Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia
5 settembre 2019
Descriviamo un metodo per l'utilizzo di citometria a flusso multiparametrico per rilevare le specie di ossigeno reattivo mitocondriale (ROS) in cellule staminali e progenitrici (HSPC) e cellule leucemiche da un modello murino di leucemia mieloide acuta (AML) MLL-AF9.
Le specie reattive dell'ossigeno o ROS, sono specie di ossigeno altamente reattive prodotte dalle cellule e influenzano il loro comportamento. Sebbene l'eccesso di ROS possa anche causare un diffuso caos cellulare e, nei casi più gravi, la morte cellulare. Pertanto, il mantenimento dell'omeostasi del ROS è di fondamentale importanza per la funzione cellulare e la sopravvivenza.
Il protocollo qui presentato, si concentra sulla misurazione di un tipo specifico di ROS, che è generato dai mitocondri, principalmente come prodotto metabolico nelle popolazioni di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche vive, normali o sane, nonché nelle cellule leucemie del modello di topo del cancro del sangue, leucemia mieloide acuta o AML. Questo protocollo può anche essere utilizzato per valutare come la manipolazione genetica, come la delezione genica o la sovraespressione, abbia un impatto sul ROS mitocondriale in diverse popolazioni ematopoietiche sane e maligne. E di conseguenza, potenzialmente fornire informazioni perspicaci sullo stato redux e possibilmente sul metabolismo delle cellule.
Questa tecnica autorizza l'analisi metrica del sistema di flusso di una sonda protogenica per monitorare la produzione di ROS mitocondriale in fusto ematopoietico vivo sano e maligno e sottopopolazione progenitrice. Questo protocollo è semplice e può essere completato in poche ore. Inoltre, è adatto per l'analisi delle cellule vive e consente di distinguere e analizzare il ROS mitocondriale nella popolazione di cellule staminali nel midollo osseo, utilizzando il segno superficiale di colorazione.
Dopo aver raccolto cellule di midollo osseo mononucleare da topi stretti selvatici e topi leucemici MLL-AF9, secondo il manoscritto, aliquota 200 microlitri della sospensione cellulare in ciascuno dei nove singoli tubi di controllo del colore. Aliquote le celle rimanenti in altri tubi sperimentali, 200 microlitri ciascuno. Quindi mettere in una centrifuga due tubi sperimentali contenenti rispettivamente cellule di midollo osseo e cellule leucemiche e un tubo di controllo.
Centrifuga a 300 volte G per cinque minuti. Successivamente, decantare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in F-PBS a temperatura ambiente con una macchia di cellule vive / morte, secondo le istruzioni del produttore. Incubare sul ghiaccio per 30 minuti.
Successivamente, aggiungere 1 millilitro di F-PBS a temperatura ambiente ai tre tubi macchiati vivi / morti e un singolo tubo di controllo del colore per la colorazione del colorante ROS mitocondriale. Posizionare i tubi nella centrifuga a 300 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, ottenere una soluzione di colorante ROS mitocondriale da 5 millimolare sospendendo 50 microgrammi di colorante ROS mitocondriale in 13 microlitri di DMSO.
Quindi aggiungere 13 millilitri di F-PBS a temperatura ambiente al colorante ROS mitocondriale da 13 microlitri per diluire a una concentrazione finale di cinque micromolari. Se necessario, aggiungere 13 microlitri di Verapamil da 50 millimolari alla soluzione per inibire le pompe efflux mitocondriali. Ottenere i tubi dalla centrifuga e aspirare dal lavaggio della macchia di cellule vive / morte.
Aggiungere 200 microlitri di F-PBS nel controllo della colorazione vivo/morto e tenerlo nel ghiaccio fino a quando non è pronto per iniziare l'analisi. Aggiungere 200 microlitri della macchia colorante ROS mitocondriale contenente Verapamil, ad ogni tubo sperimentale, così come il tubo di controllo della colorazione ROS mitocondriale. Vortice da mescolare e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius al buio.
