CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteina-mediato Precision Gene Editing da Elettroporazione Tube
June 20th, 2019
Presentato qui è un protocollo per l'efficiente editing genico mediato da ribonucleoproteina CRISPR/Cas9 nelle cellule dei mammiferi utilizzando l'elettroporazione dei tubi.
Fornire in modo sicuro ed efficace elementi Cas9 nelle cellule è fondamentale per le terapie basate sull'editing genico. I protocolli che mostriamo qui mostrano un nuovo approccio in quella direzione. Il protocollo utilizza un nuovo metodo di elettroporazione chiamato elettroporazione del tubo.
Ciò porta ad alti tassi di sopravvivenza cellulare e tassi di editing genico. Il metodo di elettroporazione del tubo è virus, farmaco e l'arricchimento del reporter libero. Questi sono preferiti nelle applicazioni cliniche, quindi con le terapie basate sull'editing genico.
Il metodo è universalmente applicabile a molti tipi di cella. Ad esempio, le cellule ematopoietiche umane, le cellule T primarie e altre cellule possono essere modificate usando il nostro metodo. Questo metodo di elettroporazione del tubo utilizza un tubo sottile.
Se sei un utente per la prima volta, puoi provare GFP ad esprimere DNA plasmide. A dimostrare la procedura sarà Linyuan Ma, un postdoc del mio laboratorio. Per avviare questa procedura acquisire iPSC umani dalla American Type Culture Collection.
Coltura gli iPSC su matrice extracellulare artificiale con mezzo di coltura cellulare privo di alimentatori in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica seguendo le istruzioni del fornitore. Due ore prima della trasfezione trattare gli iPSC con bobina arrotolato associata a Rho micromolare contenente inibitore della protein chinasi Y-27632. Durante la trasfettazione, dissociare gli iPSC con la soluzione di distacco cellulare a singole cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Quindi contare il numero di celle. Per stabilire una coltura cellulare di fibroblasti di coniglio ottenere una biopsia della pelle dell'orecchio dalla punta di un orecchio di coniglio. Risciacquare il tessuto due volte con DPBS contenente il 5%di penicillina-streptomicina.
Trasferire il tessuto dell'orecchio risciacquato in un nuovo piatto di coltura tissutale di sei centimetri e tagliare il tessuto a piccoli pezzi, ognuno di circa uno per un millimetro. Aggiungere alcune gocce di FBS per evitare che il tessuto si asciughi. Dopo questo, stendere il tessuto triturato in un piatto di coltura tissutale di 10 centimetri e aggiungere 10 millilitri di mezzo di coltura.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per tre o cinque giorni. Da tre a cinque giorni dopo la placcatura utilizzare Trypsin-EDTA per digerire le cellule a 37 gradi Celsius per due minuti, quindi contare il numero di celle. Dopo aver progettato e sintetizzato i gRNA e gli oligo donatori, preparare le cellule come descritto in precedenza.
Rimescolare da 20 a 30.000 cellule in 20 microlitri di tampone di elettroporazione. Pipetta su e giù con cura per produrre una singola sospensione cellulare. Per la trasfezione Cas9 RNP, pre-mescolare due microgrammi di proteina Cas9 NLS con 0,67 microgrammi di gRNA a temperatura ambiente per 10-15 minuti.
Mescolare delicatamente il complesso RNP formato con due microgrammi di ssODN con le cellule. Utilizzando punte di pipetta universali dal kit di elettroporazione, trasferire la miscela cellulare in un tubo di elettroporazione a 20 microliter. Posizionare il tubo di elettroporazione nella fessura dell'elettroporatore e premere andare a finire.
Un ciclo di elettroporazione riuscito è indicato dal rapporto di impulso sullo schermo dell'elettroporatore. Dopo l'elettroporazione trasferire le cellule iPS umane in un millilitro di Y-27632 pre-riscaldato contenente il mezzo di coltura come descritto in precedenza. Quindi placcare le cellule rimostrate in un pozzo di una piastra di coltura cellulare di 12 po '.
