Aspetto tecnico della sintesi automatizzata e valutazione cinetica in tempo reale di [¹¹C]SNAP-7941

La radioetichettatura Carbon-11 consente di utilizzare piccoli composti per la tomografia ad emissione di positroni o PET senza cambiare la molecola. Questo è essenziale per indagare i livelli di espressione del recettore. Il vantaggio della radioetichettatura carbon-11 è che possiamo usare il PET per valutare direttamente la cinetica dei legami di SNAP verso il recettore ormonale che concentra la melanina in tempo reale.

SNAP come antagonista del recettore ormonale che concentra la melanina contribuirà a una migliore comprensione di questo recettore e alla sua associazione con condizioni metaboliche come obesità e diabete. I trasportatori Efflux espressi alla barriera ematica-encefalica possono ostacolare significativamente l'uso di radiofarmaci per l'imaging dell'espressione del recettore centrale. Pertanto è importante valutare le tracce in vitro.

La radiosintesi automatizzata di SNAP è ampiamente applicabile ai composti radioetichettati a basso peso molecolare con un gruppo metile facilmente valutabile. Una volta stabilita questa procedura può essere adattata per altri composti. A assistere alla dimostrazione saranno i dottorandi senior Sarah Pfaff e Theresa Balber.

Per iniziare la sintesi SNAP carbonio-11 impostare un modulo di sintesi automatizzato carbonio-11 pulito con i reagenti e i materiali appropriati. Avviare il processo di sintesi SNAP sul computer del modulo che inizierà con i controlli e il condizionamento del sistema. Circa 30-40 minuti prima che il modulo sia pronto per la consegna del C-11, selezionare il bersaglio di anidride carbonica C-11 sul ciclotrone e avviare la trave a 65 microampere.

Una volta che il modulo è pronto per la consegna, chiudere la finestra interna e la porta esterna. Verificare che la trappola di CO2 si sia raffreddata ad almeno 40 gradi Celsius e che la trappola di metano abbia iniziato a raffreddarsi. Una volta che il ciclotrone ha prodotto circa 120 gigabecquerel di CO2 C-11 clicca OK nel software del modulo per aprire il percorso dal bersaglio attraverso la trappola di CO2.

Al computer ciclotrone iniziare a fornire CO2 C-11 al modulo. Monitorare il trasferimento di attività sul computer del modulo e assicurarsi che procede alla riduzione della CO2 al metano dopo tre minuti. Monitorare il processo man mano che il metano risultante viene lavato nella trappola di metano e convertito in ioduro di metile per circolazione attraverso il forno di iodio.

Al termine della sequenza di conversione attendere che i sottoprodotti siano sciacquati dalla trappola di ioduro di metile per esaurirsi, quindi confermare che il reattore è pronto per ricevere attività facendo clic su OK. Monitorare il sistema man mano che lo ioduro di metile viene rilasciato dalla trappola, lavato attraverso il forno triflate metilico e intrappolato nel reattore. Quando l'attività negli altipiani del reattore conferma che la cattura è completa. Attendere mentre la miscela di reazione reagisce a 75 gradi Celsius per tre minuti.

Quindi monitorare il sistema mentre la miscela di reazione viene raffreddata a meno di 35 gradi Celsius e tempra con 1,5 millilitri di acqua. Monitorare il sistema man mano che la miscela di reazione viene caricata nel ciclo di iniezione HPLC e viene iniettata nella colonna HPLC semi-preparatoria. Guarda le tracce dei rivelatori UV e gamma mentre procede la cromatografia.

Quando il picco del prodotto inizia ad apparire manualmente inizia a raccogliere il prodotto nel pallone di raccolta inferiore rotondo nel modulo. Termina manualmente la raccolta quando il segnale gamma scende al di sotto di circa 400 conteggi al secondo. Guarda il livello del fluido nel pallone inferiore rotondo mentre il prodotto viene caricato su una cartuccia di estrazione in fase solida sotto pressione di elio.

Una volta che il pallone è vuoto e il liquido è passato attraverso la cartuccia SPE, fare clic su OK per iniziare a lavare i prodotti intrappolati sulla cartuccia. Quindi monitorare l'attività nella fiala di raccolta dei prodotti poiché il prodotto viene prima eluito dalla cartuccia nel flaconcino e quindi diluito con soluzione salina allo 0,9%. Guardare come la soluzione del prodotto viene trasferita al flaconcino del prodotto attraverso il filtro sterile sotto pressione di elio.

Al termine del trasferimento chiudere la valvola di uscita del prodotto. Quando il radiotracciante arriva nel flaconcino prodotto misurare la resa radioattiva assoluta. Quindi utilizzare una siringa schermata al piombo per trasferire 100 microlitri del tracciante in una piccola fiala per il controllo di qualità.

