Name: Aspetto tecnico della sintesi automatizzata e valutazione cinetica in tempo reale di 11C SNAP-7941 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Scopri la sintesi automatizzata di [11C]SNAP-7941 per la valutazione cinetica in tempo reale mediante PET. Questo metodo consente di studiare l'espressione dei recettori e le dinamiche di legame in vitro con elevata precisione.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo scientifico austriaco (FWF P26502-B24, M. Mitterhauser). Siamo grati per il supporto tecnico di T. Ez e A. Krcal. Inoltre, ringraziamo K. Pallitsch per la preparazione dell'AgOTf e H. Spreitzer per la distribuzione del precursore.

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</ol>

Non abbiamo niente da rivelare.

La radiosintesi di [11C]SNAP-7941 è stata stabilita su un modulo di sintesi commerciale. A causa della possibilità di automatizzare completamente la procedura di preparazione, la radiosintesi ha cercato di essere affidabile e sono stati raggiunti miglioramenti per quanto riguarda la protezione dalle radiazioni dell'operatore. La preparazione del sintetizzatore ha un enorme impatto sulla qualità del radiotracer, soprattutto in termini di attività molare. Pertanto, è essenziale lavorare costantemente in condizioni inerti (ad esempio, atmosfera di elio) e lavare tutte le linee posizionate prima della nave di reazione (linea bersaglio, [11C]CH3I ciclo di produzione e reattore (vedi Figura 2)). Inoltre, riscaldare le rispettive trappole e forni prima dell'inizio della sintesi per rimuovere l'umidità e il carbonio atmosferico aumenta l'attività molare in modo vantaggioso. Soprattutto la colonna AgOTf, impregnata di carbonio grafitizzato, è estremamente sensibile all'umidità. Anche piccole quantità di qualsiasi fonte di umidità disturbano la conversione di [11C]CH3I a [11C]CH3OTf. Prima di iniziare la sintesi, la trappola[11C]CO2 e la trappola [11C]CH3I devono essere raffreddate di nuovo a temperatura ambiente per consentire l'intrappolamento successivo. Inoltre, si raccomanda di sciogliere il precursore poco prima di iniziare la sintesi e di aggiungere la base direttamente nella soluzione precursore.
Il controllo di qualità per i radiotracciatori carbonio-11 deve essere progettato razionalmente per un flusso di lavoro continuo e veloce. Tuttavia, i parametri più importanti per gli studi di coltura cellulare sono la purezza radiochimica e l'attività molare per ottenere risultati validi. Una corretta valutazione dell'attività molare richiede un robusto metodo HPLC analitico e la curva di calibrazione deve coprire la gamma di concentrazione del prodotto finale. La parte difficile per i radiotracciatori è quella di ottenere una concentrazione superiore al limite di quantificazione (LOQ) a causa di piccole quantità, che vengono prodotte durante la radiosintesi. Quindi, l'arte è quella di trovare l'equilibrio tra attività molare elevate per evitare la saturazione del recettore e concentrazioni abbastanza elevate per essere ancora in grado di quantificare il segnale non radioattivo.
