Name: 亚细胞分辨率的各向同性光片显微镜及细胞自动动力学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 了解利用双视角选择性平面照明显微镜（diSPIM）对活体C. elegans胚胎进行单细胞谱系追踪和神经元形态学分析的计算成像方法。该协议实现了高信噪比、各向同性分辨率的长时程成像，为神经发育研究提供了无显著光毒性的定量分析工具。

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感谢 John Murray 提供整合菌株 ujIs113，用于构建谱系追踪菌株 BV514；感谢 Brandon Harvey（NIBIB）在测试本实验方案过程中提供的帮助；感谢 Jon Daniels 和 Gary Rondeau（Applied Scientific Instrumentation）在 Micro-Manager 软件和 diSPIM 仪器使用方面的协助；感谢 Andrew York 和 Hank Eden 对 diSPIM 系统提出的宝贵意见。我们还感谢少数民族机构研究中心项目以及波多黎各大学 José del Castillo 神经生物学研究所，为会议交流与集思广益提供了平台。本研究的大部分工作是在伍兹霍尔海洋生物实验室通过惠特曼项目完成的。本研究得到了美国国立卫生研究院生物医学成像与生物工程研究所院内研究项目、NIH 资助号 U01-HD075602 和 R24-OD016474 的支持。Mark W. Moyle 获得了 F32-NS098616 资助，Leighton H. Duncan 获得了 R24-OD016474 的多样性补充资助。

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<li>Santella, A., Du, Z., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-local+neighborhood-based+framework+for+probabilistic+cell+lineage+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A semi-local neighborhood-based framework for probabilistic cell lineage tracing.</a> BMC Bioinformatics. 15, 217(2014).</li>
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<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+isotropic+four-dimensional+imaging+with+dual-view+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy.</a> Nature Biotechnology. 31 (11), 1032-1038 (2013).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Stage-+and+Slit-Scanning+to+Improve+Contrast+and+Optical+Sectioning+in+Dual-View+Inverted+Light+Sheet+Microscopy+%28diSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Using Stage- and Slit-Scanning to Improve Contrast and Optical Sectioning in Dual-View Inverted Light Sheet Microscopy (diSPIM).</a> The Biological Bulletin. 231 (1), 26-39 (2016).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-view+plane+illumination+microscopy+for+rapid+and+spatially+isotropic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).</li>
<li>Wu, Y., Christensen, R., Colon-Ramos, D., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+optical+imaging+techniques+for+neurodevelopment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Advanced optical imaging techniques for neurodevelopment.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1090-1097 (2013).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+%28iSPIM%29+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17708-17713 (2011).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