Portare il campione di controllo qualità in un'area di lavoro protetta per il controllo qualità. Redigere 40 microlitri del campione QC in una siringa a tenuta di gas, caricarlo in uno strumento HPLC preparato dotato di una colonna analitica e iniettare il prodotto. Eseguire altre misurazioni del controllo qualità durante l'esecuzione dell'HPLC.

Una volta terminata la corsa dell'HPLC, integrare tutti i picchi nel cromatogramma dal rivelatore di radioattività per determinare se la purezza radiochimiche SNAP è maggiore del 95%Integrare i picchi nel cromatogramma UV per determinare la purezza chimica del prodotto. Utilizzare l'area sotto il picco del prodotto UV per calcolare l'attività specifica. Una volta che il prodotto è stato confermato per soddisfare i requisiti per l'uso rilasciare il tracciante radio al laboratorio di esperimento cinetico in tempo reale.

Almeno 30 minuti prima dell'esperimento lavare il tipo selvatico preparato o le cellule trasfette con DPBS e aggiungere due millilitri di mezzo di crescita privo di siero. Per bloccare le cellule trasfette aggiungere 0,98 microlitri di una soluzione di 20,4 millimolare di cloridrato racemico verapamil nel solfossido di dimetile. Incubare le cellule su un piano obliquo per 30 minuti.

Quindi accendi lo strumento di dosaggio in tempo reale e il computer associato. Aprire il software di controllo e scegliere una destinazione. Impostare il numero di posizioni su due, il tempo di rilevamento su tre secondi, il tempo di ritardo del rilevamento su due secondi e il nome della prima fase sulla linea di base.

Inserire il piatto di coltura cellulare nel supporto inclinato del dispositivo con il palo della cella sul lato inferiore. Assicurarsi che il polo cellulare sia coperto da un mezzo di coltura cellulare. Avviare una misurazione in background di 10 minuti e impostare il nome file e il percorso.

Impostare la scala dei tempi su minuti e la raccolta del nuclide su carbon-11. Configurare il grafico per visualizzare i dati di destinazione sottratti in background, destinazione e sfondo. Una volta che il tracciante radio è stato consegnato e approvato per l'uso, prendere un piccolo campione per il saggio.

Calcolare il volume necessario di soluzione di tracciante radio e preparare una pipetta. Nel software dello strumento mettere in pausa la corsa e attendere che la rotazione del piatto si fermi. Aprire il coperchio del dispositivo, ruotare il supporto di 90 gradi a sinistra, aggiungere il tracciante radio con la pipetta preparata e riportare il dispositivo nella posizione iniziale.

Chiudere il coperchio del dispositivo e riprendere immediatamente l'esperimento. Lascia che l'esperimento si esaurisa per 20 minuti prima di terminarlo. Elaborare e analizzare i dati per valutare l'assorbimento snap nelle celle.

Ora la procedura può essere ripetuta per il piatto di coltura delle celle di controllo trattato con DMSO e la linea cellulare di tipo selvaggio. I test cinetici in tempo reale sono stati eseguiti con cellule non di tipo PGP che esprimono cellule di tipo selvaggio, cellule che esprimono PGP pre-bloccate con verapamil come inibitore PGP e cellule PGP sbloccate. Non è stata osservata alcuna differenza significativa tra le cellule non trattate e le cellule trattate con veicoli.

Carbon-11 SNAP si è rapidamente accumulato in cellule di tipo selvatico mentre non è stato osservato alcun accumulo nelle cellule che esprimono PGP. Il pre-blocco del trasportatore di efflux PGP con verapamil ha comportato un accumulo SNAP nelle cellule PGP paragonabile a quello delle cellule di tipo selvatico. In combinazione con misurazioni cinetiche in tempo reale, questo set-up consente un'ampia comprensione della farmacocinetica dei composti a basso peso molecolare ed è quindi molto importante per lo sviluppo preclinico dei radiofarmaci.

La tempistica e l'organizzazione sono gli ingredienti principali per una radiosintesi del carbonio-11 di successo con successivi esperimenti cinetici in tempo reale poiché l'emiglio del carbonio-11 è di soli 20 minuti. A causa di una breve emi breve durata del carbonio-11, molte parti di questa procedura vengono eseguite contemporaneamente. È importante che tutte le parti coinvolte comprendano la portata e la tempistica del loro ruolo.

Sia la sicurezza dei prodotti che la radioprotezione sono fondamentali per la preparazione dei radiofarmaci. Tutti gli esperimenti devono seguire il principio più basso ragionevolmente raggiungibile o ALARA per limitare l'esposizione all'operatore alle radiazioni.