Name: Utilizzo di CRISPR/Cas9 per eliminare GM-CSF nelle celle CAR-T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Impara a modificare geneticamente le cellule CAR-T con CRISPR/Cas9 durante la produzione per ottenere terapie più efficaci e meno tossiche. Questo protocollo combina ingegneria genetica e immunoterapia.

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Questo lavoro è stato sostenuto attraverso sovvenzioni da K12CA090628 (SSK), la National Comprehensive Cancer Network (SSK), il Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), la Predolin Foundation (SSK), l'Ufficio Mayo Clinic of Translation to Practice (SSK) e il programma di formazione Per studenti della Mayo Clinic Medical Scientist Robert L. Howell Medical-Scientist Scholarship (RMS).

Questo protocollo segue le linee guida dell'Institutional Review Board (IRB) di Mayo Clinic e del Institutional Biosafety Committee (IBC).
1. Produzione di cellule CART19
<ol><li>Isolamento, stimolazione e cultura delle cellule T<ol>
<li>Eseguire tutto il lavoro di coltura cellulare in una cappa di coltura cellulare utilizzando attrezzature di protezione personale appropriate. Raccogliere le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) da coni di sangue normali donatori de-identificati raccolti durante l'apheresi in quanto sono noti per essere una fonte vitale di PBMC.
</li>
		<li>Per isolare i PBMC, aggiungere 15 mL di un mezzo di sfumatura di densità a un tubo di separazione del gradiente di densità di 50 mL. Diluire il sangue del donatore con un volume uguale di salina tampone di fosfato (PBS) contenente il 2% di siero bovino fetale (FBS) per evitare l'intrappolamento cellulare.<ol>
<li>Aggiungere il sangue disluito del donatore dal cono nel tubo di separazione, facendo attenzione a non disturbare l'interfaccia tra il sangue e il gradiente di densità medio. Centrifuga a 1.200 x g per 10 min a RT.</li>
			<li>Decant il supernatante in un nuovo conico da 50 mL, lava con PBS - 2% FBS portando fino a 40 mL, centrifuga a 300 x g per 8 min a RT, aspirato supernatante, resospensione in 40 mL di tampone, e contare le cellule.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Isolare le cellule T dai PBMCt tramite un kit di perline magnetico a selezione negativa utilizzando un separatore di celle completamente automatizzato in base al protocollo del produttore.</li>
		<li>Per colturare le cellule T isolate, preparare il mezzo di cellule T (TCM) che consiste di 10% siero umano AB (v/v), 1% penicillina-streptomia-glutamina (v/v), e mezzo di cellule ematopoietiche senza siero. Sterilizzare il mezzo filtrando attraverso un filtro a vuoto sterile da 0,45 m e quindi con un filtro a vuoto sterile da 0,22 m.</li>
		<li>Il giorno 0 (il giorno della stimolazione delle cellule T), lavare le perle CD3/CD28 prima della stimolazione delle cellule T. Per lavare, posizionare il volume richiesto di perline (utilizzare abbastanza perline CD3/CD28 per un rapporto di 3:1 perline:cellule T; notare la concentrazione di perline può essere variabile) in un tubo sterile di microcentrifuga da 1,5 mL e risospensione in 1 mL di TCM.</li>
		<li>Mettere a contatto con un magnete.</li>
		<li>Dopo 1 min, aspirare la TCM e risospendere in 1 mL di MCM fresco per lavare le perline.</li>
		<li>Ripetere questa procedura per un totale di tre fumi.</li>
		<li>Dopo il terzo lavaggio, risospendere le perline in 1 mL di TCM.</li>
		<li>Contare le cellule T.</li>
		<li>Trasferire perline alle cellule T ad un rapporto di 3:1 perline:cellule.</li>
		<li>Diluire le cellule a una concentrazione finale di 1 x 106 cellule / mL.</li>
		<li>Incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2 per 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Trafezione e trasduzione delle cellule T<ol>
<li>Svolgere il lavoro lentivirale utilizzando le precauzioni BSL-2, tra cui cappe per la coltura cellulare, dispositivi di protezione personale e disinfezione dei materiali usati con candeggina prima dello smaltimento.</li>
		<li>Acquisire un costrutto CART19 in un vettore lentivirale. NOTA: Il costrutto CART19 utilizzato qui è stato progettato e poi sintetizzato de novo utilizzando un fornitore di sintesi proteica disponibile in commercio. Il costrutto CAR è stato successivamente clonato in una lentivirus di terza generazione sotto il controllo di un promotore di EF-1. Il frammento di regione variabile a catena singola è derivato dal clone di FMC63 e riconosce il CD19 umano. Il costrutto CAR19 possiede un dominio costimulatorio di seconda generazione 4-1BB e una stimolazione CD3 (FMC63-41BBz). 12 mila
