Name: Isolamento e quantificazione del virus zika da più organi in un mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Scopri l'isolamento e la quantificazione del virus Zika da organi multipli nel topo per studiare la patogenesi virale e le risposte immunitarie. Questo metodo supporta lo sviluppo di vaccini e terapie.

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Dr. Pinto è finanziato da una sovvenzione di seme della Saint Louis University School of Medicine e fondi di avvio dalla Saint Louis University School of Medicine. Il Dr. Brien è finanziato da un K22AI104794 premio ricercatore precoce dal NIH NIAID e una sovvenzione di seme dalla Saint Louis University School. Per tutte le persone finanziate, i finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

<ol><li>Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus%3A+New+Clinical+Syndromes+and+Its+Emergence+in+the+Western+Hemisphere%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).</li>
<li>Simpson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infection+in+Man%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infection in Man.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).</li>
<li>Fagbami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+investigations+on+arbovirus+infections+at+Igbo-Ora%2C+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+and+Geographical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria.</a> Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).</li>
<li>McCrae, A. W., Kirya, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yellow+fever+and+Zika+virus+epizootics+and+enzootics+in+Uganda%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).</li>
<li>Rodhain, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arbovirus+infections+and+viral+haemorrhagic+fevers+in+Uganda%3A+a+serological+survey+in+Karamoja+district%2C+1984%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).</li>
<li>Wikan, N., Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus%3A+history+of+a+newly+emerging+arbovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Zika virus: history of a newly emerging arbovirus.</a> Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+outbreaks+in+the+Americas%5BTitle%5D)+AND+%22The+Weekly+Epidemiological+Record%22%5BJournal%5D)">Zika virus outbreaks in the Americas.</a> The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).</li>
<li>Brien, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Immunological+basis+of+age-related+vulnerability+to+viral+infection%22">Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection</a>. , Oregon Health & Science University. (2007).</li>
<li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus-specific+CD4+T+cells+exhibit+direct+antiviral+cytokine+secretion+and+cytotoxicity+and+are+sufficient+for+antiviral+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection.</a> Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).</li>
<li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+of+T+cell+defects+in+age-related+vulnerability+to+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).</li>
<li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li>
<li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+therapeutic+antibodies+that+neutralize+homologous+and+heterologous+genotypes+of+dengue+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823(2010).</li>
<li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor-1+%28IRF-1%29+shapes+both+innate+and+CD8%28%2B%29+T+cell+immune+responses+against+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230(2011).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temporal+role+of+type+I+interferon+signaling+in+CD8%2B+T+cell+maturation+during+acute+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407(2011).</li>
<li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation%2C+quantification%2C+detection%2C+and+storage+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).</li>
<li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+by+immunoglobulin+dual-affinity+retargeting+antibodies+against+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus.</a> Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).</li>
<li>Messaoudi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya+virus+infection+results+in+higher+and+persistent+viral+replication+in+aged+rhesus+macaques+due+to+defects+in+anti-viral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343(2013).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hydrogen+peroxide-inactivated+virus+vaccine+elicits+humoral+and+cellular+immunity+and+protects+against+lethal+West+Nile+virus+infection+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).</li>
<li>Sukupolvi-Petty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+antibodies+against+dengue+virus+type+4+reveals+strain-dependent+epitope+exposure+that+impacts+neutralization+and+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection.</a> Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086(2014).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+New+Therapeutics+Using+a+More+Immunocompetent+Mouse+Model+of+Antibody-Enhanced+Dengue+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection.</a> MBio. 6 (5), (2015).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Murine+IFIT1+Proteins+Do+Not+Restrict+Infection+of+Negative-Sense+RNA+Viruses+of+the+Orthomyxoviridae%2C+Bunyaviridae%2C+and+Filoviridae+Families%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).</li>
<li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BT+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathog. 14 (9), e1007237(2018).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004086(2014).</li>
<li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation%2C+quantification%2C+detection%2C+and+storage+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).</li>
<li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BT+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237(2018).</li>
<li>Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lectin+pathway+of+complement+activation+contributes+to+protection+from+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection.</a> Virology. 412 (1), 101-109 (2011).</li>
<li>Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+interferon+controls+West+Nile+virus+infection+and+pathogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

L'infezione da IKV può causare una malattia neurologica, quindi gli attuali modelli animali per studiare la patogenesi, le risposte immunitarie e l'efficacia protettiva dei vaccini e degli antivirali devono concentrarsi sul controllo virale all'interno del SNC. Una delle sfide nel concentrarsi sulla malattia del SNC è che spesso va a scapito dello studio dell'infezione periferica. I metodi di isolamento dell'organo qui proposti si concentrano sulla necessità di valutare rapidamente l'infezione da IKV sia nella periferia ...

