato per la prima volta nel passaggio 4.1.</td></tr><tr><td>Tampone per elettroporazione</td><td>Celetrix</td><td>13&ndash; 0104</td><td>Il tampone di elettroporazione, utilizzato per la prima volta nel passaggio 3.2.</td></tr><tr><td>Tubi per elettroporazione</td><td>Celetrix</td><td>20 &mu; L: 12&ndash; 0107; 120 &mu; L: 12&ndash; 0104</td><td>Il tubo di elettroporazione, utilizzato per la prima volta nel passaggio 3.4.</td></tr><tr><td>Elettroporatore</td><td>Celetrix</td><td>CTX-1500A LE</td><td>La macchina per l'elettroporazione a tubi, utilizzata per la prima volta nella fase 3.5</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td>Per colture cellulari, utilizzata per la prima volta nella fase 1.2.2.</td></tr><tr><td>Incubatori Forma CO2</td><td>Thermo Fisher</td><td>Modello 370</td><td>Per colture cellulari, utilizzato per la prima volta nella fase 1.1.</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel</td><td>Qiagen</td><td>28115</td><td>Per la purificazione del gel, utilizzato per la prima volta nel passaggio 4.3.</td></tr><tr><td>Cellule staminali pluripotenti indotte umane</td><td>Collezione di colture di tipo americano</td><td>ACS-1030</td><td>iPSC umane, utilizzate per la prima volta nella fase 1.1.</td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrice extracellulare artificiale; per il prerivestimento di piastre di coltura cellulare, utilizzata per la prima volta nella fase 1.1.</td></tr><tr><td>mTeSR 1 medio&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>Terreno di coltura cellulare senza alimentatore per iPSC umane, utilizzato per la prima volta nella fase 1.1.</td></tr><tr><td>PCR SV mini</td><td>GeneAll</td><td>103-102</td><td>Per la purificazione del prodotto PCR, utilizzato per la prima volta nel passaggio 4.3.</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140163</td><td>Per la preparazione di colture cellulari, utilizzato per la prima volta nella fase 1.2.2.</td></tr><tr><td>Fenolo-cloroformio</td><td>Thermo Fisher</td><td>15593031</td><td>Per l'estrazione del DNA, utilizzato per la prima volta nella fase 4.2.</td></tr><tr><td>Kit di sintesi di gRNA di precisione</td><td>Invitrogen</td><td>A29377</td><td>Per la generazione di gRNA a lunghezza intera (RNA guida), utilizzato per la prima volta nel passaggio 2.4.</td></tr><tr><td>Soluzione di proteinasi K</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM2548</td><td>per l'estrazione del DNA, utilizzata per la prima volta nella fase 4.1.</td></tr><tr><td>DNA polimerasi ad alta fedeltà Q5</td><td>NEB</td><td>M0491</td><td>Per l'amplificazione PCR, utilizzata per la prima volta nella fase 4.3.</td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>Per la produzione di tampone di lisi, utilizzato per la prima volta nel passaggio 4.1.</td></tr><tr><td>Kit di clonazione TA&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>K457502</td><td>per il sequenziamento di cloni TA, utilizzato per la prima volta nella fase 4.4.</td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale (10 cm)</td><td>FALCON</td><td>353003</td><td>Per colture cellulari, utilizzato per la prima volta nella fase 1.2.3.&nbsp;</td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale (12 pozzetti)</td><td>FALCON</td><td>353043</td><td>Per coltura cellulare, utilizzato per la prima volta nella fase 3.7.</td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale (6 cm)</td><td>FALCON</td><td>353004</td><td>Per coltura cellulare, utilizzato per la prima volta nella fase 1.2.2.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP1757-500</td><td>Per la produzione di tampone di lisi, utilizzato per la prima volta nel passaggio 4.1.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td>Per la digestione cellulare, utilizzato per la prima volta nella fase 1.2. 4.</td></tr> <tr><td>Puntali per pipette universali&nbsp;</td><td>Celetrix</td><td>14-0101</td><td>Per elettroporazione, utilizzato per la prima volta nella fase 3.4.</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>LC Labs</td><td>Y-5301</td><td>L'inibitore dell'apoptosi, utilizzato per la prima volta nel passaggio 1.1.1.</td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 ribonucleoproteina-mediato precision gene editing da elettroporazione tube

