Isolamento, cultura, caratterizzazione e differenziazione delle cellule del progenitore muscolare umano dalla procedura di biopsia muscolare scheletrica
23 agosto 2019
Presentiamo tecniche per isolare, coltivare, caratterizzare e differenziare le cellule progenitrici muscolari primarie umane (hMMP) ottenute dal tessuto della biopsia muscolare scheletrica. Gli hMPC ottenuti e caratterizzati attraverso questi metodi possono essere utilizzati per affrontare successivamente le domande di ricerca relative alla miogenesi umana e alla rigenerazione muscolare scheletrica.
Isolare le cellule progenitrici muscolari umane che regolano la rigenerazione muscolare scheletrica ci consente di indagare processi che sono alla base del processo rigenerativo pur mantenendo la variabilità del donatore. Questa tecnica consente di ottenere grandi rese di cellule progenitrici muscolari umane da piccole quantità di tessuto e la loro analisi fenotipico utilizzando un piccolo numero di cellule. Questo metodo è specificamente progettato per isolare le cellule progenitrici muscolari umane per tracciare le loro capacità di proliferazione e differenziazione e per correlare questi dati al processo rigenerativo muscolare scheletrico.
L'aspetto più difficile di questa tecnica abbastanza semplice è garantire che ogni passaggio sia eseguito in modo riproducibile per ottimizzare la resa e la purezza delle cellule. È necessario completare più passaggi per un corretta isolamento delle celle. Molti dei passaggi sono più facili da capire se vengono osservati visivamente.
Per isolare le cellule progenitrici muscolari umane dal tessuto della biopsia, posizionare il tessuto muscolare in una piastra di Petri sterile in condizioni sterili e utilizzare un bisturi sterile per tritare il tessuto in pezzi a cubetti di un millimetro. Quando tutto il tessuto è stato tritato, trasferire i pezzi in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di PBS e lasciare che i tessuti si sistemino per gravità prima di aspirare attentamente il supernatante senza disturbare il tessuto. Dopo aver lavato i frammenti una seconda volta come appena dimostrato, sostituire il PBS con 10 millilitri di mezzo Eagle modificato di Dulbecco a basso glucosio.
Rimuovere il supernatante dopo che i tessuti sono stati sistemati e rimescolare i pezzi in tre millilitri di mezzo di digestione. Posizionare i tessuti a 37 gradi Celsius per 30 minuti, con triturazione dei frammenti muscolari ogni 10 minuti con una pipetta sierologica da un millilitro. Al termine dell'incubazione, aggiungere 83 microlitri di mezzo di digestione aggiuntivo e 24 microlitri di soluzione di dispasi ai campioni e triturare i tessuti ogni cinque-10 minuti con una punta di pipetta a foro largo fino a ottenere un liquame uniforme.
Un liquame uniforme è importante per il massimo recupero delle cellule progenitrici muscolari umane. Continuare la digestione se il liquame non passa attraverso una punta standard di pipetta da 1.000 microliter. Per isolare le cellule positive di Pax7, macchiare e gateare le cellule secondo il protocollo.
Ordinare le cellule progenitrici muscolari umane doppie positive CD56, CD29 su un citometro a flusso con un ugello da 100 micrometri a una pressione di 20 libbre per pollice quadrato in tubi di raccolta contenenti un cuscino da 300 microliter di tampone di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza. Quindi seminare le cellule progenitrici muscolari umane ordinate in piastre di 24 po 'rivestite di collagene contenenti mezzo di crescita pre-riscaldato a una concentrazione quadrata 3,5 per 10 alla quarta parte per centimetro. Per eseguire scansioni di confluenza, caricare la piastra su un citometro di imaging e selezionare Crea nuova scansione e categoria piastra, profilo piastra e ID piastra.In Applicazione selezionare Confluenza e Confluenza 1 e selezionare un pozzo da visualizzare.
Individuare un piano di messa a fuoco in cui le celle appaiono bianche rispetto allo sfondo e selezionare Registra manuale. Utilizzare il mouse per evidenziare tutti i pozzali da analizzare e selezionare Avvia analisi. L'intera area del pozzo verrà scansionata automaticamente.
Selezionate le impostazioni di analisi ottimali per il tipo di piastra e cella e selezionate Avvia analisi (Start Analysis). Utilizzare il citometro di imaging per misurare inizialmente la confluenza. Quindi, per contare le cellule sul citometro di imaging, sostituire il mezzo in ogni pozzo con 200 microlitri di soluzione di colorazione.
