Un metodo di estrazione multi-omics per l'analisi approfondita delle culture sincronizzate dell'Alga verde Chlamydomonas reinhardtii

Gli studi a livello di sistema sono cruciali per una comprensione approfondita delle funzioni biologiche. Tuttavia, sono necessari più campioni indipendenti per diverse piattaforme omiche, introducendo un'elevata variabilità dei dati. Questo metodo offre una strategia robusta e ad alta produttività per l'estrazione simultanea di clorofilla, lipidi, metaboliti, proteine e amido da un singolo campione del modello di alga verde, Chlamydomonas reinhardtii.

Per l'estrazione di clorofilla, lipidi e metaboliti, disporre i tubi dei pellet cellulari chlamydomonas raccolti in azoto liquido. Resuspend il pellet in ogni tubo con un millilitro di 20 gradi tampone di estrazione uno. Per evitare l'evaporazione del tampone di estrazione a bassa viscosità, vortice rapidamente i tubi fino a quando le celle sono ben omogeneizzate all'interno della miscela di estrazione e aliquota la soluzione in due tubi microcentrifugo millilitro.

Sonicare le colture in un bagno di sonicazione in acqua ghiacciata per 10 minuti prima dell'incubazione su uno shaker orbitale a 1.000 rotazioni al minuto per 60 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aggiungere 650 microlitri del tampone di estrazione due e vortice brevemente i campioni prima della centrifugazione. Per aliquotare le frazioni, trasferire 500 microlitri della fase lipidica MTBE superiore in un tubo etichettato da 1,5 millilitri.

Utilizzare una pipetta da 200 microlitri per rimuovere la fase lipidica e trasferire 650 microlitri della fase di metabolita polare e semipolare inferiore in nuovi tubi etichettati. Aspirare il volume in eccesso per rimuovere la fase inferiore rimanente e congelare i pellet solidi in azoto liquido per lo stoccaggio di 80 gradi. Per la determinazione del metabolita polare, rimescolare il pellet essiccato della fase polare nella soluzione di cloridrato di piridina metossiammina per la metossimizzazione dei gruppi carbonilici e riscaldare i campioni a 30 gradi Celsius per 90 minuti.

Al termine dell'incubazione, degustare i campioni con n-metil-n-trifluoracetamide per 30 minuti a 37 gradi Celsius secondo i protocolli standard. Utilizzare la gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa a tempo di volo per analizzare i metaboliti primari. Per la determinazione del metabolita non polare, resuspendare il pellet essiccato della fase non polare in una miscela da sette a tre volumi di acetonitrile in isopropanolo e sedimentare i pellet mediante centrifugazione.

Quindi separare i campioni su una colonna C8 inversa su un sistema di cromatografia liquida ad ultraperformance. Per la determinazione del contenuto di clorofilla, mescolare 100 microlitri della fase MTBE con 900 microlitri del 90% di metanolo per il metodo vuoto e i campioni sperimentali. Quindi misurare l'assorbanza su uno spettrofotometro a lunghezze d'onda di 655 e 652 nanometri per distinguere tra clorofilla a e clorofilla b e calcolare il contenuto di clorofilla a e b e il contenuto totale di clorofilla.

Per l'estrazione di proteine, sciogliere il pellet di fase inferiore in 200 microlitri di tampone proteico e incubare il campione a temperatura ambiente per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, centrifugare il campione e trasferire il supernatante contenente proteine in un nuovo tubo. Misurare la concentrazione proteica usando il saggio di Bradford.

Per digerire la proteina, ridurre 15 microgrammi del campione in cinque ditiotriolo millimolare per 30 minuti, seguito da alchilazione con iodoacetamide da 10 millimolare per 30 minuti a temperatura ambiente, protetto dalla luce. Alla fine dell'alchilazione, mescolare la soluzione di Tripina/Lis-C a un rapporto proteina-proteasi da 25 a uno e incubare il campione per tre ore a 37 gradi Celsius. Diluire il campione di sei volte in tris Hcl da 50 millimolare per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius.

La mattina successiva, terminare la digestione con acido trifluoroacetico ad una concentrazione finale dello 0,5-1%Dopo la digestione, concentrare i campioni in prossimità della secchezza, lasciando da due a cinque microlitri di soluzione in un concentratore sottovuoto senza riscaldamento. Resuspend l'esempio nel buffer di caricamento. Analizzare le miscele peptidiche mediante spettrometria di massa tandem cromatografica liquida utilizzando uno spettrometro di massa ad alta risoluzione collegato a un sistema di cromatografia liquida a nano ultra pressione.

Per separare i peptidi, caricare quattro microlitri di campione su una colonna ibrida di superficie caricata in fase inversa di 20 centimetri con un diametro interno di 75 micrometri e una dimensione delle particelle di 1,7 micrometri. Utilizzare le impostazioni offline a ciclo parziale con una sfumatura isocratica impostata al 3% del buffer B, vengono tenute per 14 minuti prima che il ciclo venga spostato nella posizione online con la colonna, dopo di che la sfumatura verrà aumentata linearmente per 50 minuti fino al raggiungere il 20%buffer B. Uno spostamento del volume cellulare può essere osservato man mano che le cellule crescono di dimensioni durante la fase di luce, seguito dal rilascio di cellule figlie a partire dalla fine della fase di luce da 10 ore.

Una volta rilasciate tutte le cellule figlie, è possibile osservare uno spostamento del volume cellulare, poiché le cellule figlie appena rilasciate vengono disposte per iniziare il ciclo successivo. Sulla base dell'analisi della spettrometria di massa della gascromatografia della frazione polare, in questo esperimento rappresentativo sono stati annotati 65 metaboliti. L'analisi della spettrometria di massa della cromatografia liquida della fase neutra contenente lipidi ha portato all'identificazione di 204 specie lipidiche distinte che coprono varie classi lipidiche.

L'analisi dei componenti principali può essere utilizzata per visualizzare i cambiamenti globali nei metaboliti e nei lipidi attraverso il ciclo cellulare con una separazione delle fasi luminose e scure, nonché le fasi semicicliche osservate sia per la metabolomica che per i dati lipidomici. Qui viene mostrata una panoramica dell'arricchimento funzionale di 2.463 proteine arricchite identificate. Il pellet rimanente dopo l'estrazione proteica può essere utilizzato per la quantificazione riproducibile dell'amido, come indicato dalla bassa deviazione standard tra varie repliche.

È importante evitare l'essiccazione della fase organica superiore della clorofilla, in quanto ciò può influenzare i livelli di clorofilla nel solvente, influenzando il fattore di normalizzazione per i campioni. Varie procedure analitiche possono essere implementate per la caratterizzazione biochimica delle specie molecolari estratte.