Il virus del virus zika è un arbovirus appartenente alla famiglia flaviviridae, che comprende importanti patogeni umani neuroinvasivi come il virus Powassan (POWV), il virus dell'encefalite giapponese (JEV) e il virus del Nilo occidentale (WNV)1. A seguito del suo isolamento e della sua identificazione, sonostati periodici rapporti periodici di infezioni umane in Africa e Asia 2,3,4,5,ed epidemie all'interno dell'America centrale e meridionale (riviste in riferimento6). Tuttavia, non è stato fino a poco tempo fa che si pensava che la Malattia di IKV causasse una grave malattia7. Ora ci sono migliaia di casi di malattie neurologiche e difetti alla nascita legati alle infezioni da .IKV. La rapida comparsa dello ZiKV ha suscitato molte domande relative al: perché c'è un aumento della gravità della malattia, qual è la risposta immunologica all'infezione da manifestazioni e difetti alla nascita. Ora c'è fretta di comprendere la malattia correlata al sistema nervoso centrale (SNC) associata all'IKV, nonché la necessità di testare rapidamente l'efficacia degli antivirali e dei vaccini contro la . È in questo contesto che abbiamo sviluppato metodi per l'analisi rapida dei titoli di iKV sia nella periferia che nel CNS utilizzando un'attenzione specifica per la .IKV (FFA).
I modelli animali di piccole dimensioni sono importanti per comprendere la progressione della malattia e per la valutazione precoce di vaccini, terapie e anti-virali. Abbiamo stabilito piccoli modelli animali per lo studio della malattia da arbovirus utilizzando vari ceppi murini per modellare l'infezione umana e la protezione contro i patogeni virali8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Utilizzando questa precedente esperienza, abbiamo iniziato a modificare le tecniche utilizzate per la valutazione del virus WNV e Dengue, un flavivirus correlato per la valutazione del titro di . 24. I vantaggi di questi metodi rispetto ad altri saggi sono: 1) che essi combinano la capacità di raccogliere sia organi periferici che sNC per l'analisi; 2) i metodi sono adattabili per la citometria di flusso, per le misurazioni di risposte immunitarie innate e adattative, insieme a i titori virali sullo stesso animale nello stesso organo; 3) la tecnica del raccolto è adattabile per l'analisi istologica; 4) l'IKV FFA è un metodo rapido ad alta produttività per l'analisi del titro virale; e 5) questi metodi possono essere applicati alla valutazione dei titori virali negli organi degli animali infettati con la maggior parte degli agenti patogeni25.