</li>
		<li>Eseguire la produzione di lentivirale come descritto in precedenza. 12 mila<ol>
<li>In breve, per produrre lentivirus, utilizzare 293T cellule che hanno raggiunto 70-90% confluenza.</li>
			<li>Lasciare l'incubazione per 30 min a temperatura ambiente di reagenti di trasfezione, tra cui 15 g di plasmide lentivirali di interesse, 18 g di un vettore di imballaggio gag/pol/tat/rev, 7 g di un vettore di inviluppo VSV-G, 111 -L del reagente pre-complesso, 129 reagente di trasfezione, e 9,0 mL del mezzo di trasfezione prima di aggiungere alle cellule 293T. Poi colture le cellule trafette a 37 gradi centigradi, 5% DI CO2.</li>
			<li>Raccolta, centrifuga (900 x g per 10 min), filtro (filtro in nylon 0,45 M) e concentrazione di supernatante a 24 e 48 h per ultracentrifugato a 13.028 x g per 18 h o 112.700 x g per 2 h.</li>
			<li>Congelare a -80 gradi centigradi per un uso futuro.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Il primo giorno, risospendere delicatamente le cellule T per rompere le rosette delle cellule T che erano state stimolate a 1 x 106/ mL il giorno 0.</li>
		<li>Secondo le opportune precauzioni BSL-2 per tutto il lavoro lentivirale, aggiungere il virus raccolto fresco o congelato alle cellule T stimolate ad una molteplicità di infezione (MOI) di 3.0.</li>
	</ol></li>
	<li>Espansione delle cellule CAR-T<ol>
<li>Durante la fase di espansione, continuare a incubare le cellule T trasdotte a 37 , 5% CO2. Contare le cellule CAR-T nei giorni 3 e 5 e aggiungere una MTC fresca e preriscaldata alla coltura per mantenere una concentrazione di cellule CAR-T di 1 x 106/mL.</li>
		<li>Rimuovere le perle dalle cellule T trasdotte 6 giorni dopo la stimolazione (Giorno 6) utilizzando un magnete. Raccogliere, risospendere e mettere le cellule T in tubi conici da 50 mL in un magnete per 1 min. Poi raccogliere il supernatante (contiene le cellule CAR-T), e scartare le perline.</li>
		<li>Riposizionare le cellule CAR-T raccolte in coltura a una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL per riprendere l'espansione.</li>
		<li>Il giorno 6, valutare l'espressione superficiale della CAR per citometria di flusso. NOTA: Diversi metodi possono essere utilizzati per rilevare l'espressione superficiale di CAR, come la colorazione con un anticorpo secondario incrociato IgG (H-L) di capra o colorando con un peptide specifico CD19, coniugato ad un fluorocro. Qui, prendere una aliquota (circa 100.000 cellule T) dalla coltura e lavare con flusso buffer preparato con salina tampone di fosfato di Dulbecco, siero bovino fetale 2% e 1% di anzide di sodio. Macchiare le cellule con l'anticorpo anti-CAR e lavare due volte. Macchiare le cellule con macchia viva / morta e anticorpo monoclonale CD3 (OKT3). Lavare le cellule e risospendere nel buffer di flusso. Acquisire su un citometro per determinare l'efficienza della trasduzione.</li>
	</ol></li>
	<li>Crioconservazione delle cellule CAR-T<ol>
<li>Per raccogliere e crioconservare le cellule CAR-T 8 giorni dopo la stimolazione (Giorno 8 dell'espansione delle cellule T), raccogliere le cellule dalla coltura.</li>
		<li>Girare verso il basso per 5 min a 300 x g.</li>
		<li>Risospendere nel mezzo di congelamento a 10 milioni di cellule per fiala mL nel mezzo di congelamento costituito da 10% di zolfo dimeile e 90% siero bovino fetale.</li>
		<li>Congelare in un contenitore di congelamento per ottenere una velocità di raffreddamento di -1 oc/min in un congelatore a -80 gradi centigradi e poi trasferire in azoto liquido dopo 48 h.</li>
		<li>Prima del loro uso per esperimenti in vitro o in vivo, scongelare le cellule CAR-T in MTC calda.</li>
		<li>Lavare le cellule per diluire e rimuovere lo zolfo dimetile e ravvistare a una concentrazione di 2 x 106 cellule / mL in TCM caldo. Riposare durante la notte a 37 gradi centigradi, 5% CO2.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Produzione GM-CSF k/o CART19
<ol><li>Per interrompere GM-CSF, utilizzare una guida RNA (gRNA) mirando all'esone 3 di GM-CSF (CSF2) umano selezionato tramite screening gRNA precedentemente riportato per avere un'elevata efficienza per il gene CSF2 che codifica per la citochina umana GM-CSF. 14 Del sistema NOTA: È stato utilizzato un costrutto lentivirale Cas9 di terza generazione di ricerca commercialmente sintetizzato contenente questo gRNA (sotto un promotore U6). Il costrutto contiene un gene di resistenza puromycina. La sequenza del gRNA è GACCTGCCTACAGACCCGCC. 12 mila
</li>
