Name: Estrazione di metaboliti acquosi da cellule aderenti coltivate per lanalisi metabolomica mediante elettroforesi capillare-spettrometria di massa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-09T23:59:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Scopri un protocollo affidabile per l'estrazione di metaboliti acquosi da cellule aderenti, ottimizzato per l'analisi metabolomica mediante elettroforesi capillare-spettrometria di massa. Questo metodo semplice supporta la ricerca sul cancro.

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Ringraziamo tutti i membri del centro di promozione dell'industria regionale Shonai per il loro aiuto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dai fondi di ricerca della Prefettura di Yamagata e di Tsuruoka City, dal fondo nazionale per la ricerca e lo sviluppo del Cancer Center [numero di sovvenzione 28-A-9], e dalla società giapponese per la promozione della scienza (JSPS) KAKENHI [numero di sovvenzione 17K07189] a HM.

1. coltura cellulare al giorno 1
Nota: ogni campione per l'estrazione del metabolita deve essere preparato da un singolo piatto di coltura tissutale di 100 mm che è moderatamente ma non completamente confluente (contenente circa 2 – 5 milioni di cellule). Calcola il numero di piatti necessari per il saggio e preparali di conseguenza.
<ol><li>Culture HCC827 e PC-9 cellule in 5% CO2 a 37 ° c in RPMI-1640 media integrata con siero bovino fetale al 10% (FBS).</li>
	<li>Aspirate i mezzi di coltura cellulare dai piatti della cultura 100 mm.</li>
	<li>Lavare le cellule su ogni piatto utilizzando 2 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza calcio e magnesio. Delicatamente roccia ogni piatto in modo che la soluzione PBS copre completamente la superficie del piatto.</li>
	<li>Aspirate il tampone di lavaggio dai piatti della cultura.</li>
	<li>0,25 caldo% tripsina-EDTA soluzione a 37 ° c e aggiungere 2 mL di soluzione di tripsin-EDTA con una pipetta sierologica da 5 mL. Delicatamente roccia ogni piatto in modo che la tripsina copre completamente la superficie del piatto.</li>
	<li>Incubare i piatti della cultura a 37 ° c per circa 5 min.</li>
	<li>Aggiungere 4 mL di mezzo di crescita completo pre-riscaldato per piatto. Risospendere le cellule in mezzo pipettando delicatamente più volte.</li>
	<li>Trasferire ogni sospensione di cella a un tubo conico separato da 15 mL e centrifugare a 800 × g per 5 min.</li>
	<li>Risospendere ogni pellet di cellule in 2 mL di mezzo di crescita completo pre-riscaldato.</li>
	<li>Determinare il numero totale e la redditività percentuale delle cellule utilizzando il contatore cellulare automatizzato e 0,4% trypan soluzione blu.<ol>
<li>Miscelare 10 μL di sospensione cellulare e 10 μL di soluzione 0,4% trypan blue.</li>
		<li>Caricare 10 μL di campione nello scivolo della camera di conteggio cellulare attraverso l'azione capillare.</li>
		<li>Inserire lo scivolo della camera nel contatore automatico delle celle. La luce trasmessa si illumina automaticamente e lo strumento auto si concentra sulla cella.</li>
		<li>Premere il pulsante Acquisisci per catturare l'immagine e visualizzare i risultati.</li>
		<li>Se necessario, aggiungere ulteriore mezzo di crescita per ottenere la concentrazione di cellule desiderata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Semina circa 1 – 2,5 milioni di cellule per piatto di coltura cellulare 100 mm. Nota: le concentrazioni dei metaboliti determinate dall'analisi CE-MS saranno normalizzate in base al numero di cellule vitali. Ai fini del conteggio delle cellule, è necessario preparare almeno un piatto di coltura extra seminata per ogni gruppo.</li>
	<li>Incubare i piatti della cultura in 5% CO2 a 37 ° c per 18 h.</li>
</ol>2. preparazione dei reagenti
<ol><li>Diluire una soluzione standard interna commerciale tra cui L-metionina sulfone e acido d-canfora-10-sulfonico 1000 volte in acqua ultrapura. Nota: per meno di 80 campioni, è sufficiente miscelare 50 μL della soluzione standard interna 1 e 45 mL di acqua ultrapura in un matraccio volumetrico da 50 mL, quindi portare la soluzione fino a 50 mL con acqua ultrapura.</li>
	<li>Preparare una soluzione di mannitolo di 0,05 g/mL in acqua ultrapura come tampone di lavaggio. Nota: per meno di 30 campioni, semplicemente sciogliere 25 g di mannitolo in 500 mL di acqua ultrapura. È necessario circa 15 mL di tampone di lavaggio per piatto di coltura da 100 mm, quindi preparare un volume sufficiente di tampone di lavaggio in base al numero di campioni.</li>
</ol>3. unità filtranti centrifughe pre-lavaggio
<ol><li>Pipettare 250 μL di acqua ultrapura nella Coppa del filtro di ciascuna unità filtrante centrifuga (vedere la tabella dei materiali). Nota: sono necessarie due unità filtranti per campione.</li>
	<li>Tappare saldamente le unità filtranti e centrifugare a 9.100 × g a 4 ° c per 5 min.</li>
	<li>Controllare il volume di ogni filtrato — se il filtrato significativo si è accumulato durante il primo giro breve, l'unità filtrante potrebbe essere difettosa. In questo caso, scartare l'unità filtrante e utilizzare invece una nuova unità di filtraggio.</li>
	<li>Chiudere saldamente i coperchi delle unità filtranti e centrifugare nuovamente a 9.100 × g a 4 ° c per 30 min.</li>
	<li>Assicurarsi che non rimanga acqua ultrapura in nessuna delle tazze filtranti; rimuovere l'acqua ultrapura filtrata in ogni tubo di raccolta con una pipetta e scartare. Nota: non tentare di rimuovere l'acqua residua in una tazza filtrante con una pipetta in quanto potrebbe danneggiare il filtro.</li>
	<li>Sostituire le tazze filtranti nei loro tubi di raccolta. Nota: utilizzare le unità filtranti centrifughe entro un'ora dal momento che i filtri potrebbero danneggiarsi dopo l'essiccazione.</li>
</ol>4. coltura cellulare il giorno 2
<ol><li>
Estrarre i piatti di coltura 100 mm dall'incubatore. Nota: la durata della coltura cellulare consigliata è 18 h.</li>
	<li>Aspirare il terreno di coltura cellulare da ogni piatto di coltura di 100 mm.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di mezzo di coltura cellulare che include le concentrazioni appropriate di composti o farmaci per ogni piatto, avendo cura di non disturbare lo strato cellulare. Nota: a scopo dimostrativo, abbiamo aggiunto 10 μL di 250 mM di diamido disciolto in PBS (concentrazione finale di 250 μM) in questo esperimento.</li>
	<li>Incubare i piatti della cultura a 37 ° c per 30 minuti in presenza di diamido o PBS come controllo.</li>
	<li>Aspirare il terreno di coltura cellulare da ogni piatto di coltura di 100 mm.</li>
	<li>Lavare le cellule aggiungendo delicatamente 2 mL di soluzione di mannitolo al 5% al bordo di ogni piatto, avendo cura di non disturbare lo strato cellulare, quindi inclinare leggermente il piatto. Nota: la soluzione salina o PBS interferisce con l'analisi metabolomica basata su CE-MS e influisce negativamente sui risultati delle misurazioni e pertanto non deve essere utilizzata come tampone di lavaggio.</li>
	<li>Aspirare il tampone di lavaggio da ogni piatto di coltura, quindi lavare nuovamente le cellule aggiungendo delicatamente 10 mL di tampone di lavaggio per piatto e inclinando leggermente il piatto.</li>
	<li>Aspirare completamente il tampone di lavaggio dal bordo di ogni piatto di coltura. Nota: aspirare il più possibile il tampone di lavaggio, prestando attenzione a non aspirare le cellule. Il mannitolo residuo può interferire con l'analisi CE-MS; l'aspirazione delle cellule diminuirà il numero di cellule e diventerà quindi una fonte di errore nella normalizzazione dei dati.</li>
</ol>5. estrazione di metaboliti da cellule coltivate
<ol><li>Aggiungere 800 μL di 99,7% di metanolo per ogni piatto di coltura. Delicatamente roccia ogni piatto di cultura avanti e indietro per coprire tutta la sua superficie. Lasciare i piatti a temperatura ambiente per 30 s.</li>
	<li>Aggiungere lentamente 550 μL di soluzione standard interna diluita per piatto immergendo la punta della pipetta nel metanolo e pipettando delicatamente su e giù più volte.</li>
	<li>Delicatamente roccia ogni piatto di cultura avanti e indietro per coprire tutta la sua superficie.</li>
	<li>Lasciare i piatti a temperatura ambiente per 30 s.</li>
</ol>6. ultrafiltrazione di estratti cellulari
<ol><li>Trasferire la soluzione estratta da ogni piatto di coltura a una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL separata.</li>
	<li>Centrifugare i tubi a 2.300 × g a 4 ° c per 5 min.</li>
	<li>Trasferire 350 μL di ogni supernatante in due unità filtranti centrifughe per campione. Nota: da ogni piatto di coltura, un totale di 700 μL di soluzione estratta viene trasferito in due provette filtranti (350 μL/tubo).</li>