Quindi aggiungere 1 millilitro di F-PBS a temperatura ambiente ai tubi di controllo e sperimentali. Centrifugare cinque minuti a 300 volte G a temperatura ambiente. Aspirare il supernato e lavare le cellule con un millilitro aggiuntivo di F-PBS a temperatura ambiente.
Centrifugare di nuovo per cinque minuti a 300 volte G, a temperatura ambiente. In primo luogo, preparare due cocktail anticorpali per cellule del midollo osseo sane e leucemie. Aspirare il supernatante dal tubo sperimentale contenente cellule sane del midollo osseo e aggiungere al tubo 200 microlitri del cocktail anticorpale numero uno.
Vortice da mescolare. Preparare anche i singoli tubi di controllo del colore aggiungendo 200 microlitri di F-PBS e un microlitro dell'anticorpo corrispondente. Incubare per 60 minuti sul ghiaccio al buio.
Aspirare il supernatante dal tubo sperimentale contenente midollo osseo di leucemia e aggiungere 200 microlitri del cocktail anticorpale numero due, al tubo. Vortice da mescolare. Incubare per 60 minuti sul ghiaccio al buio.
Successivamente, lavare tutti i tubi con 1 millilitro di F-PBS freddo e centrifugare per cinque minuti a 300 volte G a temperatura ambiente. Sospendere di nuovo le celle in 500 microlitri di F-PBS freddo. Trasferire la sospensione cellulare in ogni tubo citometrico di flusso con un filtro da 40 micrometri per escludere gli aggregati.
In primo luogo, inserire un tubo di controllo senza macchie nella macchina citometrica di flusso e avviare l'acquisizione per compensare la macchina citometrica a flusso. Ripetere per altri tubi di controllo. Successivamente, leggi i tubi sperimentali per allevare i cancelli.
Per analizzare le dimensioni e la complessità della popolazione cellulare, prima per hspc sano, impostare l'area di dispersione in avanti e l'area di dispersione laterale traccia le popolazioni. Premere il pulsante Porta quadrata, per rimuovere i detriti estranei dal grafico a dispersione anteriore e laterale. Quindi, su un'area di dispersione in avanti e un grafico di altezza, usa un doppio discriminatore per cancello i farsetto.
Selezionare le celle vive, le cellule basse di lignaggio e i vari HSPC integri. Per ogni popolazione di interesse, analizzare l'intensità di fluorescenza mediana del canale TRPE in un grafico istagramma, per valutare le differenze nel segnale ROS mitocondriale. Ripetere la stessa procedura di analisi delle dimensioni, gating e tracciazione dell'istogramma per le popolazioni di leucemia.
Le cellule del midollo osseo isolate da topi sani sono state macchiate con un colorante vivo /morto e un colorante ROS mitocondriale, e successivamente macchiate di anticorpi che riconoscono marcatori di lignaggio:più CD48, C-kit, Sca-1, CD34 e CD150. Inoltre, anche le cellule del midollo osseo dei topi leucemia sono state macchiate con CD45.2 per discriminare tra le cellule di leucemia MLL-AF9 da cellule sane del midollo osseo ricevente macchiate con CD45.1. Un confronto della colorazione ROS mitocondriale, tra LSK negativo CD48 sano e progenitori mieloidi, mostra che i progenitori mieloidi mostrano livelli significativamente più alti di colorazione ROS mitocondriale.
Inoltre, i progenitori ad alta leucemia c-Kit mostrano livelli significativamente più elevati di colorazione ROS mitocondriale, rispetto alle cellule intermedie a bassa leucemia c-Kit, all'LSK negativo CD48 sano e ai progenitori mieloidi. Le cellule intermedie a bassa leucemia del C-Kit, mostrava anche un valore significativamente più alto rispetto alle cellule LSK negative CD48, ma non ai progenitori mieloidi. I coloranti ROS mitocondriali sono altamente reattivi e sono necessarie misure di lavaggio appropriate per garantire che qualsiasi eccesso di colorante sia stato rimosso prima di iniziare i seguenti passaggi.