Dopo 15 minuti a 37 gradi Celsius, sostituire la soluzione di colorazione con 100 microlitri di F12 di prosciutto fresco. Riportare la piastra al citometro di imaging e in Applicazione selezionare Vitalità cella e Totale morto vivo. Il canale Live sarà un'immagine a campo luminoso, il canale Dead mostrerà la colorazione del propidio ioduro e il canale Totale sarà la colorazione Hoechst 33342.
In Configurazione messa a fuoco fare clic su Registra automaticamente. Sotto il canale Totale, impostare il canale su blu. Utilizzate Trova messa a fuoco (Find Focus) per mettere a fuoco i nuclei e fate clic su Imposta offset (Set Offset) per selezionare lo stato attivo.
Sotto il canale Morto, imposta il canale su rosso e usa Trova messa a fuoco per mettere a fuoco le celle morte. Fate clic su Imposta offset (Set Offset) per selezionare lo stato attivo e selezionate Avvia analisi (Start Scan) per avviare l'analisi. Selezionare quindi i parametri di analisi appropriati per il tipo di piastra e cella e selezionare Avvia analisi per avviare l'analisi.
Al termine dell'analisi, verificare visivamente che l'analisi conterà in modo appropriato le celle. Se la scansione e l'analisi sono soddisfacenti, restituire la piastra all'incubatore, altrimenti riscansare o modificare i parametri di analisi. Le cellule progenitrici muscolari umane possono essere identificate da primi eventi di gating basati sull'area di dispersione laterale e anteriore per eliminare cellule morte o detriti, seguiti selezionando solo le cellule che sono negative per 7-AAD e quindi sono vitali.
Le cellule positive sia per i marcatori di superficie cellulare CD56 che CD29 rappresentano quindi la popolazione cellulare progenitrice muscolare umana. Le cellule progenitrici muscolari umane possono anche essere identificate dalla loro espressione Pax7. In effetti, Pax7 è arricchito nella popolazione totale dopo facs e viene mantenuto attraverso più passaggi.
Qui viene mostrata una scansione di confluenza rappresentativa. I contorni verdi sono stati generati dal citometro di imaging e mostrano come il citometro di imaging ha determinato la confluenza in base alle impostazioni di analisi selezionate. Un'eterogeneità e un conteggio dei nuclei è comune tra i donatori.
Scoprire e caratterizzare accuratamente questa eterogeneità è un'applicazione chiave del citometro di imaging. Le misurazioni della confluenza e il conteggio dei nuclei da donatori unici, tuttavia, sono altamente correlati. Le cellule progenitrici muscolari umane differenziate per formare miotubi possono essere distinte per la loro espressione della catena pesante della miosina embrionale.
È importante essere coerenti quando si selezionano i parametri di gating sul citometro di flusso al fine di isolare la stessa popolazione di cellule da ogni donatore. Una volta isolate, le cellule progenitrici muscolari umane possono essere utilizzate per molteplici scopi, tra cui l'identificazione dei requisiti metabolici unici di proliferazione e differenziazione delle cellule progenitrici muscolari umane. L'isolamento delle cellule progenitrici muscolari umane ha permesso la discriminazione delle differenze nell'espressione del marcatore della superficie cellulare sulle cellule progenitrici muscolari umane e del topo.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo presenta tecniche per isolare e caratterizzare cellule progenitrici muscolari primarie umane (hMPCs) da tessuto di biopsia muscolare scheletrica. Questi metodi permettono ai ricercatori di studiare la miogenesi umana e la rigenerazione del muscolo scheletrico.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Medicina rigenerativa
Sfondo
- Le cellule progenitrici muscolari umane svolgono un ruolo cruciale nella rigenerazione del muscolo scheletrico.
- L'isolamento di queste cellule permette lo studio dei processi rigenerativi tenendo conto della variabilità tra i donatori.
- Le tecniche di isolamento cellulare devono essere riproducibili per garantire resa e purezza ottimali.
- L'osservazione visiva delle fasi di isolamento può migliorare la comprensione.
Scopo dello studio
- Isolare cellule progenitrici muscolari umane per la ricerca sulla rigenerazione muscolare.
- Analizzare le capacità di proliferazione e differenziazione di queste cellule.