[11C] SNAP-7941 è stato confermato essere un potente substrato del trasportatore umano P-gp, in quanto non è stato osservato alcun accumulo nelle cellule MDCKII-hMDR1 non trattate o trattate con il veicolo a causa del rapido efflusso. Al contrario, entrambi i set up sperimentali (MDCKII-WT o cellule MDCKII-hMDR1 pre-bloccate) hanno fornito risultati simili (accumulazione di [11C]SNAP-7941), supportando la versatilità di questo saggio in vitro. Le cellule MDCKII-hMDR1 sono altamente adatte per gli esperimenti LigandTracer a causa della loro trasfezione stabile, della rapida crescita e della persistente contro lo stress da taglio causato dal piatto di coltura cellulare rotante. La mancanza di [11C]SNAP-7941 assorbimento nel cervello di ratti e topi potrebbe quindi verificarsi causata da efflusso attraverso il trasportatore P-gp. A causa della trasfezione delle cellule renali canine con la proteina di resistenza multifarmaco umano 1 (hMDR-1, P-gp), il valore predittivo di questo metodo per il legame trasportatore di efflusso negli esseri umani è elevato, il che è favorevole in termini di una futura applicazione clinica. Tuttavia, finora, la selettività contro altri trasportatori di efflusso non è stata verificata. Pertanto, altre linee cellulari possono essere utilizzate, esprimendo diversi trasportatori di efflusso prominente come la proteina di resistenza al cancro al seno (BCRP) o proteina di resistenza multipla-1 (MRP-1), per studiare le interazioni verso questi trasportatori. Il metodo è in confronto ai saggi di accumulo o di trasporto classici molto semplici e dà risultati immediatamente qualitativi. Inoltre, il più grande vantaggio è che questa tecnologia consente di valutare l'interazione diretta del tracciante PET e dell'obiettivo in tempo reale, a differenza dell'esperimento convenzionale che utilizza la quantificazione indiretta (per lo più spostamento). Inoltre, il software di radioasposition in tempo reale fornisce flessibilità sperimentale (ad esempio, correzione del decadimento al nuclide, misurazione del tempo e delle posizioni, ecc.) e quindi un'elevata libertà per gli utenti. Dall'altro lato, le limitazioni del metodo includono una bassa velocità effettiva del campione, poiché è possibile misurare una sola parabola cellulare alla volta. Inoltre, si dovrebbero prendere in considerazione alcune altre questioni tecniche e operative: la tecnologia descritta è molto sensibile alle radiazioni di fondo; pertanto, le sorgenti di radiazione devono essere mantenute a distanza e l'enfasi deve essere posta sulla misurazione dello sfondo prima dell'esperimento. Un altro problema riguardante gli esperimenti a temperature più elevate rispetto alla temperatura ambiente, è il riscaldamento del supporto inclinato: l'evaporazione del mezzo di coltura cellulare potrebbe influenzare il rivelatore. Invece di riscaldare, l'intero dispositivo è preferibilmente collocato nell'incubatrice. Inoltre, il metodo è limitato alle linee cellulari aderenti. Attraverso la rotazione del piatto di coltura cellulare, le cellule sensibili allo stress da taglio potrebbero staccarsi dal piatto, il che può portare a risultati non validi.
Tuttavia, se lo sperimentatore presta attenzione a questi piccoli inconvenienti, il metodo fornisce risultati rapidi e affidabili per l'analisi del comportamento cinetico dei traccianti PET preclinici.

[11C] SNAP-7941 si è evoluto come il primo tomografia a emissione di positroni (PET)-tracciante mirato al recettore dell'ormone concentrato di melanina 1 (MCHR1) - un recettore coinvolto principalmente nella regolazione centrale dell'appetito e dell'assunzione di cibo1. L'etichettatura Carbon-11 di SNAP-7941, un antagonista MCHR1 ben caratterizzato, ha prodotto l'autentico PET-tracer2,3,4,5. Tuttavia, la radiosintesi completamente automatizzata è molto impegnativa in termini di efficacia del tempo e riproducibilità con il radionuclide di breve durata carbon-11 che offre un'emivita di 20 min6. Il tempo complessivo di sintesi deve essere ridotto al minimo e, come regola generale, non deve superare le emivite 2-3 (cioè circa 40-60 min per il carbonio-11)7. In particolare, le procedure di sintesi per i radiotracciatori che prendono di mira i sistemi di recettori con densità a bassa espressione devono essere ampiamente ottimizzate per ottenere rese sufficienti e di conseguenza un'elevata attività molare8. La strategia sintetica segue spesso la produzione di radionuclidi all'interno di un ciclotrone e il rilascio di [11C]CO2 al sintetizzatore. Lì, [11C]CO2 viene prima ridotto a [11C]CH4 e successivamente ha reagito con iodio per produrre [11C]CH3I attraverso il metodo di fasegas9,10. Ulteriore trattamento con rese triflate d'argento [11C]CH3OTf direttamente on-line. Successivamente, questo carbonio-11 reattivo etichettato come intermedio viene introdotto in una soluzione contenente la molecola precursore. Una radiosintesi automatizzata comporta inoltre un processo di purificazione con RP-HPLC semi-preparativo che include la successiva formulazione del prodotto adatto per studi preclinici e clinici.