	<li>Per produrre lentivirus, utilizzare 293T cellule che hanno raggiunto 70-90% confluenza.</li>
	<li>Concedi 15 g di plasmide di lentivirale di interesse, 18 g di vettore di confezionamento gag/pol/tat/rev, 7 g di un vettore di inviluppo VSV-G, 111 litri del reagente pre-complesso, 129 -L della reagente di reimpostazione della trasfusione e 9,0 mL del mezzo di trasflessione da incubare per 30 min in sala mperatura.</li>
	<li>Aggiungere reagenti di trasfezione alle cellule 293T. Poi la coltura a 37 gradi centigradi, 5% CO2.</li>
	<li>Raccolta, centrifuga (900 x g per 10 min), filtro (filtro in nylon 0,45 M) e concentrato supernatante a 24 e 48 h per ultracentrifugato a 13.028 x g per 18 h o 112.700 x g per 2 h e congelare a -80 gradi per un uso futuro.</li>
	<li>Il primo giorno, risospendere delicatamente le cellule T per rompere le rosette.</li>
	<li>In un laboratorio approvato da BSL-2, aggiungere il virus congelato o appena raccolto alle cellule T stimolate per generare cellule CAR-T. Traduci le cellule T sia con il lentivirus CAR19 che con GM-CSF che prendono di mira il lentivirus CRISPR. Aggiungere il lentivirus CAR19 a un MOI di 3. Poiché la titolazione del lentivirus CRISPR non era fattibile, utilizzare particelle di virus generate da una preparazione plasmid di 15 ug per trasdurre 10 x 106 cellule T.</li>
	<li>Vedere i passaggi rimanenti della stimolazione, l'espansione e la crioconservazione delle cellule T, come descritto nel passaggio 1.
</li>
	<li>Per le cellule T modificate da lentiCRISPR che trasportano una resistenza puromycin, trattare le cellule con puromicina di idrocloruro ad una concentrazione di 1 g di puromycina per 1 mL il giorno 3 e il giorno 5 .</li>
</ol>3. Efficienza dell'interruzione GM-CSF e valutazione funzionale di GM-CSF k/o CART19
<ol><li>Efficienza di interruzione GM-CSF: monitoraggio degli indels mediante sequenziamento e analisi della decomposizione (TIDE)<ol>
<li>Per sequenziare l'esone di interesse per il gene GM-CSF, utilizzare i seguenti primer. Utilizzare una sequenza di primer in avanti per GM-CSF (CSF2) di TGACTACAGAGGCAGAE e una sequenza di primer inversa di TCACCTCTGACCTCATTAACC.</li>
		<li>Estrarre DNA da fino a 5 milioni di cellule CAR-T con un kit di estrazione genomica. Per la reazione PCR, utilizzare 25 l di un mastermix Taq per reazione con una concentrazione finale di ogni primer nella reazione PCR di :M, 0,1-0,5 g di DNA modello, e un volume totale della reazione PCR ha portato fino a 50 l con acqua priva di nuclesi.</li>
		<li>Vedere le condizioni di ciclo PCR descritte nella Tabella 1.</li>
		<li>Eseguire campioni di PCR su un gel di agarose 1-2% a 100 V per 30 min ed estrarre utilizzando un kit di estrazione gel.</li>
		<li>amplificatori PCR di sequenza. Calcola la frequenza di modifica degli alleli caricando i dati grezzi in un software TIDE appropriato. 15 Mi lasa del sistema
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Produzione GM-CSF e valutazione funzionale di GM-CSFk/o CART19<ol>
<li>Per determinare la produzione di citochine di cellule CAR-T, incubare cellule di tipo selvatico CART19 e GM-CSFk/o CART19 con il CD19 che esprime la linea cellulare linfoblastica acuta NALM6 a un rapporto di 1:5 per 4 h a 37 gradi centigradi, 5% di CO2 in presenza di monensina soluzione, CD49d anti-umano, CD28 anti-umano e CD107a anti-umano.</li>
		<li>Raccogli cellule dalla coltura per la citometria di flusso. Lavare le cellule con buffer di citometria di flusso. Macchia le cellule con un kit di colorazione vivo / morto. Incubare al buio a temperatura ambiente per 15 min. Fissare le cellule con un mezzo di fissaggio e incubare al buio a temperatura ambiente per 15 min.</li>
		<li>Dopo il lavaggio, macchia le cellule intracellularialmente con il mezzo di permeabilizzazione in combinazione con anticorpo monoclonale anti-umano IFN, anti-umano GM-CSF, MIP-1, IL-2 anti-umani e CD3 anti-umano e incubare al buio a temperatura ambiente per 30 min. Lavare e sospendere i campioni. Acquisire campioni su un citometro di flusso e analizzati per la percentuale di espressione intracellulare GM-CSF.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li>
<li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li>
<li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+genome+editing%3A+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Research+in+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li>
<li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li>
<li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168(2014).</li>
</ol>