	<li>Centrifugare i tubi filtranti a 9.100 × g a 4 ° c per circa 2 h fino a quando non rimane liquido nelle tazze filtranti.</li>
	<li>Rimuovere le tazze filtranti e chiudere ermeticamente i coperchi dei tubi di raccolta.</li>
</ol>7. evaporazione del campione
<ol><li>Preparare un evaporatore centrifugo — tipicamente, questo è costituito da un evaporatore, una trappola fredda, e una pompa per vuoto.</li>
	<li>Collocare i tubi di raccolta nell'evaporatore centrifugo. Nota: lasciare aperti i coperchi dei tubi.</li>
	<li>Evaporare le soluzioni di campionamento estratte in condizioni di vuoto a temperatura ambiente. Nota: le configurazioni tipiche per il numero di rotazioni e pressione sono 1.500 rpm e 1.000 PA, rispettivamente, e di solito ci vogliono circa 3 h per evaporare completamente i campioni.</li>
	<li>Verificare che nessun liquido rimanga in nessuno dei tubi di raccolta e chiudere saldamente i coperchi dei tubi.</li>
	<li>Conservare i tubi di raccolta in un congelatore profondo a bassissima temperatura (− 80 ° c) fino all'analisi metabolomica.</li>
</ol>8. analisi metabolomica di CE-MS
<ol><li>Risospendere il filtrato in 50 μL di acqua ultrapura immediatamente prima dell'analisi CE-MS.</li>
	<li>Eseguire l'analisi CE-MS con metodi descritti in precedenza12,13 utilizzando il sistema di elettroforesi capillare e il sistema di spettrometro di massa a tempo di volo dotato di una pompa isocratica, un adattatore CE-MS e uno spruzzatore CE-ESI-MS. Nota: entrambi i sistemi possono essere controllati dal software dei venditori di sistema e sono collegati da un capillare di silice fusa (50 μm di diametro interno × 80 cm di lunghezza totale).<ol>
<li>Impostare gli strumenti e le fiale di campionamento, preparare il capillare con una cassetta capillare, ricostituire i liquidi della guaina e i tamponi di elettroforesi appropriati in base alla modalità di analisi anionica o cationico, quindi applicare tensioni. Nota: la strumentazione e le condizioni analitiche sono descritte in dettaglio altrove12,13.</li>
		<li>Aprire il software e preparare una lista di lavoro contenente i metodi di acquisizione dati e le informazioni di esempio.</li>
		<li>Avviare una corsa di prova e controllare i dati come l'intensità del segnale e la forma di picco degli standard interni e la risoluzione di picco di altri composti standard.</li>
		<li>Se necessario, regolare le condizioni analitiche.</li>
		<li>Iniettare le soluzioni campione a 50 mbar per 3 s e una tensione di 30 kV. Nota: CE-MS è stato condotto sia in modalità ioni positive che negative. Impostare lo spettrometro per scansionare l'intervallo di massa m/z 50 – 1000. La tensione capillare è stata fissata a 4 kV; la portata del gas di azoto (temperatura del riscaldatore 300 ° c). Per la modalità positiva, il fragmentor, skimmer e OCT RFV tensione sono stati impostati a 75, 50 e 125 V, rispettivamente. Per la modalità a ioni negativi, il fragmentor, skimmer, e OCT RFV tensione è stato impostato a 100, 50 e 200 V, rispettivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizzare i dati dello spettro.<ol>
<li>Estrai i picchi dai dati spettrali di massa utilizzando il software di integrazione automatica al fine di ottenere informazioni di picco tra cui m/z, area di picco e tempo di migrazione (mt). Nota: il metodo è descritto in dettaglio altrove14.</li>
		<li>Escludere i picchi di segnale corrispondenti a isotopomeri, ioni addotti e altri ioni di prodotti di metaboliti conosciuti.</li>
		<li>Annotare i picchi rimanenti con informazioni dal database del metabolita HMT in base ai valori m/z e MTS.</li>
		<li>Normalizza le aree dei picchi annotati ai livelli standard interni e al numero di celle per campione.</li>
		<li>Valutare la concentrazione di ciascun metabolita nelle cellule coltivate (pmol/106 cellule) utilizzando le curve standard preparate per ciascun metabolita.</li>
		<li>Utilizzare le concentrazioni dei metaboliti quantificati per le successive analisi statistiche e le interpretazioni biologiche14.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+mass+spectrometry-based+saliva+metabolomics+identified+oral%2C+breast+and+pancreatic+cancer-specific+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles.</a> Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, descriviamo una metodologia ampiamente accessibile per preparare i metaboliti dalle cellule tumorali coltivate per l'analisi metabolomica basata su CE-MS. Uno dei punti più critici di questo protocollo è la corretta preparazione delle cellule tumorali, perché le concentrazioni dei metaboliti misurati sono normalizzate al numero di cellule vitali. Per una stima accurata del numero di cellulare, è necessario preparare almeno un piatto di coltura aggiuntivo per gruppo sperimentale per contare il numero di cellule vitali in parallelo con l'estrazione dei metaboliti per l'analisi metabolomica. Inoltre, lo stesso numero di cellule deve essere seminata in ogni piatto per i replicati e nel piatto per il conteggio; in futuro, questo sarebbe aiutato da un protocollo di conteggio cellulare rapido e privo di stress (ad esempio, senza tripsina) che consente di utilizzare lo stesso piatto sia per contare le cellule vitali che per estrarre i metaboliti. Prestare attenzione durante i Lavini in modo che le cellule non si staccino dalla superficie dei piatti. Test di citotossicità severa e altri esperimenti che riducono l'adesione delle cellule possono essere inadatti per questo protocollo di estrazione a causa della potenziale perdita di cellule durante la procedura di lavaggio.
È importante utilizzare una soluzione di mannitolo al 5% come tampone di lavaggio per estrarre i metaboliti dalle cellule coltivate per l'analisi metabolomica basata su CE-MS, perché i tamponi a base di sale, come PBS, interferiscono con l'analisi metabolomica e influenzano negativamente la misurazione.
Due o tre piatti possono essere combinati come un singolo campione estraendo singolarmente i metaboliti da ogni piatto e poi mettendo in comune i campioni; Tuttavia, combinando più piatti spesso aumenta il mannitolo residuo nella soluzione del metabolita Estratto. Questo può anche interferire con l'analisi metabolomica da CE-MS. quindi, si consiglia di non utilizzare più piatti o pozzi come un singolo campione.
Questo metodo di analisi metabolomica che utilizza CE-MS è stato sviluppato per la misurazione completa delle molecole cariche con pesi molecolari tra 50 e 1000 da; Pertanto, questo protocollo è ottimizzato per l'estrazione di composti acquosi a basso peso molecolare. Pertanto, questo protocollo non è adatto per l'estrazione di metaboliti idrofobici come i lipidi o macromolecole come le proteine e gli acidi nucleici. Poiché vi è una crescente domanda di analisi lipidica complete o lipidomica di campioni di cellule coltivate, è necessario lo sviluppo di un protocollo facile ed efficace per l'estrazione simultanea di entrambi i metaboliti idrofili e idrofobici.
Il primo passo dell'estrazione del metabolita — aspiratore medio e celle di lavaggio con mannitolo — deve essere condotto il più rapidamente possibile per minimizzare le modifiche al profilo metabolico delle cellule. Il trattamento delle cellule con metanolo dopo il lavaggio con mannitolo è assunto per denaturare le proteine e quindi impedire agli enzimi di catalizzare ulteriori reazioni metaboliche. Tuttavia, anche dopo il trattamento con metanolo, possono avvenire reazioni chimiche non enzimatiche — come reazioni redox, alcuni processi di decarbossilazione e legami tiolici —. In quanto tale, qualsiasi concentrazione di metaboliti coinvolto in queste reazioni misurata con questo protocollo deve essere interpretata con cautela. A differenza del genoma o del trascrittoma, il metaboloma è costituito da molecole con un'ampia varietà di proprietà chimiche; Pertanto, nessun singolo protocollo può estrarre tutti i metaboliti senza alcuna perdita o disturbo. Per misurazioni più accurate di tali metaboliti altamente reattivi, deve essere consultato un protocollo specificamente progettato per estrarre alcuni gruppi di metaboliti, che richiede frazioni e derivatizzazioni. Il protocollo qui presentato, tuttavia, descrive una semplice e rapida estrazione dei metaboliti acquosi dai campioni di cellule coltivate per l'analisi metabolomica da parte di CE-MS. In questo documento non è stato possibile descrivere come impostare la CE-MS in dettaglio perché il focus del presente manoscritto è diverso, tuttavia, descrivere i passaggi dettagliati per impostare CE-MS può richiedere un articolo dedicato separato.