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<li>Dupuy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+first+version+of+the+Caenorhabditis+elegans+Promoterome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A first version of the Caenorhabditis elegans Promoterome.</a> Genome Research. 14 (10B), 2169-2175 (2004).</li>
<li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+transcription+factor+gene+duplication+from+Caenorhabditis+elegans+Promoterome-driven+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Insight into transcription factor gene duplication from Caenorhabditis elegans Promoterome-driven expression patterns.</a> BMC Genomics. 8 (27), (2007).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

C. elegans 是唯一一种已知成体神经元最终位置和连接关系的生物27。然而，形成构成 C. elegans 连接组的功能性神经回路和网络的发育动态过程仍不清楚。随着光学显微镜技术的进步，我们现在能够捕获并分析 C. elegans 胚胎发育过程中细胞的位置、形态发生和神经发生。
我们所描述并在实验室中常规使用的这一方法，可获得标记神经元和细胞核的四维各向同性图像，用于C. elegans胚胎的细胞谱系追踪。更重要的是，我们优化了双平面光片显微镜（diSPIM）的长期成像条件，并将半自动谱系追踪功能与高分辨率图像相结合，从而提高了分析C. elegans胚胎发育过程的速度与精度。该整合型实验方案使研究人员能够可视化并识别细胞，同时定量分析三维特征，例如神经突迁移和轴突束化，直至早期抽动阶段。任何配备ASI公司diSPIM系统的实验平台均可便捷地采用本方案，我们特别推荐将该系统用于本协议。其他商业化的SPIM系统在样品腔结构和光学特性方面可能与ASI系统的配置存在差异。然而，来自其他平台的数据同样可输入我们的数据处理流程。因此，评估这些系统在细胞谱系追踪中的应用价值——这是对图像质量和仪器稳定性的严苛检验——是可行的。尽管我们目前也积极使用diSPIM对其他样本（如果蝇和斑马鱼胚胎）进行常规成像，但本文所述的完整谱系分析目前仍仅限于线虫物种。对于更大或更厚的样本，我们选择使用载物台扫描方式，即让样本通过固定的光片进行扫描。Kumar等人此前已证明，这种改进的diSPIM切片方法无需对diSPIM系统进行额外改装，即可从厚样本中获得高质量图像10。
本方案中的关键步骤包括将C. elegans胚胎固定在聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上、数据采集以及数据处理。对于缺乏经验的操作者而言，从玻璃盖玻片上收获并固定C. elegans胚胎可能具有挑战性，因此本文提供了关键步骤的详细方案以促进学习。若需进行长期成像，我们建议从8–10只年轻成虫中收集四细胞期或更早期的胚胎，可获得最佳效果28。需要注意的是，年老的成虫不适合用于收集早期胚胎，因其子宫内通常含有较晚期的胚胎和未受精的卵。在胚胎固定过程中，可能出现微毛细移液管组装的吸管（口吸移液管）堵塞，或微毛细移液管开口过大等问题，从而影响胚胎的正确固定与取向。为实现最佳成像效果，我们会在前颤动期的早期和晚期胚胎上进行采集前测试，以检查光片、相机、物镜和自动对焦系统的性能。当所有组件均经过测试并在采集前测试中产生高质量图像时，可获得最佳结果。这一点对于生成具有各向同性空间分辨率的图像尤为重要，因为从两个视角（物镜）获取的原始图像都必须具备高质量。采集完成后，对每个视角获取的图像体积进行处理，以生成各向同性的图像。请务必按照本方案所述使用合适的图形处理器（GPU）显卡（见下文）。这将提高各向同性融合图像的处理速度，缩短数据分析所需时间。此外，用户必须运行最新版本的CytoSHOW软件，并使用我们下载包中提供的StarryNite自动谱系追踪参数。如果用户希望将自动谱系追踪应用于其他样本（例如斑马鱼、果蝇等），则需要对StarryNite中使用的参数进行额外优化（参见参考文献3,4）。
尽管我们的整合方案能够提供前抽搐期胚胎的图像和谱系追踪结果，但用户应注意到，目前尚无法对抽搐后胚胎进行自动谱系追踪：在抽搐后胚胎中，细胞核位置的变化以秒为单位发生，速度过快，难以实现谱系追踪。然而，双平面光片显微镜（diSPIM）确实已展现出捕获神经发育事件并追踪部分细胞位置的潜力，适用于胚胎发生抽搐后阶段23,29。如果用户希望研究抽搐后胚胎，diSPIM 能够以足够快的速度获取三维图像快照，并追踪快速运动胚胎中的精细神经发育事件，例如神经突起的生长。
该方案将为 WormGUIDES 图谱的单细胞水平构建奠定基础30，因为它将提供一种集成方法，利用高分辨率各向同性图像进行识别 和 在胚胎发育的前430分钟内捕获标记神经元的三维形态。目前，WormGUIDES图谱原型提供了发育中胚胎细胞的细胞核位置信息，并致力于记录一部分胚胎神经元的发育动态。该方案将为将更多发育中的神经元整合至WormGUIDES图谱中提供关键支持。30.
我们的整合方案还将简化对 C. elegans 胚胎中新基因表达谱的探索。在转基因 C. elegans 中，许多细胞特异性启动子可在空间和时间上调控转基因的表达。尽管大多数基因在成体动物中的表达模式已被广泛表征31,32,33,34，但几乎全部基因在发育中（尤其是晚期）胚胎中的表达模式尚未被表征。C. elegans 启动子组已成为线虫研究领域的重要资源，可用于驱动细胞特异性转基因表达，并确定基因功能是细胞自主性还是非自主性的。通过细胞谱系分析，捕获基因的各向同性、高分辨率且动态的表达模式，并精确定位表达基因的细胞，将对科学界众多研究人员具有重要价值。