SSK è un inventore di brevetti nel campo della terapia CAR T-cell che sono autorizzati a Novartis (sotto un accordo tra Mayo Clinic, Università della Pennsylvania, e Novartis). Questi studi sono stati finanziati in parte da una sovvenzione di Humanigen (SSK). RMS, MJC, RS e SSK sono inventori di brevetti relativi a questo lavoro. Il laboratorio (SSK) riceve finanziamenti da Tolero, Humanigen, Kite, Lentigen, Morphosys e Actinium.

In questo rapporto, descriviamo una metodologia per utilizzare la tecnologia CRISPR/Cas9 per indurre modifiche secondarie nelle cellule CAR-T. In particolare, questo è dimostrato utilizzando la trasduzione lentivirale con un vettore virale che contiene gRNA mirando al gene di interesse e Cas9 per generare cellule GM-CSFk/o CART19. In precedenza avevamo dimostrato che la neutralizzazione GM-CSF migliora CRS e NT in un modello di xenotrapianto. 12 Come descritto in precedenza, le cellule ...

La terapia cellulare T (CAR-T) del recettore dell'antigene chimerico è una grande promessa nel trattamento del cancro. 1 : il nome del , 2 Due terapie cellulari CAR-T rivolte a CD19 (CART19) sono state recentemente approvate negli Stati Uniti e in Europa per l'uso in neoplasie delle cellule B dopo aver dimostrato risultati sorprendenti negli studi clinici multicentri. 3 (COM del nome , 4 DEL psu' , 5 Le barriere all'uso più diffuso delle cellule CAR-T sono attività limitate nei tumori solidi e nelle tossicità associate, tra cui la sindrome di rilascio di citochine (CRS) e la neurotossicità (NT). 3 (COM del nome , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9 Per migliorare l'indice terapeutico della terapia cellulare CAR-T, vengono impiegati strumenti di ingegneria genomica come nucleasi di dita di zinco, TALEN e CRISPR per modificare ulteriormente le cellule CAR-T nel tentativo di generare cellule CAR-T meno tossiche o più efficaci. 10 del sistema , 11 Del sistema di
In questo articolo viene descritto un metodo per generare celle CAR-T modificate CRISPR/Cas9. L'obiettivo specifico di questo metodo è quello di modificare geneticamente le cellule CAR-T durante la produzione di cellule CAR-T tramite CRISPR/Cas9 per generare cellule CAR-T meno tossiche o più efficaci. La motivazione per sviluppare questa metodologia si basa sulle lezioni apprese dall'esperienza clinica della terapia cellulare CAR-T, che indica un'urgente necessità di nuove strategie per aumentare la finestra terapeutica della terapia cellulare CAR-T e per estendere l'applicazione in altri tumori ed è supportato dai recenti progressi nella biologia sintetica che consentono più modifiche di cellule CAR-T che hanno iniziato ad entrare nella clinica. Mentre diversi strumenti di ingegneria genomica sono in fase di sviluppo e applicazione in diversi ambienti, come le nucleasi di dita di zinco, i TALENs e il CRISPR, la nostra metodologia descrive la modifica CRISPR/Cas9 delle cellule CAR-T. 10 del sistema , 11 CRISPR/Cas9 è un meccanismo di difesa batterico basato sull'RNA progettato per eliminare il DNA estraneo. CRISPR si basa su endonucleasi per fendere una sequenza bersaglio identificata attraverso un RNA guida (gRNA). L'editing CRISPR delle cellule CAR-T offre diversi vantaggi rispetto ad altri strumenti di ingegneria genomica. Questi includono la precisione della sequenza di gRNA, la semplicità di progettare un gRNA che colpisca il gene di interesse, l'elevata efficienza di editing genico e la capacità di indirizzare più geni poiché più gRNA possono essere utilizzati contemporaneamente.
In particolare nei metodi qui descritti, abbiamo usato un lentivirus che codifica l'RNA e la guida CRISPR per interrompere un gene durante la trasduzione CAR delle cellule T. Nella scelta di una tecnica appropriata per modificare le cellule CAR-T, suggeriamo che la tecnica descritta di seguito sia un meccanismo efficiente per generare cellule CAR-T di grado di ricerca, ma poiché l'effetto a lungo termine dell'integrazione permanente del Cas9 nel genoma è sconosciuto, non è noto proporre questa metodologia per sviluppare prove di ricerca di grado CAR-T cellule, ma non per la produzione di buona pratica di produzione grado CAR-T cellule.