Otto Warburg ha osservato che le cellule tumorali acquisiscono l'insolita capacità di assumere glucosio e fermentare per produrre lattato in presenza di ossigeno adeguato — un fenomeno definito come effetto Warburg o glicolisi aerobica1,2. I difetti di respirazione mitocondriale sono ipotizzato come base sottostante per la glicolisi aerobica nelle cellule tumorali3. Infatti, l'effetto Warburg è la base per l'imaging tumorale da fluorodeossiglucosio (FDG)-tomografia a emissione di positroni (PET), che è ampiamente usato nella pratica clinica4,5. Un alto tasso di glicolisi aerobica è considerato una caratteristica fondamentale del cancro ed è stato recentemente adottato come uno dei ben noti "segni distintivi del cancro", come descritto da D. Hanahan e B. Weinberg6. Mutazioni somatiche in oncogeni e geni soppressori del tumore, come HRAS/Kras/NRAS, EGFR, BRAF, Myc, TP53, Isocitrato deidrogenasi (IDH) e fumarato idratasi (FH ) — sono stati collegati a specifici cambiamenti metabolici nelle cellule tumorali, creduti per essere il risultato dell'effetto Warburg7.
L'analisi metabolomica è un approccio promettente non solo per comprendere la regolazione metabolica nelle cellule tumorali, ma anche per identificare i biomarcatori del cancro in fase precoce e la previsione della risposta alla chemioterapia. Dopo il trattamento di cellule tumorali sensibili o resistenti con composti anticancro, il tracciamento delle loro risposte metaboliche facilita l'identificazione dei biomarcatori metabolici per prevedere l'efficacia di terapie antitumorali specifiche nei pazienti affetti da cancro8 ,9,10,11. In questo articolo, le linee cellulari tumorali derivate da un adenocarcinoma polmonare con una mutazione EGFR trattata con diamido — che provoca lo stress ossidativo — sono state utilizzate come modelli per l'analisi metabolomica. Il vantaggio di questo metodo analitico utilizzando l'elettroforesi capillare-spettrometria di massa (CE-MS) è la sua misurazione completa dei metaboliti caricati con l'intervallo di massa m/z 50-100012,13. Lo scopo di questo articolo è quello di fornire ai novizi un dettagliato protocollo visivo graduale per la preparazione di metaboliti acquosi da cellule tumorali coltivate e successiva analisi metabolomica, in particolare da CE-MS.