Continua a coltivare il piatto, assicurandoti di cambiare il mezzo di coltura ogni giorno. Y-27632 viene rimosso dal mezzo di coltura iPSC umano 24 ore dopo l'elettroporazione. 72 ore dopo l'elettroporazione, raccogliere le cellule.
Per le cellule fibroblatrici di coniglio, utilizzare Trypsin-EDTA per digerire le cellule dalla piastra di coltura. Per gli iPSC umani utilizzare la soluzione di distacco cellulare per digerire le cellule dalle piastre di coltura. Centrifugare brevemente i campioni a 1000 giri/min per cinque minuti e rimescolare le cellule con 350 millilitri di tampone dilisi.
Incubare durante la notte a 55 gradi Celsius. Il giorno dopo estrarre il DNA genomico con fenolo-cloroformio utilizzando procedure standard. Amplifica da 100 a 200 basi coppie di frammenti di DNA provenienti da gel utilizzando un kit di estrazione del gel o direttamente da prodotti PCR utilizzando un mini kit PCR SV.
Per determinare l'efficienza di editing genico mediante sequenziamento delle colonie batteriche, utilizzare un kit di clonazione TOPO-TA per ligare i prodotti PCR purificati in un vettore PCR4-TOPO. Raccogli casualmente cloni batterici e sequenzia gli inserti utilizzando un primer di sequenziamento universale fornito dal kit di clonazione TOPO-TA. Per determinare l'efficienza di editing genico mediante sequenziamento profondo, inviare i prodotti PCR purificati precedentemente ottenuti per il sequenziamento dell'amplicon CRISPR in un nucleo di sequenziamento del DNA.
In questo studio viene utilizzato efficacemente un metodo di elettroporazione del tubo per fornire CRISPR/Cas9 RNP e ssODN a cellule di coniglio e umane, portando a un editing genico robusto e preciso. In primo luogo, le mutazioni C231Y e Q235X sono prodotte nel gene IL2RG, e la mutazione R150G è prodotta nel gene SPR nelle cellule fibroblasti di coniglio. I progetti specifici di sgRNA e i tassi di editing genico determinati dalla clonazione di TA batterica sono mostrati qui.
Il locus IL2RG C231, dei 28 cloni sequenziati, si porta la precisa mutazione C231Y, quattro portano mutazioni di inserimento o cancellazione, e i restanti 23 sono di tipo selvaggio. Al locus IL2RG Q235, dei 27 cloni sequenziati, due portano la precisa mutazione Q235X, tre portano una mutazione indelebile e gli altri sono di tipo selvaggio. Al locus SPG R150, dei 20 cloni sequenziati, cinque portano la precisa mutazione genica R150, 10 portano mutazioni indele, e gli altri sono di tipo selvaggio.
L'elettroporazione del tubo viene quindi utilizzata per fornire Cas9 RNP e ssODN agli iPSC umani e indirizzare loci clinicamente rilevanti nei geni EGFR, Mybpc3 e HBB. Al locus EGFR, il 15,68% degli alleli porta le mutazioni puntili precise, il 22,75% porta mutazioni indeli e il restante 61,57% è di tipo selvaggio. Al locus Mybpc3, il 37,92% porta la precisa cancellazione TGAA a quattro coppie di basi, il 2,24% porta mutazioni indele e il restante 59,84% è di tipo selvaggio.
Al locus HBB, l'11,5% porta la mutazione E6V precisa, il 35,4% porta mutazioni indele e il restante 65% è di tipo selvatico. Cas9 RNP è la forma preferita di Cas9 a causa delle sue dimensioni più piccole rispetto al DNA plasmide. L'elettroporazione del tubo è un metodo efficace per fornire Cas9 RNP.
Siamo particolarmente interessati all'utilizzo dell'elettroporazione del tubo di Cas9 RNP nelle celle T primarie per applicazioni CAR T.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per il montaggio genico mediato da ribonucleoproteine CRISPR/Cas9 in cellule di mammiferi utilizzando l'elettroporazione in tubo. Questo nuovo metodo migliora la sopravvivenza cellulare e i tassi di montaggio genico, essendo privo di virus e farmaci.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Montaggio genico
- Tecnologia CRISPR/Cas9
- Biologia cellulare
Sfondo
- La consegna efficiente degli elementi Cas9 è cruciale per il montaggio genico.