Indipendentemente dall'emivita del radionuclide e dallo sforzo temporale della radiosintesi, la farmacocinetica di un radiofarmaceutico è la parte più critica da valutare durante lo sviluppo del PET-tracer. In termini di neuroimaging, l'ingresso cerebrale del PET-tracer è il prerequisito principale. Tuttavia, la barriera ematoencefalica (BBB), un "confine di sicurezza" del cervello, esprime altamente trasportatori di efflusso che possono scaricare piccole molecole (ad esempio, pet-traccianti) e ostacolarne in modo efficiente l'applicabilità.
Un enorme inconveniente durante la valutazione preclinica sono le interazioni inaspettate verso questi trasportatori di efflusso, che spesso non sono riconosciuti negli esperimenti in vitro e che portano al fallimento del PET-tracer in vivo, come osservato per [11C]SNAP-7941. L'imaging di sPET nei ratti ha dimostrato un basso accumulo cerebrale, che è aumentato drammaticamente dopo la somministrazione dell'inibitore P-gp tariquidar11. Questi dati hanno suggerito che[11C]SNAP-7941 è un substrato di questo sistema trasportatore efflux che impedisce il legame dei ligandi al centro MCHR1. Purtroppo, mancano ancora modelli in vitro adeguati che consentano di prevedere la penetrazione di BBB in una fase iniziale dello sviluppo del tracciante.
Qui, descriviamo la sintesi automatica di [11C]SNAP-7941 utilizzando un sintetizzatore per metilazioni di carbonio-11. L'enfasi di questo lavoro è quella di dare una panoramica su come organizzare un approccio sperimentale consecutivo che comprenda la sintesi automatizzata, il controllo di qualità e la successiva valutazione in vitro con il nuclide carbon-11 di breve durata.
In primo luogo, vengono descritti i passi chiave per una radiosintesi di successo con un dispendio di tempo minimo e una resa massima. Quindi, viene istituita una procedura di controllo di qualità affidabile che rende il radiotracciatore disponibile per potenziali studi clinici e soddisfa i criteri della Farmacola europea12. La quantificazione della concentrazione molare e il calcolo della rispettiva attività molare è un requisito essenziale per le successive misurazioni cinetiche.
Infine, viene presentato un nuovo e diretto metodo in vitro che valuta le interazioni di [11C]SNAP-7941 verso il trasportatore efflux, P-gp (hMDR1). Il modello cinetico proposto utilizza un dispositivo facile da gestire che consente un'interpretazione immediata dei dati e richiede uno sforzo minimo di coltura cellulare13.

<table><tbody><tr><td>Tabella 1: Elenco dei materiali e della strumentazione della radiosintesi completamente automatizzata di [11C]SNAP-7941</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni catalizzatore</td><td>Shimadzu, Kyoto, Giappone</td><td></td><td>Shimalilte Ni ridotto, 80/100 mesh</td></tr><tr><td>Iodio</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td></td><td>1.04761.0100</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td></td><td>per sintesi di DNA, < 10 ppm H2O</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td></td> Acetato di ammonio di <td>grado HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td></td><td>Etanolo glaciale</td></tr><tr><td></td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td></td><td>96%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>B. Braun, Melsungen, Germania</td><td></td><td>0,9% </td></tr><tr><td>Idrossido di tetrabutilammonio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td></td> Cartuccia SPE <td>di grado HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Waters, Milford, MA, USA</td><td></td><td>SepPak C18plus</td></tr><tr><td>Colonna RP-HPLC semi-preparativa</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td></td><td>SemiPrep per cromolite RP-18e, 100-10 mm</td></tr><tr><td>Precolonna</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td></td><td>Chromolith Guard RP-18e, 5-4,6 mm</td></tr><tr><td>Precursore</td><td>Università di Vienna, Austria</td><td></td><td>SNAP-acid</td></tr><tr><td>Composto di riferimento</td><td>Università