<table><tbody><tr><td>Contatore di cellule automatizzato</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>Countess II Contatore di cellule automatizzato</td></tr><tr><td>Software di integrazione automatica</td><td>Agilent Technologies</td><td>MassHunter G3335-60041</td><td>versione B.02.00</td></tr><tr><td>Sistema CE</td><td>Agilent Technologies Agilent</td><td>7100 CE system</td><td></td></tr><tr><td>Kit adattatore CE/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1603A</td><td></td></tr><tr><td>Kit spruzzatore CE-ESI-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1607A</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per camera di conteggio cellulare</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10282</td><td>Vetrini per camera di conteggio cellulare Countess</td></tr><tr><td>Dispositivo di filtraggio centrifugo, 5 kDa</td> Human <td>Metabolome Technologies</td><td>ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT</td><td></td></tr><tr><td>Tubo conico sterile in polipropilene, 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339651</td><td></td></tr><tr><td>Tubo conico sterile in polipropilene, 50 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339653</td><td></td></tr><tr><td>Costar stripette, 10 ml</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar stripette, 5 ml</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Mannitol</td><td>Wako</td><td>133-00845</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>tampone per elettroforesi</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3301-1001</td><td>per analisi</td></tr><tr><td>cationica Tampone per elettroforesi</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3302-1021</td><td>per analisi degli anioni</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Biowest</td><td>S1780</td><td></td></tr><tr><td>Punta filtrante, 1000 &mu; l</td><td>Watson</td><td>124P-1000S</td><td></td></tr><tr><td>Punta filtro, 20 &; mu; l</td><td>Watson</td><td>124P-20S</td><td></td></tr><tr><td>Punta filtro, 200 &; l</td><td>Watson</td><td>1252-703CS</td><td></td></tr><tr><td>Capillare in silice fusa</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>50 &mu; m i.d. &volte; 80 cm di lunghezza totale</td></tr><tr><td>HCC827</td><td>Collezione di colture di tipo americano</td><td>CRL-2868</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione standard interna</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3304-1002</td><td></td></tr><tr><td>Pompa isocratica</td><td>Agilent Technologies</td><td>Agilent Serie 1100 Pompa</td><td></td>isocratica</tr><tr><td>Metanolo</td><td>Wako</td><td>138-14521</td><td>1 L, Microtubo di grado LC/MS</td></tr><tr><td>, 1,5 ml</td><td>Watson</td><td>131-415C</td><td></td></tr><tr><td>Software operativo</td><td>Agilent Technologies</td><td>ChemStation G2201AA</td><td>versione B.03.01 per CE</td></tr><tr><td>PC-9</td><td>RIKEN Bio Resource Center</td><td>RCB4455</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Piatto sterile per coltura tissutale, 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro di massa a tempo di volo</td><td>Agilent Tecnologie</td><td>Agilent G1969A Soluzione blu di tripano LC/MS</td><td></td>a tempo di volo</tr><tr><td>, 0,4%</td><td>Thermo Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Acqua ultrapura</td><td>Merck</td><td>Acqua Milli-Q</td><td>18,2 M&Omega; &#183; cm acqua pura</td></tr><tr><td>Pallone tarato 50 ml</td><td>Iwaki</td><td>5640FK50E</td><td>TE-32</td></tr></tbody></table>