- L'elettroporazione in tubo è un nuovo metodo che migliora l'efficienza di consegna.
- Il metodo è applicabile a vari tipi di cellule, inclusi gli iPSC umani e i fibroblasti di coniglio.
- Alti tassi di sopravvivenza e di efficienza nel montaggio genico sono essenziali per le applicazioni cliniche.
Obiettivo dello studio
- Dimostrare un nuovo metodo di elettroporazione in tubo per il montaggio genico.
- Ottenere alti tassi di montaggio in cellule di mammiferi.
- Fornire un protocollo privo di interventi virali e farmacologici.
Metodi utilizzati
- Preparazione di colture di iPSC umane e fibroblasti di coniglio.
- Trasfezione utilizzando RNP Cas9 e oligonucleotidi donatori.
- Elettroporazione utilizzando un metodo in tubo specifico.
- Valutazione dell'efficienza del montaggio genico mediante sequenziamento.
Principali risultati
- Consegna di successo dei componenti CRISPR/Cas9 a vari tipi di cellule.
- Alti tassi di montaggio genico preciso nei loci bersaglio.
- Mutazioni dimostrate nei geni IL2RG e SPR nei fibroblasti di coniglio.
- Efficienza di montaggio negli iPSC umani in loci clinicamente rilevanti.
Conclusioni
- L'elettroporazione in tubo è un metodo efficace per il montaggio genico.
- Il metodo permette alte tassi di sopravvivenza cellulare e di montaggio.
- È adatto per applicazioni cliniche grazie alla sua efficienza e sicurezza.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Efficient and safe delivery of CRISPR/Cas9 components is a critical bottleneck in therapeutic gene editing development. Tube electroporation enables high-precision editing in clinically relevant human iPSCs and primary cells without viral vectors or drug-based transfection reagents, reducing immunogenicity risks and supporting scalable, GMP-compatible workflows. This approach directly addresses the need for mechanistic de-risking in early-stage genome editing programs by providing quantitative, reproducible editing outcomes across disease-relevant loci.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of disease-associated mutations in IL2RG, SPR, EGFR, Mybpc3, and HBB genes to confirm pathogenic mechanisms.
- Operational Value: Supports rapid generation of isogenic cell lines for target de-risking and pathway interrogation in rabbit fibroblasts and human iPSCs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantifiable precise editing rates (3.57%-37.92%) via bacterial TA cloning and deep sequencing, enabling dose-response and condition comparison.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible editing outcomes across cell types, supporting assay readiness for CRISPR-based screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates clinically relevant disease models (e.g., HBB E6V for sickle cell, EGFR mutations) for preclinical efficacy and safety testing.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation using the same editing method, reducing variability in translational handoff.
Pipeline & Workflow Integration
Tube electroporation fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling precise genome editing for target validation, assay development, and disease model generation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through precise introduction of disease-causing mutations to clarify gene function and pathway involvement.
- Screening: Delivers quantitative editing readouts that allow comparison of gRNA efficacy, donor template design, and electroporation conditions.
- Analytics: Provides measurable outputs (precise mutation rates, indel frequencies) via sequencing to inform go/no-go decisions in target validation.
- Translational Research: Generates isogenic human iPSC models with clinically relevant mutations for preclinical mechanistic and toxicity studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, non-viral editing platform applicable across multiple cell types and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High precision editing reduces mechanistic ambiguity in target validation and phenotypic screening.
- Operational Value: Virus- and drug-free delivery improves scalability, reduces regulatory burden, and supports consistent manufacturing.
- Strategic Value: Enables data-driven target prioritization by linking editing efficiency to phenotypic outcomes.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted advancement of genome editing programs through validated, reproducible disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, iPSC handling, and electroporation optimization.
- Dependent on access to tube electroporation systems and compatible buffers.
- Necessitates standardized gRNA and ssODN design and validation protocols.
- Requires sequencing capacity (clonal or deep sequencing) for editing efficiency assessment.
- Performance may vary across primary cell types, necessitating pilot optimization.