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Le nucleasi di modifica genica, rappresentate dalla proteina associata a CRISPR 9 (Cas9), stanno diventando strumenti tradizionali nella ricerca biomedica. La corretta consegna di elementi CRISPR/Cas9 nelle cellule bersaglio mediante la trasfezione è un prerequisito per un'efficiente modifica genica. Questo protocollo dimostra che la consegna mediata dalla macchina per elettroporata a tubo di ribonucleoproteina CRISPR/Cas9 (RNP), insieme a modelli di donatori di oligodeoxynucleotide (ssODN) a un solo filamento a diversi tipi di cellule di mammiferi, porta a robusti eventi di editing genico precisi. In primo luogo, TE è stato applicato per fornire RNP e ssODN CRISPR/Cas9 per indurre mutazioni che causano la malattia nel gene della sottounità di interleuchino 2 gamma (IL2RG) e nel gene della reduzione seppiatria (SPR) nelle cellule fibroblaste del coniglio. Tassi di mutazione precisi del 3,57%-20% sono stati raggiunti come determinato dal sequenziamento batterico della clonazione TA. La stessa strategia è stata poi utilizzata negli iPSC umani su diversi geni clinicamente rilevanti, tra cui il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), la proteina Legante della miosina C, il cuore (Mybpc3) e la beta della sottounità di emoglobina (HBB). Sono stati raggiunti tassi di mutazioni precisi e precisi (11,65%-37,92%) come determinato dal sequenziamento profondo (DeepSeq). Il lavoro attuale dimostra che l'elettroporazione a tubo del RNP CRISPR/Cas9 rappresenta un efficiente protocollo di trasfezione per l'editing genico nelle cellule dei mammiferi.

TE di RNP Cas9 e ssODNs alle cellule fibroblaste di coniglio
Il processo complessivo di consegna mediata da TE di Cas9 RNP alle cellule dei mammiferi è illustrato nella Figura 1. In primo luogo, sono state prodotte mutazioni C231Y e Q235X nel gene IL2RG, e la mutazione R150G è stata prodotta nel gene SPR nelle cellule fibroblaste del coniglio. Le mutazioni di perdita di funzione nei geni IL2RG e SPR sono note per causare l'immunodeficienza primaria11 e i deficit motori e cognitivi12, rispettivamente.
I progetti specifici di sgRNA sono illustrati nella Figura 2A. I primer utilizzati per amplificare le regioni mirate sono elencati nella tabella 3. Le sequenze di ssODN sono mostrate nella Tabella 1. I tassi di editing genico sono stati determinati dalla clonazione TA batterica (Figura2B). Al locus IL2RG C231, dei 28 cloni in sequenza, uno (3,57%) ha portato la mutazione precisa C231Y, quattro (14,28%) hanno portato mutazioni di inserimento o delezione (indel) e le restanti 23 (82%) erano wild-tipo. Al locus IL2RG Q235, dei 27 cloni in sequenza, due (7,41%) ha portato la mutazione precisa Q235X, tre mutazioni indel trasportate (11,11%) e gli altri erano wild-type. Al locus SPG R150, dei 20 cloni in sequenza, cinque (25%) ha portato la mutazione precisa di R150G, 10 (50%) portato mutazioni indel, e il resto erano wild-tipo.
TE di RNP Cas9 e ssODN agli iPSC umani
TE è stato quindi utilizzato per fornire RNP e ssODN Cas9 agli iPSC umani e indirizzare loci clinicamente rilevanti nei geni EGFR, Mybpc3 e HBB. Le mutazioni puntiformi nella regione prossimale EGFR T790 conferiscono resistenza agli inibitori della chinasi della tirosina EGFR in pazienti con cancro polmonare a cellule non piccole (NSCLC) che ospitano mutazioni attivanti dell'EGFR13. Una mutazione del frameshift in exon 16 in Mybpc3 è implicata nella cardiomiopatia ipertrofica14. La mutazione a punti E6V nel gene HBB porta alla malattia delle cellule falciformi15.