In particolare, qui descriviamo la generazione di granulociti colonia macrofato stimolante fattore di stimolazione (GM-CSF) knockout cellule CAR-T di mira persone umane CD19. Queste cellule CAR-T sono state generate dalla trasduzione con particelle lentivirali che codificano una guida RNA specifica di GM-CSF (gene name CSF2) e Cas9. In precedenza abbiamo scoperto che la neutralizzazione GM-CSF migliora CRS e NT in un modello di xenotrapianto. 12 cellule GM-CSFk/o CAR-T consentono l'inibizione di GM-CSF durante il processo di produzione, riducendo efficacemente la produzione di GM-CSF migliorando nel contempo l'attività antitumorale delle cellule CAR-T e la sopravvivenza in vivo rispetto alle cellule CAR-T di tipo selvatico. 12 Così, qui forniamo una metodologia per generare cellule CAR-T modificate CRISPR/Cas9.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo monoclonale CD3 (OKT3), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0037-42</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale CD3 (UCHT1), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0038-42</td><td></td></tr><tr><td>Choice Taq Blue Mastermix</td><td>Denville Scientific</td><td>C775Y51</td><td></td></tr><tr><td>CTS (Sistemi di terapia cellulare) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX System B4-R2-V2</td><td>Beckman Coulter</td><td>C10343</td><td>citometro a flusso</td></tr><tr><td>dimetil solfossido</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>di Dulbecco Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S (concentratore di particelle magnetiche)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit di isolamento delle cellule T umane&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951</td><td>perle magnetiche a selezione negativa; 17951RF include punte e tampone</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>FITC Topo Anti-Umano CD107a&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di fissazione (Medium A)</td><td>Invitrogen</td><td>GAS001S100</td><td></td></tr><tr><td>GenCRISPR gRNA Costrutto: Nome: CSF2 RNA guida CRISPR 1; Specie: Umana, Vettore: pLentiCRISPR v2; Resistenza: Ampicillina; Numero di copia: High; Preparazione del plasmide: Consegna standard: 4 &mu; g (Gratuito di carica)</td><td>GenScript</td><td>N/A ordine</td><td>personalizzato</td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG (H+L) Anticorpo secondario adsorbito incrociato, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td></td></tr><tr><td>https://tide.nki.nl.</td>Siero AB umano <td>di genetica</td><td></td><td></td>desktop</tr><tr><td>; Donatori di sesso maschile; tipo AB; US</td><td>Corning</td><td>35-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>IFN gamma anticorpo monoclonale (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>47-7319-42</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Reagente di trasfezione</td><td>Invitrogen</td><td>L3000075</td><td></td></tr><tr><td>Kit di colorazione per cellule morte Aqua fissabile LIVE/DEAD, per eccitazione a 405 nm</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07851</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Monensin, 1000X</td><td>BioLegend</td><td>420701</td><td></td></tr><tr><td>Topo Anti-Umano CD28 Clone CD28.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>559770</td><td></td></tr><tr><td>Topo Anti-Umano CD49d Clone 9F10</td><td>BD Pharmingen</td><td>561892</td><td></td></tr><tr><td>Topo Anti-Umano MIP-1&beta; PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>560687</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore per congelamento Mr. Frosty</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>NALM6, clone G5&nbsp;</td>Linea <td>cellulare per leucemia linfoblastica acuta</td> <td>ATCC</td><td>CRL-3273</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Promega</td><td>P119C</td><td></td></tr><tr><td>Sistemi di filtri sottovuoto Olympus, 500 mL, membrana PES, 0,22uM, sterile</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtranti monouso sterili a flusso rapido Nalgene con membrana CN 0,45uM</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I a siero ridotto Medium (1X), Liquid</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2</td><td>BD Horizon</td><td>562384</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina-Glutammina (100X), Liquid</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di permeabilizzazione (Medium B)</td><td>Invitrogen</td><td>GAS002S100</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K182001</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina dicloridrato</td><td>MP Biomedicals, Inc.</td><td>Kit di estrazione su gel 0210055210</td> QIAquick QIAGEN 28704 Rat Anti-Human GM-CSF BV421 BD Horizon 562930 RoboSep-S STEMCELL Technologies 21000 Separatore cellulare completamente automatizzato SepMate-50 (IVD)STEMCELL Technologies 85450 Azoturo di sodio, 5% (p/v)Ricca Chemical <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Terreno a cellule ematopoietiche senza siero</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzo di crispr/cas9 per eliminare gm-csf nelle celle car-t