- Correlare i risultati ottenuti con il processo complessivo di rigenerazione del muscolo scheletrico.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di hMPC da tessuto di biopsia muscolare scheletrico.
- Caratterizzazione delle cellule isolate.
- Analisi fenotipica mediante l'uso di piccole quantità di cellule.
- Monitoraggio delle capacità di proliferazione e differenziazione.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di hMPC da campioni tissutali minimi.
- La caratterizzazione delle cellule dimostra il loro potenziale per applicazioni nella ricerca.
- La riproducibilità del metodo garantisce risultati affidabili.
- Sono acquisite nuove conoscenze sul processo rigenerativo del muscolo scheletrico.
Conclusioni
- Le tecniche presentate sono efficaci per l'isolamento e lo studio degli hMPC.
- Questi metodi possono migliorare la comprensione della rigenerazione muscolare.
- La ricerca futura può basarsi su questi risultati per esplorare applicazioni terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
L'isolamento e la caratterizzazione di cellule progenitrici muscolari umane (hMPCs) da biopsie del muscolo scheletrico permettono una riduzione del rischio meccanicistica nella validazione di bersagli per la rigenerazione muscolare. Questo approccio supporta lo screening fenotipico e lo sviluppo di saggi fornendo un sistema rilevante per la malattia, con eterogeneità del donatore che riflette la variabilità clinica. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nei modelli preclinici collegando la capacità di espansione cellulare agli esiti rigenerativi del muscolo scheletrico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative ai percorsi di rigenerazione del tessuto muscolare scheletrico.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante la validazione funzionale della proliferazione e differenziazione delle hMPC.
- Valore scientifico: Favorisce la conferma dell'obiettivo correlando i fenotipi cellulari ai processi rigenerativi.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce un sistema standardizzato e riproducibile per la preparazione di campioni biologici validati destinati a screening successivi.
- Valore operativo: Consente misurazioni quantitative della confluenza e del conteggio dei nuclei mediante citometria ad imaging per la standardizzazione del saggio.
- Valore scientifico: Supporta la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma attraverso protocolli di isolamento e di semina costanti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Offre un sistema rilevante per la patologia per studiare la variabilità della capacità espansiva tra diversi donatori, fornendo informazioni per l'allineamento di biomarcatori traslazionali.
- Valore operativo: Garantisce la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica mantenendo l'espressione di Pax7 e il potenziale di differenziazione in miotubi.
- Valore scientifico: Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio identificando i meccanismi alla base dell'eterogeneità del potenziale rigenerativo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione fino alla valutazione preclinica, fornendo fenotipi cellulari quantificabili e stratificati per donatore.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante il monitoraggio della proliferazione e della differenziazione di hMPC isolate.
- Screening: Garantisce prontezza del saggio e riproducibilità grazie a una digestione tessutale standardizzata, un sorting FACS e una piastatura su collagene.
- Analisi: Produce scansioni quantitative della confluenza e conteggi dei nuclei che permettono il confronto tra donatori e la valutazione delle condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica mantenendo la capacità di differenziazione miogenica e l'espressione della catena pesante della miosina embrionale nei miotubi formati.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro di isolamento e caratterizzazione riutilizzabile su diversi campioni di donatori e condizioni sperimentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi attraverso l'associazione tra espansione cellulare e capacità rigenerativa.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità nel rendimento e nella purezza cellulare grazie a passaggi ottimizzati di digestione e selezione.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione progettuale mediante la valutazione stratificata per donatore della funzionalità delle cellule progenitrici muscolari.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione basata sul rischio degli obiettivi di rigenerazione mediante metriche di capacità espansiva informate dall'eterogeneità.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di tessuti primari, nella citometria a flusso e nella citometria con imaging per l'isolamento e l'analisi di cellule vitali.
- È dipendente da infrastrutture sterili per la coltura dei tessuti, da apparecchiature per la separazione cellulare attivata da fluorescenza e da piattaforme automatizzate per l'imaging.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di gating per CD56/CD29 e Pax7 per garantire un'identificazione coerente degli hMPC tra diversi donatori.
- Richiede considerazioni adattative relative alla qualità variabile del tessuto del donatore e alle dimensioni della biopsia, al fine di mantenere l'efficienza di isolamento.
- Le limitazioni pratiche includono la variabilità dipendente dal donatore in termini di resa cellulare e cinetiche di espansione, richiedendo campioni di dimensioni maggiori per ottenere potenza statistica.