I progetti specifici di sgRNA sono illustrati nella Figura 3A. I primer utilizzati per amplificare le regioni mirate sono elencati nella tabella 3. Le sequenze di ssODN sono mostrate nella Tabella 1. I tassi di editing genico sono stati determinati dal DeepSeq (Figura3B). Al locus EGFR, il 15,68% degli alleli trasportava le mutazioni puntiformi precise (6.315 letture), il 22,75% trasportava mutazioni indel (9.162 letture), e il restante 61,57% erano di tipo selvaggio (24.797 letture). Al locus di Mybpc3, il 37,92% ha effettuato la precisa delezione TGAA a 4 bp (11.654 letture), il 2,24% trasportava mutazioni indel (410 letture) e il restante 59,84% erano wild-type (18.692 letture). Al locus HBB, l'11,65% trasportava la mutazione precisa dell'E6V (6.565 letture), il 23,35% trasportava mutazioni indel (13.163 letture) e il restante 65% erano di tipo selvaggio (36.644 letture).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig1.jpg"> Figura 1: Diagramma di flusso dell'elettroporazione a tubo di Cas9 RNP.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig2.jpg"> Figura 2 : modifica genica delle cellule fibroblaste di coniglio. (A) Illustrazione delle sequenze di destinazione. Le scatole indicano loci mirati. Le lettere sottolineate corrispondono a sequenze di gRNA. Le lettere di colore rosso indicano le sequenze PAM. (B) Risultati della clonazione TA degli eventi di editing genico. Le caselle indicano loci mutati con precisione. La sequenza Indel mostrata è rappresentativa solo di un tipo di allele. Altre sequenze indel non vengono visualizzate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59512/59512fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig3.jpg"> Figura 3 : Modifica genica degli iPSC umani. (A) Illustrazione delle sequenze di destinazione. Le scatole indicano loci mirati. Le lettere sottolineate corrispondono alla sequenza di gRNA. Le lettere di colore rosso indicano le sequenze PAM. (B) Risultati Deepseq degli eventi di editing genetico. Le caselle indicano loci mutati con precisione. Le lettere di colore rosso indicano mutazioni silenziose introdotte nei modelli di donatore. La sequenza Indel mostrata è rappresentativa solo di un tipo di allele. Altre sequenze indel non vengono visualizzate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59512/59512fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>luogo geometrico</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">
Sequenza di Oligo 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>(mutazione mirata)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Coniglio IL2RG (C231Y)</td>
			<td colspan="8">AGCGTGGATGGGCAGAAACTCGTTGTTCCGAGTGGAGCTTTCTCTTTGTGTGGGGAGTGGGGGGGGAGTGAGTGGCTCAGGGAGT GAATGGAGCCACCCGATGCCTGGBAGAAACTTCAAAGGGTAAATGGGCGCCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Coniglio IL2RG (Q235X)</td>
			<td colspan="8">AGCGTGGATGGGCAGAAACTCGTTGTTCCGAGTGGAGGAGGGAGTCTCTCTTTGTGTGTGGGAGTGGCTTAGTAGTGGAGGAGT GAATGGAGCCACCCGATGCCTGGBAGAAACTTCAAAGGGTAAATGGGCGCCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Coniglio SPR</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">gacctccatgcgcgcgcgcctgcctggcctgaaggtttcctgccagtcctggCctcagcgggtgtggtgtgggaacatcgtgcgcgcgcgcgcgcgcgcagcccttcaggaggggggggg cgctgtac</td>
		</tr>
<tr>
<td>(R150G)</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGFR umano</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">ACGTGATGGGGCCAGCGTACAACCCCCGTGGCGCCTGGCTCTCTCTCCTCTACTCCCCCCCCCCAGTCCAACTGATTACCC AGGCGCGCCCCCGGCTCTCTCTGGACTATCCGAACACAAGACAATTGGCTCCCAGTAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Le mutazioni puntiformi si avvicinano a T790)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Umano Mybpc3</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">GCCCCCTGTGCTCATCACGCCTGGAGGACCAGGCGGGGGGGGGGGGGCGGGGGGTTGCGAGTATCGGAGTGGAGTATCGGA GGAGGGCGCGGCAGTCAAGAGTGGAGTTCCAGAAGCACGGGGGGGGGTTGGGGGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>(eliminazione di 4 bp)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBB Umano</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">TCTGACACAACTGTTCATAGCAACCTCAACACAGAC CTGTGGGGBARAGGTGAACGTGGGAAGTGGGGGGAGGGGCGCGGGCGGGGGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>(E6V)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Sequenze di ssODN.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>passo</td>