胚胎发生包含两个相互关联的主要过程：细胞分化和组织形态发生。关于秀丽隐杆线虫（C. elegans）发育过程中定义不同类型细胞的机制和分子，已有大量研究。然而，对于在C. elegans胚胎中调控细胞迁移、细胞黏附和细胞形态的机制，目前了解仍较少。由于C. elegans具有固定的细胞谱系，本实验方案使我们能够清晰地揭示胚胎在形态发生过程中三维显微解剖结构的系统图谱，达到前所未有的细节水平：例如轴突束化、突触形成以及神经元活动。Ardiel 等人先前已证明双平面光照显微镜（diSPIM）能够捕捉C. elegans胚胎中单个神经元水平的钙瞬变信号23。许多其他发育生理学方面的研究也适合采用这些方法进行深入探索。
最后，该实验方案实现了高度自动化，系统性地缩短了通过 StarryNite 和 Acetree 生成去卷积图像并进行细胞谱系追踪所需的时间。本方案中使用的软件策略可广泛应用于生物学诸多领域的问题研究，远不止于我们在此展示的特定研究领域。
软件兼容性与下载访问的详细信息
有关 Micro-Manager 及其用于 diSPIM 成像的插件信息，请访问 http://dispim.org/software/micro-manager 和 https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin。
目前数据处理流程需要 Windows 操作系统。我们已将所有必需的数据处理程序和支持文件打包成单个归档文件，以简化安装过程。该文件可从 http://dispimlineage.wormguides.org 下载。
CytoSHOW（http://run.cytoshow.org/）基于广泛使用的开源图像分析平台 ImageJ（v1）。使用 CytoSHOW 需要在计算机上安装并保持最新版本的 Java，CytoSHOW 的更新通过 Java Web Start 自动部署。CytoSHOW 中许多基于 ImageJ 的功能如 https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html 所述并配有图示。CytoSHOW 已经过定制，可显示来自 ASI diSPIM 的多维原始数据，以及其他生成 TIFF 输出的成像软件的数据。原则上，通过对 CytoSHOW 进行少量修改，也可支持其他多视角 SPIM 成像系统，从而使本方案可在不同的显微镜系统上实施。

SpimFusion 使用 Visual Studio 2013 和 CUDA 工具包 v7.5 以 CUDA/C++ 编写。运行 SpimFusion 需要特定的计算机硬件：具备 CUDA 计算能力 1.0 或更高版本的 NVIDIA 图形处理器（GPU）显卡，且显存至少为 2 GB。在本实验方案发表时，SpimFusion 尚未正式发表（Min Guo 和 Hari Shroff），但可从上述提到的软件包归档中获取。

StarryNite 的一个专门构建的命令行驱动版本需要安装免费提供的 MATLAB Compiler Runtime，但不需要商业版 MATLAB 软件的许可证。上述软件包压缩文件中已包含 MATLAB Compiler Runtime。本方案所使用的 StarryNite 代码与之前用于共聚焦图像的版本6基本相同。然而，本文通过 CytoSHOW 中的方法解决了为 StarryNite 处理准备输入图像以及处理 StarryNite 输出结果时涉及的若干操作问题，从而实现了对融合各向同性双平面光片显微镜（diSPIM）数据体的连续化数据处理流程。这些改进由 CytoSHOW 代码自动完成，可执行相应的预处理和后处理步骤。CytoSHOW 还会编辑一个预先优化的、针对 diSPIM 的 StarryNite 参数模板，以自动调整分割算法，使其适应成像数据中细胞核的荧光强度。StarryNite 在每套 diSPIM 数据上所使用的独特参数将与输出图像及谱系数据一同保存于一个文件中。
适用于本实验方案的最佳选择是能够处理16位图像并保持与Java3D渲染兼容性的AceTree定制版本。该版本也包含在上述软件捆绑包压缩文件中。

C. elegans 是唯一一种能够在整个神经发育过程中持续观察胚胎中每个细胞的生物体。由于其完整的细胞谱系已被完全阐明且具有不变性1，加之新型工具的开发使得胚胎中单个细胞的标记和连续成像成为可能，生物学家如今能够从多个角度全面研究线虫 nervous system 发育的各个阶段——包括细胞的产生、迁移与分化、神经突的形成、定向生长及束化、突触的形成，以及功能神经回路的精细调节。通过结合稳定表达的报告基因与荧光显微镜技术，对 C. elegans 胚胎中神经元轴突发育动态进行活体成像，对科学界具有重要价值。
发育研究 秀丽隐杆线虫 常利用该物种恒定的细胞谱系和细胞命运图谱，以增强对完整生物体中单细胞水平的背景理解1自动谱系分析——使用 StarryNite2,3,4 和 AceTree5,6,7,8 软件——得益于荧光标记细胞核的高对比度、高分辨率图像。为了实现最佳性能，StarryNite/AceTree 还依赖于在发育过程中成像胚胎具有可预测且受限制的空间取向。共聚焦显微镜在 C. elegans 将胚胎压缩在两张盖玻片之间，十多年来一直是标准的自动谱系追踪显微技术，因其既能提供高对比度和高分辨率，又能使胚胎保持可预测的受限方向7,8我们先前描述了一种基于光片的双视角倒置选择性平面照明显微镜（diSPIM）的构建与使用，用于活体样本成像，例如 秀丽隐杆线虫 胚胎发生9,10,11,12,13光片显微镜通常可对活体三维样本实现低光毒性、高速度和长期成像14,15双视点平面光显微成像（diSPIM）技术能够生成具有近似各向同性空间分辨率（约330 nm）的四维（4D）图像9.