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

La terapia cellulare T (CAR-T) del recettore dell'antigene chimerico è una nuova opzione di trattamento all'avanguardia e potenzialmente rivoluzionaria per il cancro. Tuttavia, ci sono limitazioni significative al suo uso diffuso nel trattamento del cancro. Queste limitazioni includono lo sviluppo di tossicità uniche come la sindrome del rilascio di citochine (CRS) e neurotossicità (NT) e l'espansione limitata, le funzioni degli efumani e l'attività anti-tumorale nei tumori solidi. Una strategia per migliorare l'efficacia car-T e/o la tossicità del controllo delle cellule CAR-T consiste nel modificare il genoma delle cellule CAR-T stesse durante la produzione di cellule CAR-T. Qui, descriviamo l'uso dell'editing del gene CRISPR/Cas9 nelle cellule CAR-T attraverso la trasduzione con un costrutto lentivirale contenente un RNA guida al granulocito macrofato fattore stimolante della colonia (GM-CSF) e Cas9. Ad esempio, descriviamo CRISPR/Cas9 mediato knockout di GM-CSF. Abbiamo dimostrato che queste cellule GM-CSFk/o CAR-T producono efficacemente meno GM-CSF, pur mantenendo la funzione critica delle cellule T e si traducono in una maggiore attività antitumorale in vivo rispetto alle cellule CAR-T di tipo selvatico.

La figura 1 mostra la riduzione di GM-CSF nelle celle GM-CSFk/o CART19. Per verificare che il genoma delle cellule T sia stato alterato per eliminare la GM-CSF, il sequenziamento TIDE è stato utilizzato nelle cellule GM-CSFk/o CART19 (Figura 1A). La colorazione della superficie delle cellule CAR-T verifica che le cellule T esprimano con successo il recettore della superficie CAR in vitro gating su cellule CD...

Qui, presentiamo un protocollo per modificare geneticamente le cellule CAR-T tramite un sistema CRISPR/Cas9.