			<td>problema</td>
			<td>Possibili motivi</td>
			<td>Soluzioni</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1 (inquesto&gt;</td>
			<td>Basso tasso di indele</td>
			<td>Scarsa progettazione dell'RNA guida, Guide RNA stocks &gt;6 months, bassa concentrazione di RNA guida</td>
			<td>Guida di riprogettazione dell'RNA, produce/ordina nuova guida l'RNA.</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.3 3 La sua</td>
			<td>Bassa efficienza PGE</td>
			<td>scarsa progettazione del DNA del donatore, RNA guida a basso efficienza, quantità errata di DNA del donatore o DNA di scarsa qualità</td>
			<td>Aumentare la lunghezza del braccio di omologia, introdurre la mutazione PAM, introdurre mutazioni silenziose al DNA del donatore, utilizzare una guida più efficiente RNA, Ottimizzare il rapporto di proteina Cas9 rispetto all'RNA guida.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3.4 (in questo stato del documento)</td>
			<td>Trasfezione non riuscita</td>
			<td>Bolle d'aria formate durante il trasferimento di miscela cellule-buffer al tubo di elettroporazione, impostazione errata tensione/durata</td>
			<td>Cercate di evitare la formazione di bolle d'aria, regolare l'impostazione di tensione / durata.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3.6</td>
			<td>bassa vitalità cellulare dopo l'elettroporazione</td>
			<td>Bassa sopravvivenza del singolo ipsc umano</td>
			<td>Aggiungere l'inibitore rock dopo l'elettroporazione, aumentare il numero di cellule.</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.1 (in questo stato del documento)</td>
			<td>PCR non riuscito</td>
			<td>Contenuti GC elevati o sequenza ripetitiva</td>
			<td>Ottimizzare la condizione PCR, aggiungere DMSO al sistema PCR.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Guide alla risoluzione dei problemi relativi a problemi frequenti.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome primer</td>
			<td>sequenza</td>
			<td>nota</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rb-IL2RG-F</td>
			<td>CATGACAGTGACAGGCCC</td>
			<td rowspan="2">Per amplificare il frammento di DNA IL2RG del coniglio</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rb-IL2RG-R</td>
			<td>TGCCAGAGACACAGCGAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rb-SPR-F</td>
			<td>GTACTTTGGAGGGAGAGG</td>
			<td rowspan="2">Per amplificare il frammento di DNA SPR del coniglio</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-SPR-R</td>
			<td>CTCAGCACCCTGACACTGgGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-EGFR-F</td>
			<td>TGATGGCCAGCGTGGACAAC</td>
			<td rowspan="2">Per amplificare il frammento di DNA umano EGFR</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-EGFR-R</td>
			<td>ACCAGTTGAGCAGGTACTGgGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-Mybpc3-F</td>
			<td>ATGCCCCGTGCTTCTGGAAC</td>
			<td rowspan="2">Per amplificare il frammento di DNA umano di Mybpc3</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-Mybpc3-R</td>
			<td>TCAGGGGAGCCAACCCTCAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-HBB-F</td>
			<td>TAACCTTGATACCCTCtGC</td>
			<td rowspan="2">Per amplificare il frammento umano di DNA HBB</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-HBB-R</td>
			<td>CATTTGCTTCTGACACAACT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: Primer utilizzati nel passaggio 4.3.