di Vienna, Austria</td><td></td><td>SNAP-7941</td></tr><tr><td>Trifluorometanosolfonato d'argento</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpa GC</td><td>Alltech, Deerfield, IL, USA</td><td></td><td>80/100 mesh</td></tr><tr><td>Traccia PET 860 ciclotrone</td><td>GE Healthcare, Uppsala, Svezia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>[11C]CO2 obiettivo ad alta pressione</td><td>Air Liquide, Vienna, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRACERlabFX2 C</td><td>GE Healthcare, Uppsala, Svezia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 + 1% O2</td><td>Air Liquide, Vienna, Austria</td><td></td><td>Target gas</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Tabella 2: Elenco dei materiali e della strumentazione del controllo di qualità di [11C]SNAP-7941.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merck Hitachi LaChrom, L-7100</td><td>Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria)</td><td></td><td>Pompa HPLC</td></tr><tr><td>Merck Hitachi, L7400</td><td>Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Giappone)</td><td></td><td>Rivelatore UV</td></tr><tr><td>NaI-radiorivelatore</td><td>Raytest (Straubenhardt, Germania)</td><td></td><td>NaI-radiorivelatore</td></tr><tr><td>Chromolith Performance RP-18e, 100-4,6 mm</td><td>Merck (Darmstadt, Germania)</td><td></td><td>Colonna HPLC</td></tr><tr><td>430-GC</td><td>Bruker (Brema, Germania)</td><td></td><td>Gascromatografo</td></tr><tr><td>Colonna capillare ID-BP20; 12 mx0,22 mmx0,25 mm</td><td>SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia)</td><td></td><td>Gas capillare</td></tr><tr><td>Wesco, osmometro Vapro 5600</td><td>Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria)</td><td></td><td>Osmometro</td></tr><tr><td>g-spettrometro</td><td></td><td></td><td>g-spettrometro</td></tr><tr><td>Software di controllo della gascromatografia</td><td>VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A)Galaxie</td><td></td> <td>Versione 1.9.302.952</td></tr><tr><td>Software di controllo dello spettrometro gamma</td><td>ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)</td><td></td><td>Maestro per windows Versione 6.06</td></tr><tr><td>Software di richiamo dello spettro gamma</td><td>ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)</td><td></td><td>Winplots versione 3.21</td></tr><tr><td>Software di controllo HPLC</td><td>Raytest (Straubenhardt, Germania)</td><td></td><td>Gina Star Versione 5.9</td></tr><tr><td>inolab 740</td><td>WTW (Weilheim, Germania)</td><td></td><td>Misuratore di pH</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Tabella 3: Elenco dei materiali e della strumentazione per la valutazione del comportamento cinetico in tempo reale di [11C]SNAP-7941.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1)</td>Netherlands <td>Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)</td><td></td><td>Espressione della glicoproteina P umana (hMDR1)</td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT)</td><td>Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Paesi Bassi)</td><td></td><td>Wildtype (WT)</td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX</td><td>VWR International GmbH, Vienna, Austria</td><td></td><td>Gibco 61965-026</td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello (FCS)</td><td>VWR International GmbH, Vienna, Austria</td><td></td><td>Gibco 10270-106</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>VWR International GmbH, Vienna, Austria</td><td></td><td>Gibco 15140</td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania</td><td></td><td>Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160</td></tr><tr><td>In vitro esperimenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX</td><td>VWR International GmbH, Vienna, Austria</td><td></td><td>Gibco 61965-026</td></tr><tr><td>(&plusmn;)-Verapamil cloridrato</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)</td><td></td><td>276855-100 