Utilizzo di CRISPR/Cas9 per eliminare GM-CSF nelle celle CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Il nostro protocollo descrive la modificazione genetica delle cellule CAR-T durante la loro produzione attraverso la tecnologia CRISPR per generare prodotti più efficaci e meno tossici. Un vantaggio di questa tecnica è che la produzione di cellule CAR-T e la manipolazione genetica possono verificarsi entrambe in una cellula con una buona efficienza. A dimostrare la procedura saranno Rosalie Sterner, dottoranda, Michelle Cox, tecnologa e studentessa laureata, e Reona Sakemura, post-dottorato, del mio laboratorio.Dopo aver isolato le cellule T dalle cellule mononucleari del sangue periferico raccolte, inizia a coltivarle preparando prima il mezzo a cellule T e poi sterilizzandole filtrandole attraverso un filtro sterile sottovuoto da 0,45 micrometri e poi con un filtro sottovuoto sterile da 0,22 micrometri. Il giorno della stimolazione delle cellule T o del giorno zero, prima della stimolazione, lavare le perline CD3/CD28 posizionando il volume richiesto di perline in un tubo sterile di microcentrifugo da 1,5 millilitri e rimosintendo in un millilitro di TCM. Posizionare il tubo a contatto con un magnete per un minuto.Quindi aspirare il TCM e rimescolare in un millilitro di TCM fresco per lavare di nuovo le perline e ripetere per un totale di tre lavaggi. E infine, rimospendare le perline in un millilitro di TCM. Dopo aver contato le cellule T, trasferire le perline alle cellule T con un rapporto di tre a una perline con le cellule.Quindi diluire le cellule a una concentrazione finale di un milione di cellule per millilitro e incubare a 37 gradi Celsius, 5%CO2 per 24 ore. Dopo aver acquisito un costrutto CART19 in un vettore lentivirale, eseguire la produzione lentivirale incubando prima il plasmide lentivirale, il vettore di imballaggio, il vettore dell'inviluppo, il reagente precomplesso, il reagente di trasfezione e il mezzo di trasfezione a temperatura ambiente per 30 minuti. Eseguire lavori lentivirali utilizzando precauzioni BSL2+, tra cui cappe di coltura cellulare, dispositivi di protezione individuale e disinfezione di materiali usati con candeggina prima dello smaltimento.Dopo l'incubazione, aggiungere questi reagenti di trasfezione alle 293 cellule T che hanno raggiunto il 70-90% di confluenza e coltura le cellule trasfette a 37 gradi Celsius e 5%CO2. A 24 e 48 ore dalla trasfezione, raccolta, centrifuga, filtra e concentrato il supernatante contenente virus mediante ultracentrifugazione e congelare a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro. Il primo giorno, rimorsiva delicatamente le cellule T che sono state stimolate a un milione di cellule per millilitro il giorno zero al fine di rompere le rosette delle cellule.In base alle opportune precauzioni BSL2+, aggiungere virus raccolto fresco o congelato alle cellule T simulate a una molteplicità di infezione di 3.0. Continuare a incubare le cellule T trasdotto a 37 gradi Celsius, 5%CO2. Nei giorni tre e cinque, contare le cellule CAR-T e aggiungere TCM fresco pre-riscaldato alla coltura per mantenere una concentrazione cellulare CAR-T di un milione di cellule per millilitro.Sei giorni dopo la simulazione, rimuovere le perline dalle cellule T trasdotto raccogliendo e riutilizzando le cellule. Trasferire le celle in tubi conici da 50 millilitri e posizionare i tubi in un magnete per un minuto. Dopo aver raccolto il supernatante contenente cellule CAR-T e aver scartato le perline, riposizionare le cellule in coltura ad una concentrazione di un milione di cellule per millilitro in un pallone di coltura.Utilizzare un campione di cellule per la citometria del flusso per valutare l'espressione superficiale dei CATE. Incubare il resto per riprendere l'espansione e quindi raccogliere e crio-preservare le cellule all'ottavo giorno come descritto nel manoscritto. Per interrompere il fattore stimolante della colonia di macrofagi granulociti, utilizzare un RNA guida come descritto nel manoscritto.Incubare i reagenti di trasfezione a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungili alle 293 cellule T che hanno raggiunto la confluenza dal 70 al 90% e coltivi le cellule trasfette a 37 gradi Celsius, 5%CO2 per produrre un lentivirus. A 24 e 48 ore, raccogliere e concentrare il supernatante contenente virus mediante ultracentrifugazione in tubi ultracentrifugi da 50 millilitri e congelare a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro.Quindi, il primo giorno, rimospensì delicatamente le cellule T per rompere le rosette. In un laboratorio approvato da BSL2+, per generare cellule CAR-T, aggiungere il lentivirus CAR19 e il lentivirus CRISPR mirato al GMCSF alle cellule T simulate. Il terzo e quinto giorno per le cellule T modificate lentiCRISPR con successo che trasportano resistenza alla puromicina, trattare le cellule con puromicina diidrocloruro ad una concentrazione di un microgrammo di puromicina per millilitro.Il sequenziamento delle maree è stato utilizzato per confermare una riduzione GM-CSF delle cellule CART19 knockout GM-CSF con un'efficienza di interruzione di circa il 71% I grafici di flusso della colorazione della superficie cellulare CAR-T gated su cellule positive CD3 in diretta mostrano che sia cart19 di tipo selvaggio che GM-CSF knockout CART19 con successo e in modo simile esprimono il recettore di superficie CAR in vitro. D'altra parte, la colorazione intracellulare di GM-CSF per citometria a flusso gated anche su cellule positive cd3 in diretta dimostra una diminuzione dell'espressione di GM-CSF nelle cellule knockout rispetto alle cellule CART19 di tipo selvatico che confermano il successo funzionale del knockout. Particolare attenzione dovrebbe essere presa durante le fasi di trasduzione di questa procedura in quanto sono le più critiche per lo sviluppo di cellule CAR-T geneticamente modificate.La metodologia descritta può potenzialmente essere applicata a una varietà di geni per modificare le cellule CAR-T tramite CRISPR/CAS9 per aiutare a generare un prodotto meno tossico e più efficace. La tecnologia CRISPR/CAS9 fornisce le strategie per indirizzare direttamente il genoma delle cellule CAR-T per progettare soluzioni alle attuali carenze cliniche.