Presentato qui è un protocollo per l'efficiente editing genico mediato da ribonucleoproteina CRISPR/Cas9 nelle cellule dei mammiferi utilizzando l'elettroporazione dei tubi.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteina-mediato Precision Gene Editing da Elettroporazione Tube

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Fornire in modo sicuro ed efficace elementi Cas9 nelle cellule è fondamentale per le terapie basate sull'editing genico. I protocolli che mostriamo qui mostrano un nuovo approccio in quella direzione. Il protocollo utilizza un nuovo metodo di elettroporazione chiamato elettroporazione del tubo.Ciò porta ad alti tassi di sopravvivenza cellulare e tassi di editing genico. Il metodo di elettroporazione del tubo è virus, farmaco e l'arricchimento del reporter libero. Questi sono preferiti nelle applicazioni cliniche, quindi con le terapie basate sull'editing genico.Il metodo è universalmente applicabile a molti tipi di cella. Ad esempio, le cellule ematopoietiche umane, le cellule T primarie e altre cellule possono essere modificate usando il nostro metodo. Questo metodo di elettroporazione del tubo utilizza un tubo sottile.Se sei un utente per la prima volta, puoi provare GFP ad esprimere DNA plasmide. A dimostrare la procedura sarà Linyuan Ma, un postdoc del mio laboratorio. Per avviare questa procedura acquisire iPSC umani dalla American Type Culture Collection.Coltura gli iPSC su matrice extracellulare artificiale con mezzo di coltura cellulare privo di alimentatori in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica seguendo le istruzioni del fornitore. Due ore prima della trasfezione trattare gli iPSC con bobina arrotolato associata a Rho micromolare contenente inibitore della protein chinasi Y-27632. Durante la trasfettazione, dissociare gli iPSC con la soluzione di distacco cellulare a singole cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti.Quindi contare il numero di celle. Per stabilire una coltura cellulare di fibroblasti di coniglio ottenere una biopsia della pelle dell'orecchio dalla punta di un orecchio di coniglio. Risciacquare il tessuto due volte con DPBS contenente il 5%di penicillina-streptomicina.Trasferire il tessuto dell'orecchio risciacquato in un nuovo piatto di coltura tissutale di sei centimetri e tagliare il tessuto a piccoli pezzi, ognuno di circa uno per un millimetro. Aggiungere alcune gocce di FBS per evitare che il tessuto si asciughi. Dopo questo, stendere il tessuto triturato in un piatto di coltura tissutale di 10 centimetri e aggiungere 10 millilitri di mezzo di coltura.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per tre o cinque giorni. Da tre a cinque giorni dopo la placcatura utilizzare Trypsin-EDTA per digerire le cellule a 37 gradi Celsius per due minuti, quindi contare il numero di celle. Dopo aver progettato e sintetizzato i gRNA e gli oligo donatori, preparare le cellule come descritto in precedenza.Rimescolare da 20 a 30.000 cellule in 20 microlitri di tampone di elettroporazione. Pipetta su e giù con cura per produrre una singola sospensione cellulare. Per la trasfezione Cas9 RNP, pre-mescolare due microgrammi di proteina Cas9 NLS con 0,67 microgrammi di gRNA a temperatura ambiente per 10-15 minuti.Mescolare delicatamente il complesso RNP formato con due microgrammi di ssODN con le cellule. Utilizzando punte di pipetta universali dal kit di elettroporazione, trasferire la miscela cellulare in un tubo di elettroporazione a 20 microliter. Posizionare il tubo di elettroporazione nella fessura dell'elettroporatore e premere andare a finire.Un ciclo di elettroporazione riuscito è indicato dal rapporto di impulso sullo schermo dell'elettroporatore. Dopo l'elettroporazione trasferire le cellule iPS umane in un millilitro di Y-27632 pre-riscaldato contenente il mezzo di coltura come descritto in precedenza. Quindi placcare le cellule rimostrate in un pozzo di una piastra di coltura cellulare di 12 po '.Continua a coltivare il piatto, assicurandoti di cambiare il mezzo di coltura ogni giorno. Y-27632 viene rimosso dal mezzo di coltura iPSC umano 24 ore dopo l'elettroporazione. 