与共聚焦显微镜相比，diSPIM 具有更高的信噪比和成像速度、更接近各向同性的空间分辨率，并且更适合长期观察 体内 成像16因此，我们尝试将diSPIM数据进行适配，以输入至StarryNite/AceTree中，并探究该方法是否能够提升谱系分析的效果。一个主要难点在于，diSPIM样本无法通过卵壳压缩的方式轻易固定，从而难以获得StarryNite/AceTree所期望的标准方向。分析体积中细胞位置的随机取向会降低自动谱系追踪分析的准确性。
因此，我们采用了 CytoSHOW，这是一种由用户引导的界面，允许用户在对双平面光片显微镜（diSPIM）图像进行预处理时，选择胚胎精确的三维方向，从而生成既经过质量优化又具有上下文感知能力的图像数据，供 StarryNite/AceTree 使用。在用户选定成像胚胎后，CytoSHOW 将协调启动一个自动化的数据处理流程。经过裁剪和背景扣除的胚胎图像将按每个位置、时间点和视角分别保存为 TIFF 堆栈文件。随后，CytoSHOW 迭代调用 SpimFusion 程序，利用 Richardson-Lucy17,18 算法对两个预处理后的视角图像进行共配准和联合去卷积，生成各向同性的高分辨率体数据图像。我们已针对 diSPIM 数据优化了一组 StarryNite 参数，以控制其在各向同性融合图像上的图像分割和细胞核追踪行为。融合后的图像和谱系追踪结果随后可在 AceTree 中进行编辑，用户可识别并修正 StarryNite 自动生成谱系轨迹中的任何错误。AceTree 还可展示追踪到的胚胎内细胞核的谱系树以及三维建模渲染图。我们发现，与任一 SPIM 相机获取的原始图像相比，使用各向同性融合图像可显著提高自动谱系追踪的速度和准确性。本方案虽针对文中所述的 C. elegans 应用进行了优化，但也可广泛适用于其他物种或样本的 diSPIM 数据自动谱系分析。若计划将本方案用于此类用途，请注意可能需要根据新样本进一步调整 StarryNite 的参数，具体方法见文献3,4。
成功实施本方案可获得具有四维各向同性分辨率的图像，使生物学家能够在追踪细胞谱系的同时，识别并分析发育中秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎中的神经元。此外，通过整合多种后期处理算法——其中硬件加速是耗时最长的步骤——我们现在能够几乎实时地分析活体胚胎中的精细亚细胞结构以及细胞谱系和细胞命运。这一新方案使得在体内对分化和形态发生过程进行探究性研究时，能够精确且有针对性地操控和观察细胞行为。在本文中，我们详细阐述了为改进发育中秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎的谱系追踪与细胞跟踪所开发的优化方案，以促进胚胎发育、基因表达或神经发育相关研究的深入进行。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;步骤 1-4&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>凹面载玻片</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1519006</td><td>5-18 毫米直径，0.6-0.8 毫米深度，1.2-1.5 毫米</td></tr><tr><td>体视显微镜，配备10倍物镜&amp;times;&amp;ndash;50&amp;times; 变焦范围</td><td>Motic</td><td>SMZ-171</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌（OP50）</td><td>秀丽隐杆线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片，1.5号，24 &amp;times; 50 mm</td><td>VWR International</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>M9 缓冲液</td><td></td><td></td><td>Stiernagle, T. C. elegans 的培养与维持 &lt;em&gt;WormBook&lt;/em&gt; 1-11，doi:10.1895/wormbook.1.101.1，（2006）。</td></tr><tr><td>甲基纤维素 &amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7509-25G</td><td></td></tr><tr><td>微毛细移液管吸管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>微毛细移液管，内径 0.4 毫米</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-800</td><td></td></tr><tr><td>针头，18G × 1 &amp;frac12; （1.2 mm × 40 mm）</td><td>BD Precision Glide</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>NGM 平板</td><td></td><td></td><td>按照 Brenner (1974) 描述的方法制备</td></tr><tr><td>成像室用O形环</td><td>O型密封圈 West</td><td>M1.5X40</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>康宁/西格玛奥德里奇</td><td>CLS7095D5X</td><td></td></tr><tr><td>铂金丝，直径0.5 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>267201</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢矩形培养室（76.0 mm × 50.5 mm）</td><td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td><td>I2450</td><td></td></tr><tr><td>线虫睫毛挑针</td><td></td><td></td><td>Hart, A. C. 行为学 &lt;em&gt;WormBook&lt;/em&gt;&amp;nbsp; (2006).</td></tr><tr><td>线虫挑取</td><td></td><td></td><td>Stiernagle, T. C. elegans 的培养与维持 &lt;em&gt;WormBook&lt;/em&gt; 1-11，doi:10.1895/wormbook.1.101.1，（2006）。