mL</td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania</td><td></td><td>Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160</td></tr><tr><td>Pipette sterili monouso in plastica</td><td>VWR International GmbH, Vienna, Austria</td><td></td><td>Sterilin, 5 mL &ndash; 25 mL</td></tr><tr><td>Puntali per pipette sterili</td><td>VWR International GmbH, Vienna, Austria</td><td></td><td>Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 &micro; L &ndash; 200 &micro; L</td></tr><tr><td>Palloni per colture cellulari</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania</td><td></td><td>Cellstar 250 mL, 75 cm2 red tappo a vite del filtro, Mfr.No.658175</td></tr><tr><td>Controllo LigandTracer Versione 2.2.2</td><td>Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Svezia.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LigandTracer Yellow</td><td>Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Svezia.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LigandTracer White</td><td>Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Svezia.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.0</td><td>Software GraphPad, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contatore di celle automatizzato portatile</td><td>Millipore Corporation Billerica MA01821</td><td></td><td>Scettro (Cat.No. PHC00000)</td></tr><tr><td>Sensori conta celle</td><td>Millipore Corporation Billerica MA01821</td><td></td><td>Sensore a scettro 60 &; micro; m (Cat.No. PHCC60050)</td></tr></tbody></table>

aspetto tecnico della sintesi automatizzata e valutazione cinetica in tempo reale di [11c]snap-7941

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

La tomografia a emissione di positroni (PET) è una tecnica essenziale di imaging molecolare che fornisce informazioni sui percorsi e utilizza specifici radioligandi mirati per le indagini in vivo. All'interno di questo protocollo, viene descritta una radiosintesi telecomandata robusta e affidabile di [11C]SNAP-7941, un antagonista del recettore dell'ormone che concentra la melanina 1. La radiosintesi inizia con il ciclotrone prodotto [11C]CO2 che viene successivamente ulteriormente reagito attraverso una transizione gas-fase a [11C]CH3OTf. Quindi, questo intermedio reattivo viene introdotto alla soluzione precursore e forma il rispettivo radiotracer. La purezza chimica e radiochimica sono determinate da RP-HPLC, regolarmente implementati nel processo di controllo della qualità radiofarmaceutico. Inoltre, l'attività molare viene calcolata in quanto è una necessità per le seguenti indagini cinetiche in tempo reale. Inoltre, [11C]SNAP-7941 viene applicato alle cellule MDCKII-WT e MDCKII-hMDR1 per valutare l'impatto dell'espressione P-glicoproteina (P-gp) sull'accumulo di cellule. Per questo motivo, il P-gp esprimente linea cellulare (MDCKII-hMDR1) viene utilizzato senza o con il blocco prima degli esperimenti per mezzo del substrato P-gp (-)-verapamil e i risultati vengono confrontati con quelli osservati per le cellule wildtype. L'approccio sperimentale generale dimostra l'importanza di una gestione precisa del tempo che è essenziale per ogni studio preclinico e clinico utilizzando traccianti PET radioetichettati con nuclidi di breve durata, come il carbonio-11 (emivita: 20 min).

La radiosintesi completamente automatizzata di [11C]SNAP-7941 ha prodotto 5,7 x 2,5 GBq (4,6 x 2,0% a EOB, 14,9 x 5,9% sulla base di [11C]CH3OTf; n - 10) del prodotto formulato. La sintesi complessiva è durata circa 40 min, dove sono stati necessari 15 min per la preparazione di [11C]CH3OTf attraverso il metodo della fase gassosa, altri 5 min sono stati necessari per la radioetichettatura del precursore, seguiti da 10 min di semi-preparativo Purificazione RP-HPLC e 10 min per l'estrazione e la formulazione della fase solida della cartuccia C18. Poi, una piccola aliquota (circa 100-200 l) è stata consegnata alla persona responsabile del controllo di qualità, mentre la fiala del prodotto originale contenente il tracciante pronto all'uso è stata passata allo sperimentatore dell'analisi cinetica in tempo reale.