estrazione di metaboliti acquosi da cellule aderenti coltivate per l'analisi metabolomica mediante elettroforesi capillare-spettrometria di massa

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

L'analisi metabolomica è un approccio omico promettente non solo per comprendere la regolazione metabolica specifica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule normali, ma anche per identificare i biomarcatori per il rilevamento precoce del cancro e la previsione della risposta alla chemioterapia in Cancro. La preparazione di campioni uniformi per l'analisi metabolomica è un problema critico che rimane da affrontare. Qui, presentiamo un protocollo facile e affidabile per l'estrazione di metaboliti acquosi da cellule aderenti coltivate per l'analisi metabolomica utilizzando elettroforesi capillare-spettrometria di massa (CE-MS). I metaboliti acquosi provenienti da cellule coltivate vengono analizzati attraverso la coltura e il lavaggio delle cellule, il trattamento delle cellule con metanolo, l'estrazione di metaboliti e la rimozione di proteine e macromolecole con colonne di spin per l'analisi CE-MS. I risultati rappresentativi che utilizzano linee cellulari di cancro al polmone trattate con diamido, un reagente ossidativo, illustrano lo spostamento metabolico chiaramente osservabile delle cellule sotto stress ossidativo. Questo articolo sarebbe particolarmente prezioso per gli studenti e gli investigatori coinvolti nella ricerca metabolomica, che sono nuovi per la raccolta di metaboliti da linee cellulari per l'analisi da CE-MS.