<table><tbody><tr><td>1-bromo-3-cloropropano (BCP)</td><td>gene MRC</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 cc</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BD 309642</td><td></td></tr><tr><td>ago da 18 G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-557-145</td><td></td></tr><tr><td>Siringa TB da 1 cc</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-16H</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 20 cc</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-561-66</td><td></td></tr><tr><td>Mulino a 24 tubi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15 340 163</td><td></td></tr><tr><td>Perline in acciaio inox da 3,2 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9084634</td><td></td></tr><tr><td>37 gradi Incubatore per colture tissutali</td><td>C Anticorpo Nuair</td><td>5800</td><td></td></tr><tr><td>4G2</td><td>in casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 piastre a fondo piatto a 96 pozzetti</td><td>Midsci</td><td>TP92696</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti piastre a fondo rotondo</td><td>Midsci</td><td>TP92697</td><td></td></tr><tr><td>Basix 1,5 mL provette Eppendorf</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr><td>Graffette di candeggina germicida concentrata</td><td></td><td>30966CT</td><td></td></tr><tr><td>CTL S6 Analizzatore</td><td>Universale CTL</td><td>CTL S6 Forbici</td><td></td></tr><tr><td>da taglio curve</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Glucosio medio-alto Con 4.500 mg/L di glucosio</td><td>MilliporeSigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (grado di biologia molecolare)</td><td>MilliporeSigma</td><td>e7023</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>MilliporeSigma</td><td>F0926-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Fine</td><td>Science Tools</td><td>11036-20</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>MilliporeSigma</td><td>537020</td><td></td></tr><tr><td>Capra anticorpo marcato HRP anti-topo</td><td>MilliporeSigma</td><td>8924</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3537-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo (grado di biologia molecolare)</td><td>MilliporeSigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di ketamina/xilazina</td><td>Medicina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>comparata L-glutammina</td><td>MilliporeSigma</td><td>g7513</td><td></td></tr><tr><td>Magmax RNA kit di purificazione</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1830</td><td></td></tr><tr><td>Metilcellulosa</td><td>MilliporeSigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Ependorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>MiniCollect 0,5 mL Provette EDTA</td><td>Bio-one</td><td>450480</td><td></td></tr><tr><td>Provette O-ring</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-403-195</td><td></td></tr><tr><td>One step q RT-PCR mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4392938</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EMS- 15713-S</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>MilliporeSigma</td><td>d8537-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Pipette multicanale Proline</td><td>Sartorius</td><td>72230/72240</td><td></td></tr><tr><td>Pipette monocanale</td><td>Proline Sartorius</td><td>728230</td><td></td></tr><tr><td>Acqua libera da RNAsi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol BD</td><td>MRC gene</td><td>RB192</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma oscillante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-676-333</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Fisher</td><td>MT10040CV</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>MilliporeSigma</td><td>s7900</td><td></td></tr><tr><td>Cucchiaio/spatola</td><td>Strumenti di Fine Science</td><td>10090-17</td><td></td></tr><tr><td>Dritto forbici da taglio</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MilliporeSigma</td><td>t8787</td><td></td></tr><tr><td>True Blue Substrato</td><td>VWR</td><td>95059-168</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>MilliporeSigma</td><td>T3924-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e quantificazione del virus zika da più organi in un mouse

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

I metodi presentati dimostrano le procedure di laboratorio per l'isolamento degli organi dagli animali infetti dal virus zika e la quantificazione del carico virale. Lo scopo della procedura è quello di quantificare i dispositivi virali nelle aree periferiche e del SNC del topo in diversi momenti dopo l'infezione o in diverse condizioni sperimentali per identificare i fattori virologici e immunologici che regolano l'infezione da virus zika. Le procedure di isolamento degli organi dimostrate consentono sia la quantificazione del saggio che la valutazione quantitativa della PCR dei titer virali. Le tecniche di isolamento rapido degli organi sono progettate per la conservazione del titro del virus. La quantificazione del titro virale per messa a fuoco formando il saggio consente la rapida valutazione della produttività del virus . Il vantaggio della formazione di analisi di fuoco è la valutazione del virus infettivo, la limitazione di questo saggio è il potenziale per la tossicità degli organi riducendo il limite di rilevamento. La valutazione del titro virale è combinata con la PCR quantitativa e l'utilizzo di un numero di copia virale del genoma del controllo dell'RNA ricombinante all'interno dell'organo viene valutato con un basso limite di rilevamento. Nel complesso, queste tecniche forniscono un metodo rapido ed accurato ad alto throughput rapido per l'analisi dei titoli virali di zika nella periferia e del SNC degli animali infetti del virus zika e possono essere applicati alla valutazione dei titoli virali negli organi degli animali infetti con la maggior parte agenti patogeni, tra cui il virus Dengue.

Per valutare i titori di iKV utilizzando il protocollo descritto sopra Ifnar1-/- i topi sono stati infettati con l'iKV (PRVABC59) tramite iniezione sottocutanea (SC) al footpad. Qui, l'amministrazione di 1 x 105 FFU di IKV a 8-12 settimana di età Ifnar1-/- topi SC non è letale, ma il virus può replicare sia nella periferia e CNS. Questa dose e percorso vengono utilizzati per studiare le risposte immunitarie dei patogeni ospiti e la patog...

L'obiettivo del protocollo è quello di dimostrare le tecniche utilizzate per studiare la malattia virale isolando e quantificando il virus zoika, da più organi in un topo dopo l'infezione.