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Research

Ricerca

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Cancer Research

Ricerca sul cancro

Il video delinea un processo per la creazione di cellule CAR T geneticamente modificate attraverso il sistema CRISPR-Cas9. L'infezione delle cellule T con lentivirus CRISPR e CAR provoca modifiche al gene bersaglio e la sintesi di un recettore chimerico dell'antigene o CAR, portando infine alla formazione di cellule T CAR geneticamente modificate.

Cellule CAR T geneticamente modificate utilizzando un sistema CRISPR-Cas9

Questo video mostra un test per l'esecuzione dell'editing genetico in cellule T umane utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Una miscela di cellule T primarie CD4+ e CD8+ è combinata con un complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9, mirato a geni specifici per il knockout. Dopo l'elettroporazione, l'sgRNA guida Cas9 verso la sequenza di DNA bersaglio, creando tagli precisi. Questi tagli vengono poi riparati dal meccanismo di giunzione non omologa della cellula, portando al knockout genico.

Una tecnica CRISPR-Cas9 per l'editing genetico nelle cellule T

Genica mirata di editing con CRISPR/Cas9 ha notevolmente facilitato la comprensione delle funzioni biologiche dei geni. Qui, utilizziamo la metodologia CRISPR/Cas9 a modello calreticulina mutazioni in cellule ematopoietiche citochina-dipendente al fine di studiare la loro attività oncogena.

Utilizzando CRISPR/Cas9 Gene Editing per studiare l'attività oncogena di calreticulina mutante in cellule ematopoietiche Cytokine dipendente

Un protocollo per la veloce rottura CRISPR/Cas9-mediata del gene nel topo ed emopoietici umani primari è descritto in questo articolo. Cas9-sgRNA ribonucleoproteine vengono introdotti tramite elettroporazione con sgRNAs generato tramite trascrizione in vitro e commerciale Cas9. Alta efficienza di editing si ottiene con tempo limitato e costi finanziari.

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Studi convenzionali di perdita di funzione di geni mediante animali knockout sono stati spesso lunghe e costose. Basato su elettroporazione mutagenesi somatica CRISPR-mediata è un potente strumento per capire il gene funziona in vivo. Qui, segnaliamo un metodo per analizzare i fenotipi di knockout in cellule di proliferazione del cervelletto.

CRISPR-mediata di perdita di funzione di analisi in granuli cerebellari cellule utilizzando nell'Utero basati su elettroporazione trasferimento del Gene

Qui, presentiamo un protocollo per l'editing genetico nelle cellule T umane primarie utilizzando la tecnologia CRISPR Cas per modificare le cellule CAR-T.

Produzione di cellule CAR-T umane ingegnerizzate CRISPR

L'articolo descrive un protocollo per l'applicazione di un modello in vitro per l'esaurimento per completare uno screening CRISPR knockout per l'intero genoma in cellule T del recettore dell'antigene chimerico del donatore sano.

Esecuzione di uno screening CRISPR knockout in vitro a livello di genoma in cellule T del recettore dell'antigene chimerico

La linea cellulare THP-1 è ampiamente utilizzata come modello per studiare le funzioni dei monociti/macrofagi umani in varie aree di ricerca legate alla biologia. Questo articolo descrive un protocollo per l'ingegneria efficiente basata su CRISPR-Cas9 e l'isolamento di cloni di singole cellule, che consente la produzione di dati fenotipici robusti e riproducibili.

Knockout genico mediato da CRISPR-Cas9 basato sull'elettroporazione in cellule THP-1 e isolamento di cloni a singola cellula

Abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato di screening knockout CRISPR-Cas9 per le cellule CAR T primarie. Riducendo il trasferimento del gDNA tramite la digestione enzimatica e il pulldown delle cassette sgRNA, questo approccio minimizza gli artefatti PCR, garantendo una rilevazione accurata degli sgRNA e un'identificazione robusta dei bersagli genici funzionali.

Migliorare gli schermi CRISPR-Cas9 nelle cellule CAR T: un metodo raffinato per la preparazione delle librerie

Si tratta di un protocollo di tempo e costi efficaci in vitro indagare i meccanismi della resistenza acquisita agli agenti terapeutici mirati, che è un bisogno medico altamente insoddisfatto in gestione del cancro.

Alla ricerca di Driver delle vie di acquisito resistenza alla terapia mirata: generazione farmacoresistenti Subclone e sensibilità ripristino di Gene Knock-down

Impara a modificare geneticamente le cellule CAR-T con CRISPR/Cas9 durante la produzione per ottenere terapie più efficaci e meno tossiche. Questo protocollo combina ingegneria genetica e immunoterapia.

Utilizzo di CRISPR/Cas9 per eliminare GM-CSF nelle celle CAR-T

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