Poiché le concentrazioni di metaboliti nelle cellule tumorali (pmol/106 cellule) sono normalizzate al numero di cellule vitali, le condizioni sperimentali devono essere impostate con cautela in modo da minimizzare la variazione del numero di cellule vitali tra le condizioni. Ad esempio, il trattamento con diammide era ad una concentrazione relativamente alta (250 μm), ma per un breve periodo di tempo per consentire a tutte le cellule di crescere il più possibile, equalizzazione del numero di cellule vitali analizzate. In queste condizioni sperimentali, le cellule HCC827 e PC-9 sono cresciute ugualmente per 3 ore (Figura 1). L'analisi CE-MS delle cellule trattate con diamido rispetto alle cellule trattate con PBS (controllo) ha rivelato 175 e 150 metaboliti differenziali rispettivamente nelle cellule HCC827 e PC-9. Tra questi, diversi intermedi nella via del pentoso fosfato (PPP) e nella glicolisi superiore sono stati significativamente più elevati nelle condizioni trattate con diamido in entrambe le linee cellulari, mentre alcuni intermedi del ciclo di acido tricarbossilico (TCA) erano più bassi nel trattamento condizioni (Figura 2 e Figura 3).
Il PPP genera equivalenti riducenti sotto forma di nicotinamide adenina dinucleotide fosfato (NADPH), che viene utilizzato per la manutenzione dell'omeostasi redox e la biosintesi degli acidi grassi15. Dopo il trattamento con diamido, il livello di acido gluconico — un glucosio ossidato — aumentò di 12 volte in cellule HCC827 e 10 volte in cellule PC-9; Analogamente, dopo il trattamento con diammide, il livello di glucosio-6-fosfato (G6P) — un glucosio fosforilato e il primo prodotto di glicolisi di esochinasi-catalizzato — aumentava anche 6,3 e 3,5 volte in HCC827 e cellule PC-9, rispettivamente (Figura 4). Inoltre, dopo il trattamento con diammide, i livelli di 6-fosfogluconato (6PG) — il primo intermedio in PPP — hanno aumentato drasticamente 89 volte in cellule HCC827 e 231 volte in cellule PC-9 rispetto ai livelli osservati nei controlli PBS (Figura 4). Al contrario, i livelli di altri intermedi glicolitici, come il fruttosio-6-fosfato (F6P) e il fruttosio-1, 6-bifosfato (F1, 6P), non sono mutati nella condizione sperimentale di diamido (Figura 4). I livelli totali di nicotinamide adenina dinucleotide fosfato (NADP+) sono stati quasi equivalenti tra il trattamento con diamido e le condizioni di controllo di PBS (Figura 4), suggerendo che il glucosio è stato principalmente CATABOLIZZATO attraverso il PPP.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig1.jpg"> Figura 1. Numeri di cella invariati al trattamento con diammide. Le risposte di crescita cellulare a 250 μm di diamido sono state misurate utilizzando la colorazione blu Trypan. Sono mostrati i numeri di cella di (A) HCC827 e (B) le cellule PC-9 trattate con PBS (blu) o diammide (rosso; 250 μm) per 1 o 3 ore. I dati sono mostrati come media ± SD (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig2.jpg"> Figura 2. I picchi di metaboliti di MS rappresentativi. Elettropherogrammi annotati come (A) acido gluconico, (B) glucosio-6-fosfato (G6P), (C) 6-fosfogluconato (6PG), e (D) NICOTINAMIDE adenina dinucleotide fosfato (NADP+) ottenuta con l'analisi CE-MS. Ogni linea indica la linea cellulare (solida, HCC827; punteggiata, PC-9) e il trattamento (blu, PBS; rosso, diamido) utilizzato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig3.jpg"> Figura 3. I profili metabolomi dei metaboliti intracellulari. Piegare le variazioni dei metaboliti in (a) HCC827 e (B) le cellule PC-9 trattate con diamido sono mostrate come log2(diammide/PBS). In totale, 175 e 150 metaboliti sono stati annotati rispettivamente nelle cellule HCC827 e PC-9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig4.jpg"> Figura 4. Up-regolazione del PPP al momento del trattamento con diamido. Sono mostrate le concentrazioni intracellulari (pmol/106 cellule) dei principali metaboliti coinvolti nella glicolisi e la via del pentoso fosfato (PPP) dopo il trattamento con diamido. I metaboliti sono stati estratti da HCC827 e cellule PC-9 trattate con PBS (blu) o diammide (rosso, 250 μm) per 30 min. metaboliti rappresentativi quali acido gluconico, glucosio-6-fosfato (G6P), fruttosio-6-fosfato (F6P), 6 -Fosfogluconato (6Pg), e nicotinamide adenina dinucleotide fosfato (NADP+) sono mostrati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>

Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere un protocollo per l'estrazione di metaboliti acquosi da cellule aderenti coltivate per l'analisi metabolomica, in particolare, elettroforesi capillare-spettrometria di massa.