Il controllo di qualità è stato completato entro 10 min dopo la fine della sintesi. L'attività molare era di 72 - 41 GBq/ smol (n - 10) e la purezza radiochimica era sempre &gt; 95%. Tutti gli altri parametri (pH, osmolalità, solventi residui) soddisfacevano i criteri di rilascio. Per il saggio cinetico in tempo reale, sono state scelte tre diverse configurazioni sperimentali: (A) cellule MDCKII-WT trattate e non trattate (veicolo), (B) non trattate o trattate con celle MDCKII-hMDR1 del veicolo e (C) quest'ultima linea cellulare con blocco prima del tempo reale saggio cinetico del trasportatore utilizzando il ( ) -verapamil. L'applicazione di [11C]SNAP-7941 alla linea cellulare wildtype MDCKII-WT (P-gp non-expressing) e MDCKII-hMDR1 (Espressione P-gp) mostra un comportamento cinetico diverso, in quanto vi è un rapido accumulo alla linea cellulare wildtype, mentre non è stato osservato alcun accumulo per le cellule MDCKII-hMDR1. Tuttavia, il blocco del trasportatore P-gp efflux nelle celle MDCKII-hMDR1 con il loro valore è stato registrato in tempo reale, come già osservato per la linea cellulare wildtype (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig1.jpg"> Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro. Flusso di lavoro della radiosintesi, controllo qualità e prestazioni della misurazione cinetica in tempo reale di [11C]SNAP-7941. Le frecce nere indicano la via di trasporto della radioattività. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig2.jpg"> Figura 2: Schema radiosintetico del sintetizzatore automatizzato. Circuito di commutazione del sintetizzatore automatizzato, a partire dall'unità di circolazione per [11C]CH3I/[11C]CH3OTf produzione, reattore per l'introduzione dell'attività nella soluzione precursore e la purificazione SPE (SPE estrazione di fase solida; PCV - fiala da collezione di prodotti). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig3.jpg"> Figura 3: cromatogrammi rappresentativi della radiosintesi completamente automatizzata di [11C]SNAP-7841. Il cromatogramma semi-preparativo RP-HPLC è illustrato nella parte superiore e quello analitico dopo la purificazione sul fondo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig4.jpg"> Figura 4: Preparazione della parabola di coltura cellulare per esperimenti in tempo reale. Passo 1 include la semina di 2,5 x 105 fino a 1 x 106 a seconda del tipo di cellula e il loro tasso di crescita. Successivamente, il piatto di coltura viene posto in un piano obliquo (circa 30-45 gradi). Pertanto, l'apparato metallico fornito o il coperchio di un piatto di coltura cellulare può essere utilizzato nell'incubatrice per stabilizzare la posizione ollare del piatto. Il giorno dopo (24 h) il piatto viene regolato orizzontalmente e il mezzo di coltura delle cellule fresche viene aggiunto per coprire completamente la superficie cellulare. Il giorno dell'esperimento, vengono esaminate la vitalità e la confluenza delle cellule. Secondo il protocollo sperimentale, le cellule vengono lavate con DPBS, il mezzo viene sostituito da un mezzo senza siero (2 mL), e il piatto di coltura viene riposizionato in una posizione obliqui fino all'inizio degli esperimenti. D'ora in poi, le cellule possono essere trattate con l'inibitore o il veicolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig5.jpg"> Figura 5: Misurazioni cinetiche in tempo reale di [11C]SNAP-7941. La cinetica rappresentativa in tempo reale di [11C]SNAP-7941 è mostrata in tre diverse impostazioni: utilizzando le cellule MDCKII-WT; Cellule MDCKII-hMDR1 pre-bloccate con (o-verapamil come inibitore P-gp) e cellule MDCKII-hMDR1 senza blocco. L'asse y illustra il tasso di aumento delle celle MDCKII-hMDR1 e WT prebloccate rispetto ai risultati delle cellule MDCKII-MDR1 non trattate o trattate con il veicolo, rispettivamente (nessuna assorbimento, 0%). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, rappresentiamo un protocollo per la radioetichettatura completamente automatizzata di [11C]SNAP-7941 e l'analisi della cinetica in tempo reale di questo PET-tracer su P-gp che esprime e non esprime.