72 ore dopo l'elettroporazione, raccogliere le cellule.Per le cellule fibroblatrici di coniglio, utilizzare Trypsin-EDTA per digerire le cellule dalla piastra di coltura. Per gli iPSC umani utilizzare la soluzione di distacco cellulare per digerire le cellule dalle piastre di coltura. Centrifugare brevemente i campioni a 1000 giri/min per cinque minuti e rimescolare le cellule con 350 millilitri di tampone dilisi.Incubare durante la notte a 55 gradi Celsius. Il giorno dopo estrarre il DNA genomico con fenolo-cloroformio utilizzando procedure standard. Amplifica da 100 a 200 basi coppie di frammenti di DNA provenienti da gel utilizzando un kit di estrazione del gel o direttamente da prodotti PCR utilizzando un mini kit PCR SV.Per determinare l'efficienza di editing genico mediante sequenziamento delle colonie batteriche, utilizzare un kit di clonazione TOPO-TA per ligare i prodotti PCR purificati in un vettore PCR4-TOPO. Raccogli casualmente cloni batterici e sequenzia gli inserti utilizzando un primer di sequenziamento universale fornito dal kit di clonazione TOPO-TA. Per determinare l'efficienza di editing genico mediante sequenziamento profondo, inviare i prodotti PCR purificati precedentemente ottenuti per il sequenziamento dell'amplicon CRISPR in un nucleo di sequenziamento del DNA.In questo studio viene utilizzato efficacemente un metodo di elettroporazione del tubo per fornire CRISPR/Cas9 RNP e ssODN a cellule di coniglio e umane, portando a un editing genico robusto e preciso. In primo luogo, le mutazioni C231Y e Q235X sono prodotte nel gene IL2RG, e la mutazione R150G è prodotta nel gene SPR nelle cellule fibroblasti di coniglio. I progetti specifici di sgRNA e i tassi di editing genico determinati dalla clonazione di TA batterica sono mostrati qui.Il locus IL2RG C231, dei 28 cloni sequenziati, si porta la precisa mutazione C231Y, quattro portano mutazioni di inserimento o cancellazione, e i restanti 23 sono di tipo selvaggio. Al locus IL2RG Q235, dei 27 cloni sequenziati, due portano la precisa mutazione Q235X, tre portano una mutazione indelebile e gli altri sono di tipo selvaggio. Al locus SPG R150, dei 20 cloni sequenziati, cinque portano la precisa mutazione genica R150, 10 portano mutazioni indele, e gli altri sono di tipo selvaggio.L'elettroporazione del tubo viene quindi utilizzata per fornire Cas9 RNP e ssODN agli iPSC umani e indirizzare loci clinicamente rilevanti nei geni EGFR, Mybpc3 e HBB. Al locus EGFR, il 15,68% degli alleli porta le mutazioni puntili precise, il 22,75% porta mutazioni indeli e il restante 61,57% è di tipo selvaggio. Al locus Mybpc3, il 37,92% porta la precisa cancellazione TGAA a quattro coppie di basi, il 2,24% porta mutazioni indele e il restante 59,84% è di tipo selvaggio.Al locus HBB, l'11,5% porta la mutazione E6V precisa, il 35,4% porta mutazioni indele e il restante 65% è di tipo selvatico. Cas9 RNP è la forma preferita di Cas9 a causa delle sue dimensioni più piccole rispetto al DNA plasmide. L'elettroporazione del tubo è un metodo efficace per fornire Cas9 RNP.Siamo particolarmente interessati all'utilizzo dell'elettroporazione del tubo di Cas9 RNP nelle celle T primarie per applicazioni CAR T.

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