Isolamento e quantificazione del virus zika da più organi in un mouse

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

In questo video descriviamo una serie di procedure progettate per interrogare l'impatto di un'infezione virale e la conseguente risposta immunologica utilizzando un modello murino di infezione da Zika. Questo protocollo è significativo perché ci consente di sviluppare una comprensione meccanicistica dell'infezione e dell'immunità identificando la misura in cui un virus si è diffuso in tutto il corpo, trasversando le barriere fisiche e accedendo ai tessuti. Queste tecniche consentono una comprensione dettagliata della patogenesi virale e forniscono la capacità di sezionare il meccanismo di protezione fornito da vaccini o terapie.Qui dimostriamo questo metodo usando l'infezione da virus Zika dei topi, ma questo metodo può essere applicato a una serie di infezioni virali tra cui altri flavivirus come il virus Dengue e alfavirus come il virus Chikungunya. Raccogliere gli organi del sistema nervoso centrale può essere impegnativo, quindi è importante che una persona pianifiche un piccolo esperimento ed essere pronta a praticare le tecniche in anticipo. Questo protocollo consente la rapida dissezione della diffusione virale all'interno di piccoli modelli animali con la capacità di visualizzare, catturare e archiviare dati sperimentali.È importante dimostrare visivamente questo metodo per consentire allo sperimentatore di capire come raccogliere gli organi del sistema nervoso centrale. È anche importante vedere il livello di confluenza cellulare e l'intensità dei focolai virali. Per iniziare, utilizzare le forcep per rimuovere la pelle del mouse infetto.Decapitare la testa del topo con le forbici, seguita dalla rimozione delle braccia e delle gambe. Per raccogliere il cervello, usa le forbici La Grange seghettate per tagliare il cranio attraverso il magnum del forame. Staccare il cranio con le forcep e raccogliere il cervello con una spatola.Usando forti forbici smussate, rimuovere l'osso che circonda la colonna vertebrale, quindi tagliare l'osso pelvico per esporre il forame vertebrale a livello lombare. Quindi, rimuovere il più possibile il muscolo che circonda la colonna vertebrale. Con attenzione, posizionare la punta smussata dell'ago all'interno del foro vertebrale, evitando pressioni eccessive per evitare che l'ago sconfina nel corpo vertebrale.Tenere forte per esercitare pressione sul corpo vertebrale e sull'ago e premere lo stantuffo della siringa per espellere il cavo nella piastra di Petri. Trasferire immediatamente il midollo spinale nel tubo etichettato e posizionare nel bagno di ghiaccio secco per un'ulteriore omogeneizzazione. Per l'omogeneizzazione, aggiungere un millilitro di DMEM e omogeneizzare il campione in un BeadBeater.Dopo aver fatto in modo che gli organi siano omogeneizzati, centrifugare e aliquotare i campioni sul ghiaccio e conservare nel meno 80 gradi Celsius fino a quando necessario. Il giorno del test, rimuovere i campioni omogeneizzati dal congelatore meno 80 gradi Celsius e consentire loro di scongelarsi. Con i campioni sul ghiaccio, diluire il virus Zika dieci volte nel primo pozzo della piastra di diluizione e utilizzare una pipetta multicanale per fare dieci volte diluizioni seriali lungo la piastra, cambiando le punte ogni volta.Aggiungendo 20 microlitri di campione in 180 microlitri di mezzi di crescita, cambiare le punte delle pipette tra ogni diluizione. Preparare la piastra di formatura della messa a fuoco rimuovendo il supporto dalla piastra piatta preparata a 96 pozzi che copre le virocelle. Per evitare che il monostrato si asciughi, aggiungere immediatamente 100 microlitri della diluizione del virus ad ogni pozzo nel viroplato.Utilizzare lo stesso set di suggerimenti per aggiungere dalla concentrazione più bassa a la più alta. Piastra rocciosa da due a quattro volte e incubare a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per una o due ore. Riscaldare il 2% di metilcellulosa a temperatura ambiente.Quindi, diluire la soluzione del 2% di metilcellulosa nei mezzi di crescita con un rapporto di circa due a uno. Dopo l'incubazione, aggiungere 125 microlitri del supporto di crescita della metilcellulosa ad ogni pozzo delle piastre a 96 potte. Incubare di nuovo a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per 32-40 ore.Per fissare le virocelle, in un armadio di biosicurezza aggiungere 50 microlitri di paraformaldeide al 5% sopra la parte superiore dello strato di metilcellulosa in ogni pozzo delle piastre a 96 potte. Incubare per 60 minuti a temperatura ambiente. In alternativa, coprire le piastre con Parafilm