Aspetto tecnico della sintesi automatizzata e valutazione cinetica in tempo reale di [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

La radioetichettatura Carbon-11 consente di utilizzare piccoli composti per la tomografia ad emissione di positroni o PET senza cambiare la molecola. Questo è essenziale per indagare i livelli di espressione del recettore. Il vantaggio della radioetichettatura carbon-11 è che possiamo usare il PET per valutare direttamente la cinetica dei legami di SNAP verso il recettore ormonale che concentra la melanina in tempo reale.SNAP come antagonista del recettore ormonale che concentra la melanina contribuirà a una migliore comprensione di questo recettore e alla sua associazione con condizioni metaboliche come obesità e diabete. I trasportatori Efflux espressi alla barriera ematica-encefalica possono ostacolare significativamente l'uso di radiofarmaci per l'imaging dell'espressione del recettore centrale. Pertanto è importante valutare le tracce in vitro.La radiosintesi automatizzata di SNAP è ampiamente applicabile ai composti radioetichettati a basso peso molecolare con un gruppo metile facilmente valutabile. Una volta stabilita questa procedura può essere adattata per altri composti. A assistere alla dimostrazione saranno i dottorandi senior Sarah Pfaff e Theresa Balber.Per iniziare la sintesi SNAP carbonio-11 impostare un modulo di sintesi automatizzato carbonio-11 pulito con i reagenti e i materiali appropriati. Avviare il processo di sintesi SNAP sul computer del modulo che inizierà con i controlli e il condizionamento del sistema. Circa 30-40 minuti prima che il modulo sia pronto per la consegna del C-11, selezionare il bersaglio di anidride carbonica C-11 sul ciclotrone e avviare la trave a 65 microampere.Una volta che il modulo è pronto per la consegna, chiudere la finestra interna e la porta esterna. Verificare che la trappola di CO2 si sia raffreddata ad almeno 40 gradi Celsius e che la trappola di metano abbia iniziato a raffreddarsi. Una volta che il ciclotrone ha prodotto circa 120 gigabecquerel di CO2 C-11 clicca OK nel software del modulo per aprire il percorso dal bersaglio attraverso la trappola di CO2.Al computer ciclotrone iniziare a fornire CO2 C-11 al modulo. Monitorare il trasferimento di attività sul computer del modulo e assicurarsi che procede alla riduzione della CO2 al metano dopo tre minuti. Monitorare il processo man mano che il metano risultante viene lavato nella trappola di metano e convertito in ioduro di metile per circolazione attraverso il forno di iodio.Al termine della sequenza di conversione attendere che i sottoprodotti siano sciacquati dalla trappola di ioduro di metile per esaurirsi, quindi confermare che il reattore è pronto per ricevere attività facendo clic su OK. Monitorare il sistema man mano che lo ioduro di metile viene rilasciato dalla trappola, lavato attraverso il forno triflate metilico e intrappolato nel reattore. Quando l'attività negli altipiani del reattore conferma che la cattura è completa. Attendere mentre la miscela di reazione reagisce a 75 gradi Celsius per tre minuti.Quindi monitorare il sistema mentre la miscela di reazione viene raffreddata a meno di 35 gradi Celsius e tempra con 1,5 millilitri di acqua. Monitorare il sistema man mano che la miscela di reazione viene caricata nel ciclo di iniezione HPLC e viene iniettata nella colonna HPLC semi-preparatoria. Guarda le tracce dei rivelatori UV e gamma mentre procede la cromatografia.Quando il picco del prodotto inizia ad apparire manualmente inizia a raccogliere il prodotto nel pallone di raccolta inferiore rotondo nel modulo. Termina manualmente la raccolta quando il segnale gamma scende al di sotto di circa 400 conteggi al secondo. Guarda il livello del fluido nel pallone inferiore rotondo mentre il prodotto viene caricato su una cartuccia di estrazione in fase solida sotto pressione di elio.Una volta che il pallone è vuoto e il liquido è passato attraverso la cartuccia SPE, fare clic su OK per iniziare a lavare i prodotti intrappolati sulla cartuccia. Quindi monitorare l'attività nella fiala di raccolta dei prodotti poiché il prodotto viene prima eluito dalla cartuccia nel flaconcino e quindi diluito con soluzione salina allo 0,9%. Guardare come la soluzione del prodotto viene trasferita al flaconcino del prodotto attraverso il filtro sterile sotto pressione di elio.Al termine del trasferimento chiudere la valvola di uscita del prodotto. Quando il radiotracciante arriva nel flaconcino prodotto misurare la resa radioattiva assoluta. Quindi utilizzare una siringa schermata al piombo per trasferire 100 