Ci sono diversi coloranti fluorogenici ROS chimicamente distinti che possono essere utilizzati in questo protocollo, per ottenere un po 'di conoscenza dello stato redux nelle cellule ematopoietiche vive. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata in letteratura, e può fornire utili intuizioni sulle vie metaboliche e di segnalazione che sono regolate in modo differenziato nelle cellule di leucemia, se confrontate con le loro controparti normali.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per la rilevazione delle specie reattive dell'ossigeno mitocondriali (ROS) nelle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche di topo (HSPCs) e nelle cellule leucemiche. L'attenzione è rivolta al ruolo delle ROS nella funzione cellulare e nella sopravvivenza, in particolare nel contesto della leucemia mieloide acuta (AML).
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Oncologia
Sfondo
- Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono prodotte dalle cellule e influenzano il loro comportamento.
- L'eccesso di ROS può provocare danni cellulari e morte cellulare.
- Il mantenimento dell'omeostasi dei ROS è fondamentale per la funzione cellulare.
- Lo studio si concentra sui ROS mitocondriali generati nelle popolazioni ematopoietiche.
Scopo dello studio
- Misurare le ROS mitocondriali in cellule sane e leucemiche.
- Valutare l'impatto della manipolazione genetica sui livelli di ROS mitocondriali.
- Fornire informazioni sullo stato redox e sul metabolismo cellulare.
Metodi Utilizzati
- Citometria a flusso multiparametrica per la rilevazione di ROS.
- Analisi di cellule staminali ematopoietiche sane di origine murina e cellule leucemiche.
- Valutazione degli effetti della manipolazione genetica sui ROS.
- Utilizzo di un modello murino di leucemia mieloide acuta (AML).
Risultati principali
- Rilevamento con successo delle ROS mitocondriali sia in cellule sane che in cellule leucemiche.
- Informazioni sugli effetti delle alterazioni genetiche sui livelli di ROS.
- Comprensione del ruolo delle ROS nel metabolismo cellulare.
- Possibili implicazioni per strategie terapeutiche nella LMA.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un modo affidabile per studiare le ROS mitocondriali.
- I risultati potrebbero orientare future ricerche sul metabolismo cellulare nella leucemia.
- Comprendere la dinamica delle ROS può portare a approcci terapeutici migliori.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il monitoraggio delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) nei mitocondri delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche fornisce un'indicazione quantitativa dello stato redox cellulare e dell'attività metabolica, parametri fondamentali nella validazione precoce dei bersagli e nella riduzione del rischio meccanicistico nelle neoplasie ematologiche. Questo approccio citofluorimetrico consente di discriminare i livelli di ROS tra diverse sottopopolazioni sane e maligne, supportando la verifica di ipotesi e la chiarificazione dei percorsi molecolari nei flussi di scoperta preclinica. La compatibilità del metodo con l'analisi di cellule vive e il breve tempo di analisi facilitano l'integrazione nelle linee di screening e nello sviluppo di saggi per l'identificazione di composti promettenti e la costruzione di previsioni affidabili.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'interrogazione di ipotesi terapeutiche quantificando le ROS mitocondriali come parametro funzionale del riprogrammamento metabolico nelle cellule staminali e progenitrici della leucemia.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico attraverso il confronto diretto della segnalazione delle ROS tra le cellule progenitrici ematopoietiche sane (HSPCs) e quelle leucemiche indotte da MLL-AF9, chiarificando le alterazioni metaboliche associate alla malattia.
- Valore predittivo: Produce misurazioni quantitative delle ROS mitocondriali che informano sul livello di fiducia nei bersagli e sul triage del portafoglio, collegando lo stato redox ai percorsi di fitness e sopravvivenza delle cellule leucemiche.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Produce letture standardizzate e riproducibili delle ROS mitocondriali mediante citometria a flusso, consentendo uno screening affidabile di composti modulatori della funzione mitocondriale in cellule ematopoietiche.