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;步骤5-6&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm 长通滤光片</td><td>Semrock</td><td>LP02-488 RU-2</td><td></td></tr><tr><td>561 nm陷波滤光片</td><td>Semrock</td><td>NF03-561E-25</td><td></td></tr><tr><td>BLP02-561R-25，数量 2</td><td>Semrock</td><td></td><td>561 nm EdgeBasic 高性价比长波通边缘滤光片</td></tr><tr><td>底部相机控制软件</td><td>Jenoptik</td><td></td><td>ProgRes CapturePro</td></tr><tr><td>diSPIM组装视频</td><td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td><td></td><td>https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ；http://www.asiimaging.com</td></tr><tr><td>diSPIM 对准视频</td><td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td><td></td><td>https://youtu.be/qnOrg30NNuE</td></tr><tr><td>diSPIM成像PC</td><td>英特尔</td><td></td><td>Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz，共12核&amp;nbsp;64&amp;nbsp;GB 内存，Windows 7</td></tr><tr><td>FF01-525/45-25，数量 2</td><td>Semrock</td><td></td><td>525/45 nm BrightLine 单通带滤光片</td></tr><tr><td>FF555-DI03-25X36，数量 2</td><td>Semrock</td><td></td><td>555 nm 边缘 BrightLine 单边二向色分光镜</td></tr><tr><td>成像 PC 显卡</td><td>NVIDIDA</td><td></td><td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti 显卡</td></tr><tr><td>Kumar&lt;em&gt; 等人&lt;/em&gt; diSPIM 设置</td><td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td><td></td><td>本方案的仪器设置与Kumar相同 &lt;em&gt;等 &lt;/em&gt;10&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;11 &amp;nbsp;diSPIM，使用40倍0.8数值孔径的水浸物镜进行成像。（见步骤5.1及注释）</td></tr><tr><td>Micro Manager</td><td>Micro-Manager</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;u&gt;对Kumar等人diSPIM装置的改进（见下文）&lt;/u&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备隔振器的光学平台，4 英尺 &amp;times; 6英尺 &amp;times; 12英寸</td><td>TMC</td><td>784-651-02DR 和 14-416-34</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;步骤 7-10&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分析计算机</td><td>英特尔</td><td></td><td>Intel Core i7-8700K CPU 3.70 GHz，共 6 个核心，64 GB 内存，Windows 10</td></tr><tr><td>分析计算机显卡</td><td>NVIDIDA</td><td></td><td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti 显卡</td></tr><tr><td>安装说明</td><td>软件包</td><td></td><td>http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm</td></tr><tr><td>软件包</td><td>软件包</td><td></td><td>http://dispimlineage.wormguides.org</td></tr></tbody></table>

亚细胞分辨率下利用各向同性光片显微镜与自动化细胞谱系分析记录秀丽隐杆线虫胚胎发育

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans（C. elegans）是唯一一种能够在体内以单细胞分辨率观察整个神经系统细胞起源的生物。本文介绍了一种用于研究C. elegans&#160;胚胎神经发育的整合性实验方案。该方案结合了活体胚胎发育过程中单个细胞的成像、细胞谱系追踪和神经解剖学标记技术。我们采用双视角倒置选择性平面照明显微镜（diSPIM），实现了对活体C. elegans胚胎的长期四维（4D）成像，并获得了接近各向同性的空间分辨率。通过该方法，对线虫胚胎中的细胞核及神经结构进行成像并各向同性融合，最终获得在三个维度上分辨率均约为330 nm的图像。这些以分钟为时间间隔采集的高分辨率4D数据集可用于在单细胞和亚细胞水平上，将明确的细胞谱系身份与基因表达及形态动态变化相关联。本方案设计为模块化操作，便于分步实施，可有效促进胚胎发生、基因表达或神经发育等相关研究。

我们首先验证了使用本方案参数进行双视点平面光显微镜（diSPIM）成像的胚胎的存活能力（第1-6节）。在20 °C条件下，同时对10个胚胎进行了从2细胞期到2倍体期的连续成像，成像速率为每分钟每个胚胎获取一个三维图像（持续7.5小时，每个胚胎共451个体积数据）。为了在整个胚胎发育过程中监测细胞分裂，我们使用了BV514品系，该品系通过整合的转基因阵列ujIs11324普遍表达mCherry::Histone报告基因。图6展示了其中一个被成像胚胎在胚胎发育前半段的时间进程。每幅图像均为该胚胎单视角的最大强度投影图像（由第7-8步生成）。我们发现，经优化的实验方案未引起可检测的光毒性，这一结论基于细胞分裂时序（未展示）、孵化时间以及与发育里程碑相关的时间节点（图6及参考文献1,25,26）的评估结果。
随后，我们应用该方案分析发育中胚胎内单个神经元的轴突生长动态。我们对 DCR7692 进行了成像（olaex4655)，一种在神经肽启动下表达GFP的转基因线虫品系 flp-19 在部分未鉴定细胞中启动子（DACR2819， Pflp-19 (3.6 kb)::Syn21::GFP::CAAX::p10 3’UTR)根据本方案所述步骤，我们确定这些未识别的细胞对应于运动神经元 RMDDL 和 RMDDR、排泄管细胞以及两个肌细胞。图7）。随后，我们观察并量化了RMDDL和RMDDR神经元的突起生长动态。我们发现，RMDDL和RMDDR神经元在受精后360分钟时已呈现斜向形态，其较长的细胞轴代表了后续 neurite 生长的方向。图7 和 视频 S1）。随后，我们使用 FIJI 中的“simple neurite tracing”插件，将其应用于各向同性融合体积的三维重建图像，对六个胚胎中 RMDDL 和 RMDDR 神经突的典型生长情况进行定量分析。结果表明，RMDDL 和 RMDDR 在不同胚胎间的神经突生长动态具有一致性（下文统称为 RMDDs）。在受精后 385–410 分钟期间，RMDDs 的神经突延伸了 6.0±0.5µm （均值 ± 标准误； n = 12 条神经突）位于胞体前方（图7B，C，I）。受精后415至445分钟，两条神经突均向背侧延伸，进入并环绕预定的神经环区域（图中星号标记处 图7D）。平均而言，每条RMDD神经突延伸长度为11.0 ± 0.6 µm （均值 ± 标准误； n = 12 条神经突）从胞体发出，随后在环状结构的顶端同步地与其对侧对应部分相遇图7I）。重要的是，我们的代表性结果表明，通过使用整合的实验方案，我们能够对单个可识别神经元的发育特征进行观察、比较和定量分析（图7 和 图8).