Estrazione di metaboliti acquosi da cellule aderenti coltivate per l'analisi metabolomica mediante elettroforesi capillare-spettrometria di massa

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Lo scopo di questo articolo è quello di fornire un protocollo visivo dettagliato e graduale per l'estrazione di metaboliti acquosi da cellule tumorali coltivate per successive analisi del metaboloma. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua semplicità e affidabilità per l'estrazione di metaboliti dalle cellule aderenti. Ma soprattutto, è ben ottimizzato per l'analisi del metaboloma utilizzando l'elettroforesi capillare-spettrometria di massa o CEMS.La metabolomica è una tecnica potente per identificare i biomarcatori o rilevare il cancro in fase iniziale e prevedere la risposta chemioterapica ai pazienti oncologici. Usiamo cellule tumorali in questa dimostrazione. Tuttavia, questa tecnica può anche essere applicata ai metaboliti del raccolto da altre cellule aderenti come i fibroblasti nelle cellule iPS.Le concentrazioni di metaboliti sono normalizzate in base al numero di cellule vitali. Quindi un'attenta preparazione della cultura, questa è la chiave per ottenere buoni dati riproducibili. A dimostrare la procedura sarà Ami Maruyama, un tecnico del mio laboratorio.Per cominciare, piastra HCC827 e CELLE PC-9 in piatti da 100 millimetri contenenti 10 millilitri di mezzo RPMI-1640 integrati con siero bovino fetale al 10%. Mettere i piatti in un'incubatrice al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius per 24 ore alla coltura. Dopo l'incubazione, inclinare delicatamente i piatti di coltura da 100 millimetri per aspirare il supporto di coltura cellulare.Lavare le cellule su ogni piatto utilizzando due millilitri di soluzione salina tamponata da fosfati senza calcio e magnesio. Scuotere delicatamente ogni piatto in modo che la soluzione PBS copra completamente la superficie del piatto, quindi inclinare i piatti per aspirare il tampone di lavaggio. Soluzione calda 0.25%trypsin-EDTA a 37 gradi Celsius.Con una pipetta sierologica da cinque millilitri, aggiungere due millilitri della soluzione di tripside-EDTA riscaldata ad ogni piatto. Scuotere delicatamente ogni piatto in modo che la triptina copra completamente la superficie del piatto. Incubare i piatti di coltura a 37 gradi Celsius per circa cinque minuti.Quindi, aggiungere quattro millilitri del mezzo di crescita completo pre-riscaldato ad ogni piatto. E pipettare delicatamente più volte per sospendere di nuovo le cellule in mezzo. Trasferire ogni sospensione cellulare in un tubo conico separato da 15 millilitri.Centrifuga a 800 volte g per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo ogni pellet cellulare in due millilitri del mezzo di crescita completo prerifatti. Mescolare 10 microlitri della sospensione cellulare con 10 microlitri di soluzione blu 0,4% trypan, in un microtubo da 1,5 millilitri.Caricare 10 microlitri della miscela in una camera di conteggio cellulare scorrere attraverso l'azione capillare. Inserire la diapositiva della camera nel contatore di celle automatico e premere il pulsante di acquisizione per acquisire l'immagine e visualizzare i risultati del numero totale e della percentuale di vitalità delle celle. Se il numero totale di cellule è superiore a 0,5 milioni di cellule per millilitro, aggiungere ulteriore mezzo di crescita al tubo conico da 15 millilitri per ottenere la concentrazione cellulare desiderata.Ora, aggiungete da due a cinque millilitri della coltura a ogni piatto di coltura cellulare da 100 millimetri per seminare circa uno o 2 1/2 milioni di cellule per piatto. Incubare i piatti di coltura in anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per 18 ore. In primo luogo, in un matraccio volumetrico da 15 millilitri, diluire una soluzione standard interna commerciale contenente L-metonina sulfone e acido solfonico D-Canfora-10 1.000 volte in acqua ultrapura.Sciogliere il mannitolo in acqua ultrapura per preparare una soluzione di mannitolo da 0,05 grammi per millilitro in acqua ultrapura come tampone di lavaggio. Quindi, nella tazza filtrante di ogni unità filtrante centrifuga, pipetta 250 microlitri di acqua ultrapura. Limitare saldamente le unità filtranti e centrifugare a 9,100 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Controllare il volume di ogni filtrato. Se durante il primo breve giro si è accumulato un filtrato significativo, l'unità filtrante potrebbe essere difettosa. Scartare l'unità filtro e utilizzare invece una nuova unità filtro.Chiudere saldamente i coperchi delle unità filtranti e centrifugare nuovamente a 9, 100 volte g a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Assicurarsi che non rimanga acqua ultrapura in nessuna delle tazze filtranti e rimuovere l'acqua ultrapura filtrata in ogni tubo di raccolta con una pipetta. Riposizionare le tazze filtranti nei loro tubi di raccolta e utilizzare le unità filtranti centrifughe entro un'ora per evitare danni all'essiccazione.Eseni i piatti di coltura da 100 millimetri dall'incubatore e aspira il mezzo di coltura cellulare da ogni piatto. Aggiungere 10 millilitri di mezzo di coltura PBS con o senza diammide micromolare 250 ad ogni piatto, facendo attenzione a non disturbare lo strato cellulare. Incubare i piatti di coltura a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Dopo l'incubazione, aspirare il mezzo di coltura cellulare da ogni piatto di coltura di 100 millimetri. Inclinare leggermente il piatto e aggiungere delicatamente due millilitri di tampone di lavaggio del 5% di mannitolo sul bordo di ogni piatto per lavare le cellule, facendo attenzione a non disturbare lo strato cellulare. Aspirare il tampone di lavaggio da ogni piatto di coltura e lavare nuovamente le cellule inclinando leggermente il piatto e aggiungendo delicatamente 10 millilitri di tampone di lavaggio per piatto.Quindi, aspirare completamente il tampone di lavaggio dal bordo di ogni piatto di coltura. Ora, aggiungi 800 microlitri di 99,7% di metanolo per piatto di coltura e dondola delicatamente ogni piatto di coltura avanti e indietro, per coprire l'intera superficie. Lasciare i piatti a temperatura ambiente per 30 secondi.Aggiungere lentamente 550 microlitri della soluzione standard interna diluita per piatto immergendo la punta della pipetta nel metanolo e tubazione delicatamente su e giù, più volte. Scuotere delicatamente ogni piatto di coltura avanti e indietro per coprire tutta la sua superficie e lasciare i piatti a temperatura ambiente per 30 secondi. Quindi, trasferire la soluzione estratta da ogni piatto di coltura in un tubo di microcentrifugo separato da 1,5 millilitri.Centrifugare i tubi a 2.300 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Trasferire 700 microlitri di ogni supernatante in due unità filtranti centrifughe, con 350 microlitri per unità. Centrifugare i tubi filtranti a 9,100 volte g a quattro gradi Celsius per circa due ore, fino a quando non rimane liquido nelle tazze filtranti.Rimuovere le tazze filtranti e chiudere saldamente i coperchi dei tubi di raccolta. In questo studio, le cellule HCC827 e PC-9 sono cresciute allo stesso modo per tre ore. L'analisi CEMS indica la differenza tra le cellule trattate con diammide e le cellule trattate con PBS per entrambe le linee cellulari.Tra questi, diversi intermedi nella via del fosfato pentoso e nella glicolisi superiore erano significativamente più alti nelle condizioni trattate con diammide, mentre alcuni intermedi del ciclo tricarrbossilico erano più bassi nelle condizioni trattate. I profili metaboloma dei metaboliti intracellulari hanno rivelato 175 e 150 metaboliti differenziali rispettivamente nelle cellule HCC827 e PC-9. Dopo il trattamento con diammide, il livello di acido gluconico e glucosio ossidato è aumentato di 12 volte nelle cellule HCC827 e di 10 volte nelle cellule PC-9.Allo stesso modo, il livello di glucosio 6-fosfato, un glucosio fosforilato nel primo prodotto di glicolisi catalizzato da esochinasi, è aumentato anche di 6,3 e 3,5 volte rispettivamente nelle cellule HCC827 e PC-9. Inoltre, i livelli di 6-fosfogluconato, il primo intermedio nella via del fosfato pentoso, sono aumentati drasticamente di 89 volte nelle cellule HCC827 e di 231 volte nelle cellule PC-9. Al contrario, i livelli di altri intermedi glicolitici come il fruttosio 6-fosfato non sono cambiato nella condizione sperimentale della diammide.I livelli totali di nicotinammide adenina dinucleotide fosfato erano quasi equivalenti tra il trattamento con diammide e le condizioni di controllo pbs. L'utilizzo di una soluzione di mannitolo al 5%, diversa dal PBS, come tampone di lavaggio per le celle di lavaggio è molto importante per l'analisi CEMS, perché i tamponi a base di sale interferiscono con l'analisi e influenzano negativamente la misurazione. Questo protocollo non è adatto per l'estrazione di metaboliti idrofobici come i lipidi, quindi dobbiamo sviluppare un protocollo per estrarre comodamente metaboliti idrofili e idrofobici per un'analisi più completa del metaboloma.Questa tecnica realizza una facile estrazione di metaboliti da quasi tutte le cellule aderenti e, quindi, è applicabile per una varietà di ricerche come cancro, cellule staminali, farmacologia, nutrizione e scienza cosmetica.