- Output quantitativo: Fornisce dati di intensità mediana della fluorescenza ottenuti da istogrammi del canale TRPE, offrendo una metrica scalabile per l'analisi dose-risposta e la validazione di composti attivi in campagne di scoperta di farmaci.
- Riutilizzo della piattaforma: Stabilisce un flusso di lavoro citometrico riutilizzabile per la valutazione dello stress ossidativo mitocondriale in diversi modelli preclinici, favorendo la coerenza tra progetti negli saggi meccanicistici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Cattura l'abbondanza differenziale di ROS mitocondriali tra sottoinsiemi sani di CPH e progenitori leucemici, stabilendo un sistema allineato a biomarcatori per lo studio della patogenesi della LMA.
- Continuità traslazionale: Collega le scoperte iniziali sui profili metabolici alla validazione preclinica, permettendo il monitoraggio longitudinale della dinamica dei ROS in risposta a perturbazioni genetiche o farmacologiche.
- Avanzamento basato sul rischio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione identificando vulnerabilità dipendenti dai ROS nelle cellule staminali leucemiche, riducendo l'incertezza meccanicistica prima degli studi di efficacia in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto attivo fino alla validazione preclinica, in particolare per progetti focalizzati sulla riprogrammazione metabolica nei tumori ematologici. Consente una riduzione precoce dei rischi biologici fornendo letture funzionali che integrano i dati ottenuti da schermature genetiche e fenotipiche.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi misurando lo stress ossidativo mitocondriale come effetto a valle della segnalazione oncogenica nei modelli di leucemia indotta da MLL-AF9.
- Screening: Fornisce misurazioni quantitative pronte per il test che supportano la valutazione dei composti e la modellizzazione delle relazioni struttura-attività negli screening di modulatori metabolici.
- Analisi: Genera output di intensità mediana di fluorescenza basati su istogrammi che permettono il confronto statistico dei livelli di ROS tra diverse condizioni sperimentali e contesti genetici.
- Ricerca traslazionale: Collega i fenotipi metabolici osservati in vitro a modelli preclinici di malattia attraverso la rilevazione costante dello stress ossidativo mitocondriale in cellule leucemiche primarie di topo.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma standardizzata e modulare applicabile a diversi bersagli ematopoietici e modelli di malattia, riducendo lo sviluppo ridondante di saggi in diverse aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva collegando la produzione di ROS mitocondriali all'identità delle cellule staminali leucemiche e al loro stato metabolico, riducendo l'ambiguità riguardo al meccanismo d'azione del bersaglio.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso procedure standardizzate di colorazione, lavaggio e selezione tramite gating, permettendo il confronto dei dati tra laboratori in progetti multicentrici.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo la rilevazione precoce di sottopopolazioni leucemiche metabolicamente attive, orientando la priorità verso bersagli con elevato potenziale di indice terapeutico.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce un avanzamento adeguato al rischio fornendo biomarcatori meccanicistici correlati alla vitalità delle cellule staminali leucemiche, potenziando il processo decisionale nell'ottimizzazione dei composti candidati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella compensazione della citometria a flusso, nella colorazione di cellule vive e nei pannelli di marcatori di superficie per cellule ematopoietiche per una corretta discriminazione dei sottogruppi.
- Dipende dall'accesso a citometri a flusso dotati di laser e filtri appropriati per rilevare coloranti fluorogeni per lo stress ossidativo mitocondriale (ad esempio, canale TRPE).
- Necessita della standardizzazione della concentrazione del colorante, del tempo di incubazione e dei passaggi di lavaggio tra i diversi gruppi di lavoro per ridurre al minimo la variabilità nel rilevamento del segnale di ROS.
- Deve tenere conto della reattività del colorante e dell'attività delle pompe di efflusso, con l'eventuale utilizzo di inibitori come il Verapamil per garantire un rilevamento specifico del segnale mitocondriale.
- Limitato alla quantificazione relativa di ROS; per determinare concentrazioni assolute è necessaria una calibrazione mediante metodi ortogonali, aspetto da considerare nell'interpretazione di dati comparativi tra studi diversi.