microlitri del tracciante in una piccola fiala per il controllo di qualità.Portare il campione di controllo qualità in un'area di lavoro protetta per il controllo qualità. Redigere 40 microlitri del campione QC in una siringa a tenuta di gas, caricarlo in uno strumento HPLC preparato dotato di una colonna analitica e iniettare il prodotto. Eseguire altre misurazioni del controllo qualità durante l'esecuzione dell'HPLC.Una volta terminata la corsa dell'HPLC, integrare tutti i picchi nel cromatogramma dal rivelatore di radioattività per determinare se la purezza radiochimiche SNAP è maggiore del 95%Integrare i picchi nel cromatogramma UV per determinare la purezza chimica del prodotto. Utilizzare l'area sotto il picco del prodotto UV per calcolare l'attività specifica. Una volta che il prodotto è stato confermato per soddisfare i requisiti per l'uso rilasciare il tracciante radio al laboratorio di esperimento cinetico in tempo reale.Almeno 30 minuti prima dell'esperimento lavare il tipo selvatico preparato o le cellule trasfette con DPBS e aggiungere due millilitri di mezzo di crescita privo di siero. Per bloccare le cellule trasfette aggiungere 0,98 microlitri di una soluzione di 20,4 millimolare di cloridrato racemico verapamil nel solfossido di dimetile. Incubare le cellule su un piano obliquo per 30 minuti.Quindi accendi lo strumento di dosaggio in tempo reale e il computer associato. Aprire il software di controllo e scegliere una destinazione. Impostare il numero di posizioni su due, il tempo di rilevamento su tre secondi, il tempo di ritardo del rilevamento su due secondi e il nome della prima fase sulla linea di base.Inserire il piatto di coltura cellulare nel supporto inclinato del dispositivo con il palo della cella sul lato inferiore. Assicurarsi che il polo cellulare sia coperto da un mezzo di coltura cellulare. Avviare una misurazione in background di 10 minuti e impostare il nome file e il percorso.Impostare la scala dei tempi su minuti e la raccolta del nuclide su carbon-11. Configurare il grafico per visualizzare i dati di destinazione sottratti in background, destinazione e sfondo. Una volta che il tracciante radio è stato consegnato e approvato per l'uso, prendere un piccolo campione per il saggio.Calcolare il volume necessario di soluzione di tracciante radio e preparare una pipetta. Nel software dello strumento mettere in pausa la corsa e attendere che la rotazione del piatto si fermi. Aprire il coperchio del dispositivo, ruotare il supporto di 90 gradi a sinistra, aggiungere il tracciante radio con la pipetta preparata e riportare il dispositivo nella posizione iniziale.Chiudere il coperchio del dispositivo e riprendere immediatamente l'esperimento. Lascia che l'esperimento si esaurisa per 20 minuti prima di terminarlo. Elaborare e analizzare i dati per valutare l'assorbimento snap nelle celle.Ora la procedura può essere ripetuta per il piatto di coltura delle celle di controllo trattato con DMSO e la linea cellulare di tipo selvaggio. I test cinetici in tempo reale sono stati eseguiti con cellule non di tipo PGP che esprimono cellule di tipo selvaggio, cellule che esprimono PGP pre-bloccate con verapamil come inibitore PGP e cellule PGP sbloccate. Non è stata osservata alcuna differenza significativa tra le cellule non trattate e le cellule trattate con veicoli.Carbon-11 SNAP si è rapidamente accumulato in cellule di tipo selvatico mentre non è stato osservato alcun accumulo nelle cellule che esprimono PGP. Il pre-blocco del trasportatore di efflux PGP con verapamil ha comportato un accumulo SNAP nelle cellule PGP paragonabile a quello delle cellule di tipo selvatico. In combinazione con misurazioni cinetiche in tempo reale, questo set-up consente un'ampia comprensione della farmacocinetica dei composti a basso peso molecolare ed è quindi molto importante per lo sviluppo preclinico dei radiofarmaci.La tempistica e l'organizzazione sono gli ingredienti principali per una radiosintesi del carbonio-11 di successo con successivi esperimenti cinetici in tempo reale poiché l'emiglio del carbonio-11 è di soli 20 minuti. A causa di una breve emi breve durata del carbonio-11, molte parti di questa procedura vengono eseguite contemporaneamente. È importante che tutte le parti coinvolte comprendano la portata e la tempistica del loro ruolo.Sia la sicurezza dei prodotti che la radioprotezione sono fondamentali per la preparazione dei radiofarmaci. Tutti gli esperimenti devono seguire il principio più basso ragionevolmente raggiungibile o ALARA per limitare l'esposizione all'operatore alle radiazioni.

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