e posizionarle a quattro gradi Celsius durante la notte.Successivamente, utilizzare una pipetta per rimuovere la sovrapposizione e mediare le cellule in un contenitore usa e getta all'interno dell'armadio per la biosicurezza. Lavare delicatamente con 150 microlitri di PBS per pozzo. Rimuovere pbs dalle piastre e rimuovere la piastra dall'armadio di biosicurezza.Ripetere il lavaggio PBS due volte, quindi aggiungere 150 microlitri per pozzo una volta il tampone di lavaggio FFA e lasciare a temperatura ambiente per cinque-10 minuti per permeabilizzare le celle fisse. Successivamente, usa l'anticorpo Zika primario per rilevare l'infezione. Preparare l'anticorpo primario 4G2 ad una concentrazione di un microgrammo per millilitro nel tampone di colorazione FFA.Far scorrere il tampone di lavaggio FFA dalle piastre e aggiungere 50 microlitri dell'anticorpo primario nel tampone di colorazione FFA ad ogni pozzo. Quindi sigillare le piastre con Parafilm, o pellicola di plastica, e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Preparare l'anticorpo etichettato HRP anti-topo secondario ad una concentrazione da uno a 5.000 nel tampone di colorazione FFA.Dopo aver rimosso la soluzione anticorpale, lavare le cellule tre volte con 150 microlitri tampone di lavaggio FFA per pozzo. Rimuovere il buffer di lavaggio svolazzando ogni volta nel lavandino. Macchiare le cellule con l'anticorpo secondario nel tampone di colorazione FFA a 50 microlitri per pozzo e incubare da una a due ore a temperatura ambiente.Successivamente, lavare le celle tre volte con il tampone di lavaggio FFA, di nuovo, rimuovendo il buffer di lavaggio svolazzando ogni volta nel lavandino. Aggiungere 50 microlitri del substrato TrueBlue in ogni pozzo. Attendere da due a 15 minuti fino a quando le macchie non sono completamente definite con uno sfondo minimo.Dopo che le macchie sono visibili, lavare delicatamente con acqua usando una mano per proteggere il monostrato dalla forza dell'acqua che scorre. Toccare asciugare sugli asciugamani di carta. Poco dopo, utilizzare un ambito di sezionamento per contare manualmente i punti in ogni pozzo o utilizzare un contatore spot automatizzato.Nel software ImmunoCapture, selezionare una diluizione con focolai facilmente distinguibili tra 20 e 200 per pozzo per ogni campione e calcolare il tricipite in unità di messa a fuoco per millimetro utilizzando la media dei pozzi duplicati. In questo esperimento, il carico virale è stato mostrato nei tessuti del sistema nervoso periferico e centrale dopo che ai topi Ifnar è stato somministrato il virus Zika per via sottocutanea. Il limite di rivelazione era compreso tra 100 e 500 FFU per grammo, basato sull'organo.Quando si esegue il test di messa a fuoco, gli errori tecnici possono causare risultati non ottimali. La tossicità degli organi, guidata da un'alta concentrazione di fegato, ha alterato la sensibilità del saggio. Quando il titer virale nell'organo era inferiore alla tossicità, la FFA non riusciva a registrare con precisione i formicolio virali.Le cellule renali hanno illustrato la tossicità con un'alta concentrazione di organi, ma sono state superate dal titolo virale a basse concentrazioni di organi. La pipettazione o il lavaggio vigorosi possono rimuovere il monostrato, portando a una perdita di dati che riportano in modo impreciso i risultati del titolazione. Fibre o peli presenti nella carta assorbente da banco da laboratorio, possono contaminare i singoli pozzi e causare errori significativi se si utilizza un programma di conteggio automatizzato.La densità cellulare è un altro problema, che può avere un impatto drammatico sul successo di un saggio di messa a fuoco. Le cellule a circa il 60% di confluenza all'inizio del saggio, rispetto alle cellule placcate al 90% di confluenza, hanno mostrato una differenza drammatica che ha influenzato il saggio di formazione della messa a fuoco. Pianificare le dimensioni e la portata dell'esperimento in modo che la raccolta degli organi sia completata in modo efficiente, è la parte più importante della procedura, seguita dall'avvio del saggio di messa a fuoco con cellule di alta qualità.Questa procedura è stata utilizzata per quantificare il virus per più famiglie virali. Questo protocollo può anche essere adattato allo schermo per i composti terapeutici e quantificare i tintori di anticorpi neutralizzanti. Queste tecniche sono utilizzate per quantificare il virus vivo e devono essere prese misure di sicurezza appropriate secondo le linee guida stabilite nel BMBL.

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Immunologia e Infezioni

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