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Cromatografia liquida accoppiata all'indice di rifrazione o al rilevamento spettrometrico di massa per la profilazione dei metaboliti in sistemi privi di cellule a base di lisato

Questo protocollo mira a preservare i metaboliti cellulari per la spettrometria di massa a singola cellula (SCMS) combinando il lavaggio con soluzione salina volatile, l'estinzione rapida dell'azoto liquido, la liofilizzazione e lo stoccaggio a -8 °C. Dimostra che l'estinzione dell'azoto liquido è essenziale per mantenere i profili dei metaboliti, mentre la conservazione prolungata del freddo dovrebbe essere ridotta al minimo per prevenire alterazioni metaboliche.

Preparazione del campione per la spettrometria di massa a singola cellula Studi di metabolomica: lavaggio, tempra, essiccazione e conservazione combinati delle cellule

Scopri un protocollo affidabile per l'estrazione di metaboliti acquosi da cellule aderenti, ottimizzato per l'analisi metabolomica mediante elettroforesi capillare-spettrometria di massa. Questo metodo semplice supporta la ricerca sul cancro.

Estrazione di metaboliti acquosi da cellule aderenti coltivate per lanalisi metabolomica mediante elettroforesi capillare-spettrometria di massa (Video) | JoVE Journal

Estrazione di metaboliti acquosi da cellule aderenti coltivate per l'analisi metabolomica mediante elettroforesi capillare-spettrometria di massa

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