<img alt="Poly-L-lysine 显微镜装置示意图、包被盖玻片、成像组件、腔室、吹嘴。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图1：双平面光片显微镜（diSPIM）样品安装装置。（A）使用Poly-L-lysine处理盖玻片的准备过程。插图中显示，用10 µL Poly-L-lysine对盖玻片进行包被，作用5分钟。Poly-L-lysine可使胚胎卵壳牢固地粘附在盖玻片的矩形区域内。（B）钢制成像腔室及其组装后的示意图。插图中显示，代表性胚胎以前后轴垂直于盖玻片长轴的方向排列。（C）组装好的带有微毛细移液管的抽吸管。（D）安装在样品 holder 中的钢制成像腔室，置于diSPIM 40x物镜下方。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜采集软件设置，配置488 nm和561 nm激光强度及数据设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：Micro-Manager中的长时程双平面照明显微镜（diSPIM）成像设置。（A）推荐的diSPIM激光功率参数（红色矩形），已优化以实现长时间成像并降低光毒性（通过秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎更高的孵化率评估）。将561 nm激光设为79 µW（0.25），488 nm激光设为179 µW（0.5）。需注意，不同diSPIM系统中软件设置与激光功率之间的精确校准可能存在差异。建议用户测量并校准激光功率，以达到561 nm激光79 µW和488 nm激光179 µW的输出水平。（B）diSPIM的数据保存参数（绿色矩形）、体积设置（蓝色方框）和切片设置（橙色方框）。（C）用于长时程成像秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎发育的diSPIM自动聚焦参数（参见步骤6.1–6.6）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="去卷积过程在双平面光照显微镜（diSPIM）中的应用；显示前后视图；显微成像；数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：使用CytoSHOW进行图像可视化与数据处理设置。（A）由CytoSHOW打开的原始diSPIM图像。CytoSHOW能够打开两个相机通路（SPIM A和B）采集的图像。这些原始图像在称为diSPIM监视器的多维窗口中打开。在diSPIM监视器中，生成“领结图案”以选择胚胎的前、后、背和腹边缘（见步骤9.1）。领结选择用于指示去卷积及StarryNite辅助谱系追踪时的胚胎方向。（B）用于生成各向同性图像的优化参数。在采集时同步去卷积窗口中，设置步骤9.5.1–9.5.8中指定的参数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="双相机 SPIM 显微镜装置。示意图：样品旋转、荧光检测、去卷积。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：双视点 SPIM 相机配置。（A）双视点 SPIM 相机位置与取向的照片。（B）将 SPIM A 图像旋转 +90 度以匹配 SPIM B 所采集图像的示意图。（C）基于本双视点 SPIM 系统的相机配置（见步骤 9.5.2），相对于取向索引 +1 的输入体积。我们在进行图像配准前，需将 SPIM A 图像绕 Y 轴旋转 +90 度。比例尺 = 10 µm。图像为代表性的单视角最大强度投影图及去卷积图像，来自标记了细胞核（561 nm，红色）和神经元（488 nm，绿色）的 1.5 倍体胚胎。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="图解中显示 ABa、ABp、EMS、P2 的细胞谱系追踪；胚胎发育可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：在 AceTree 中对 C. elegans 胚胎细胞谱系进行校正与编辑。 （A）我们使用 AceTree 编辑 StarryNite 的谱系追踪结果（参见参考文献5,6,8；相关论文也包含在我们的下载包中）。完成步骤 10.1–10.2 后，AceTree 将显示每个细胞核的 C. elegans 系统命名（绿色矩形）。该窗口（A）提供谱系追踪中每个细胞（以蓝色高亮的 ABa 为例）的相关信息（黑色矩形），以帮助用户在追踪和编辑谱系时进行判断。建议用户将谱系追踪所得的细胞及其位置与 Sulston 等人先前报道的 C. elegans 胚胎细胞谱系进行核对和比对1。此外，若用户希望在去卷积数据序列中定位特定细胞（见下文，B），可在搜索栏中（橙色矩形）输入 C. elegans 系统名称进行查找。（B）完成步骤 10.1–10.2 后，用户的去卷积数据序列也将自动打开。图中显示的是一个四细胞期胚胎的各向同性融合图像，细胞核以红色标记。在追踪细胞核时，用户应调节图像的亮度（红色方框），并使用键盘上的方向键在时间（左/右）和 z 轴（上/下）方向上进行浏览。（C）对应于（B）中时间点的 3D 示意图，包含某些功能（紫色矩形），可实现可旋转的 3D 可视化。有关 AceTree 及其 3D 功能的概述，请参见参考文献5,6,8。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="秀丽隐杆线虫胚胎发育时间线，从受精到二倍体阶段的显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：在双平面光照显微镜（diSPIM）上观察到的 C. elegans 胚胎定时发育动态。 上图面板显示了其中一个被成像胚胎（品系 BV514 ujIs11324）胚胎发育前半段的 diSPIM 图像。胚胎在 20 °C 条件下连续成像，每分钟采集一次，持续 7.5 小时。上图前两幅图像分别代表含有细胞核（红色）和极体位置（致密红色球体，以蓝色星号标记）的 4-细胞期和 8-细胞期胚胎。每幅图像均为被成像胚胎的单视图最大强度投影。比例尺 = 10 µm。时间线（水平条）表示 C. elegans 胚胎自受精后（m.p.f.）的分钟数。我们验证了本方案中 diSPIM 采集参数未对成像胚胎产生可检测的光毒性，评估指标包括胚胎存活率、细胞分裂时间、孵化时间以及发育关键节点的时间进程（参见参考文献1,25,26）。我们注意到，在本实验成像参数下，不同胚胎间发育关键节点的时间具有可重复性（在持续 6.4 小时的成像过程中，标准误 SEM ± 8.174 分钟；n = 10）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胚胎中的神经突生长；荧光显微镜，延时图像，生长图分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig7_v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7. 发育中 C. elegans 胚胎神经突生长动态的细胞鉴定与单细胞表征。 通过杂交BV514 ujIs11324（用于细胞谱系追踪）和DCR7692（olaex4655）品系获得的双色成像结果，后者为一种转基因线虫品系，可在部分未鉴定细胞中通过神经肽 flp-19 启动子驱动GFP表达。(A-H) 根据本方案所述步骤，我们确定这些未鉴定细胞分别为运动神经元RMDDL和RMDDR（黄色箭头）、排泄管细胞（蓝色箭头）以及两个肌细胞（白色箭头）。(I) 利用FIJI插件“simple neurite tracing”对各向同性融合体积的三维重建图像进行分析，量化RMDDL和RMDDR神经元的神经突生长动态。可见RMDDL和RMDDR均表现出典型的生长模式，同步延伸，总长度达11.0±0.6 µm（均值 ± 标准误；n = 12个神经突），并在神经环背侧顶端相遇（另见视频S1）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于空间分析的细胞结构荧光显微镜示意图，包含90度旋转。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig8.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图8"> 
图8：对秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎中神经元形态的各向同性双平面光片显微成像（diSPIM）观察。 AVHL 和 AVHR 神经元的各向同性可视化图像（黄色箭头所示）。利用双平面光片显微镜（diSPIM），可获取具有约330 nm各向同性空间分辨率的四维（4D）图像，以呈现神经元形态。diSPIM 使用户能够以在所有方向上均相同的分辨率对图像体积进行虚拟旋转。图 A–D 为同一经各向同性融合的 diSPIM 图像体积，围绕胚胎长轴进行不同角度旋转后所得的最大强度投影图像。比例尺 = 5 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
补充视频 S1：C. elegans 胚胎从受精后 280 分钟至 434 分钟的发育过程。 菌株 DCR7692 (olaex4655) 的各向同性视频，该菌株普遍表达 ujIs113，同时 DACR2819 稀疏标记 RMDD 神经纤维（图 7A-D，黄色箭头）。在胚胎发育过程中，DACR2819 还标记了两个肌细胞（图 7A-D，白色箭头）和排泄管细胞（图 7A-D，蓝色箭头）（图 7A-D）。比例尺 = 10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/Movie_S1.mov">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种组合方法，结合高分辨率显微镜、计算工具以及活体秀丽线虫（C. elegans）胚胎中的单细胞标记，用于研究神经发育过程中单个细胞的动态行为。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）是唯一一种能够深入解析完整神经系统细胞起源的生物……

本方案可实现对活体胚胎中细胞谱系和细胞身份的高效示踪，同时分析发育中的秀丽隐杆线虫（C.elegans）神经元的轴突和树突等精细细胞形态。与共聚焦显微镜相比，双视角倒置选择性平面照明显微镜（diSPIM）具有更高的信噪比、更均一的空间分辨率，更适合长期的活体成像。首先，将500 µL的1%甲基纤维素溶液加入凹面载玻片的凹槽中。使用铂金丝挑取线虫生长培养基平板上的成虫，转移至M9甲基纤维素溶液中。用磨尖的18号皮下注射针头在虫体中部进行横向切割，直至获得一个到四个细胞的胚胎。将微量移液毛细管预先吸入10至15微升M9缓冲液，用吸管嘴轻轻含在牙齿之间，从载玻片上轻柔吸取数个胚胎进入毛细管中。将胚胎分配到装有新鲜M9缓冲液的钢制成像室盖玻片的中央矩形区域中。轻轻调整胚胎方向，使其长轴垂直于盖玻片的长轴。然后将钢制成像室放入双平面照明显微镜（diSPIM）载物台上的样品 holder 中。为准备胚胎成像，打开 Micro-Manager 软件，将激光强度设置为 488 纳米波长下 179 微瓦（相当于 0.5%），561 纳米波长下 79 微瓦（相当于 0.25%）。必须提前完成软件调节与实际激光输出之间的校准，以便将显微镜设定至特定的微瓦数值。在插件菜单中，选择“设备控制”下的 Applied Scientific Imaging diSPIM，打开 Applied Scientific Imaging 双视角倒置选择性平面照明显微镜窗口。在采集选项卡下，确认参数已按指示设置。在自动对焦选项卡下，将参数设置为如指示所示。注意，自动对焦通道应指定为计划进行谱系追踪实验的核荧光通道。检查路径 A 或 B 的光束和片层盒子，然后点击“live”以开始图像采集。此时将打开一个实时视图窗口。随后在目标胚胎周围绘制一个方框，以选定胚胎的自动对焦分析区域，然后点击“start acquisition”以启动长期多维图像采集。进行图像查看、处理和细胞谱系分析时，在下载并解压软件包后，双击 CytoSHOW_app.jnlp 文件以启动 CytoSHOW。在文件菜单下，选择“新建”和“diSPIM Monitor Micro Manager”，定位到原始 Micro Manager 图像所保存的根数据集文件夹。选择任意时间点文件夹并点击打开。SPIM A 和 SPIM B 的多维导航窗口将自动打开。使用多边形选择工具，在目标胚胎的腹侧、背侧、前端和后端边缘外侧依次点击，从而在 SPIM A 和 SPIM B 的视图中均生成一个领结形状的选区，然后点击 diSPIM。对每个 SPIM 通道的绿色和红色通道进行对齐，然后再次点击 diSPIM。所有其他位置窗口中的图像将被触发进行位移。接下来，点击 diSPIM 和融合（fuse）按钮，打开去卷积融合 diSPIM 原始数据体积的对话框，并按指示设置参数。当所有参数设置完成后，点击“是”，然后指定用于保存处理后文件的输出目录，再点击“确定”。在预览窗口中，将时间轴滚动条（t-scroll bar）移至该时间窗口的第二个时间点，并移动 z 轴滑块（z-slider），直到显示沿胚胎长轴方向的视图为止。将预览窗口中的 t-滚动条移回时间点一，使用线条选择工具从腹侧最圆的细胞核穿过 AB 细胞中期板平面画一条线。点击 diSPIM 预览按钮，以保存对预览图像体积方向的精细调整。将 diSPIM 监视窗口的 t-滚动条设置为待处理图像全时程的起始和结束时间点。然后单击“确定”。为了实现高效且准确的细胞谱系分析，在进行 Starry Night 处理之前，必须将数据体精确地对齐至 ADL 方向。要在 AceTree 中打开 Starry Night 谱系追踪序列，请打开提供的自定义 AceTree 文件，并选择“打开配置文件”以定位到先前指定的输出目录。打开目标胚胎的 fuse 子文件夹，然后选择已编辑的文件。然后点击打开，按照之前所述进行谱系可视化和编辑。经优化的实验方案不会对胚胎产生可检测到的光毒性，这一点通过孵化时间及与发育里程碑相关的时间节点评估得到证实。按照本方案进行实验，确定了该表达绿色荧光蛋白的转基因线虫品系中原本未明确的细胞为运动神经元、排泄管细胞以及两个肌肉细胞。早在受精后360分钟，已鉴定的神经元即呈现斜向形状，其较长的细胞轴代表了后续 neurite（神经突）生长的方向。在受精后385至410分钟期间，RMDD神经元的神经突向前延伸约六微米，超出细胞体。在受精后415至445分钟期间，两条神经突均向背侧延伸，进入并环绕假定的神经环区域。平均而言，每个RMDD神经突从细胞体延伸约11微米后，会与对侧相应的神经突在环的顶端同步相遇。综上所述，这些数据表明，利用该整合方案可以对单个可识别细胞的神经发育特征进行观察、比较和定量分析。需要注意的是，应将胚胎垂直定向，使每个胚胎的长轴与盖玻片的长轴相互垂直。通过该方案，我们已开始从各个角度探索早期胚胎神经系统，例如细胞生成、迁移与分化，以及神经突的形成、延伸和束化过程。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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