Progettare esperimenti di crescita cellulare automatizzati, ad alta produttività e continui utilizzando eVOLVER

eVOLVER offre ai ricercatori libertà sperimentale, la capacità di definire i propri esperimenti di crescita culturale con feedback automatizzato su più parametri e scalarlo in base alle dimensioni di cui hanno bisogno. eVOLVER è più flessibile di altri dispositivi. Gli utenti possono facilmente personalizzare il software in Python e l'hardware, modificando le maniche intelligenti che contengono sensori per ogni cultura.

Il sistema può sembrare complicato a prima vista con più componenti e connessioni. Una guida visiva offre agli utenti per la prima volta maggiore fiducia nell'esecuzione di esperimenti da soli. La corretta configurazione è fondamentale.

Assicurati di capire cosa fa ogni componente. Quindi puoi confermare che stanno funzionando. Assicurarsi che tutto sia indirizzato correttamente e collegato strettamente.

Mentre è progettato per la coltivazione aerobica di batteri e lieviti in condizioni variabili, eVOLVER potrebbe anche essere modificato per la fermentazione anaerobica o per mantenere le cellule di mammifero in sospensione. In questo video verrà illustrato come configurare, inizializzare ed eseguire un esperimento di impostazioni cultura continue ad alta velocità effettiva utilizzando la piattaforma eVOLVER. Il giorno prima dell'esperimento, prepara media, fiale e inoculo secondo il manoscritto.

In tre grandi becher preparare due becher di candeggina al 10% e un becher al 70% di etanolo. Utilizzando gli interruttori sul dispositivo eVOLVER, accendere l'alimentazione a cinque volt sull'eVOLVER, attendere cinque secondi, quindi accendere l'alimentatore da 12 volt. Se si eseguono più flaconcini dalla stessa bottiglia multimediale, collegare più linee di input multimediale con splitter di tubi.

Gli splitter di tubi personalizzati possono essere costruiti con componenti inferiori. Immergere le linee di ingresso del supporto nel primo becher bleach e le linee eflux dei supporti nel secondo becher bleach. Collegare l'estremità downstream delle linee di ingresso del supporto al secondo becher con le linee eflux.

Metti le linee di scarto in un carboy dei rifiuti. Aggiungere da uno a due litri di candeggina nel carboy di scarto per sterilizzare i rifiuti generati durante l'esperimento. Utilizzando il touchscreen sull'eVOLVER, passare alla sezione di configurazione ed eseguire tutte le pompe per 20 secondi per riempire le linee del fluido con il 10% di candeggina.

Lasciare riposare la candeggina nelle linee per almeno 30 minuti per sterilizzare. Eseguire nuovamente le pompe utilizzando il touchscreen fino a quando le linee non sono più sommerse, spingendo l'aria attraverso le linee per ottenere il maggior numero possibile di candeggina. Posizionare le linee di input del supporto nel becher di etanolo, riempire le linee con etanolo, sciacquarle con aria.

Quindi, collegare le linee di ingresso dei supporti alle bottiglie dei supporti con i connettori inferiori ed eseguire le pompe fino a quando il supporto non scorre completamente attraverso le linee scaricando l'etanolo residuo. Inserire parzialmente fiale sterilizzate nelle maniche intelligenti eVOLVER e collegare le linee di ingresso alla paglia a corto afflusso e le linee di scarto al long eflux strawq in base alla codifica a colori. Regolare il touchscreen eVOLVER per far funzionare tutte le pompe con incrementi di 10 secondi per riempire i flaconcini con i supporti.

Assicurate dall'ispezione visiva, le pompe eflux rimuovono in modo efficiente i supporti attraverso le cannucce eflux per evitare traboccamenti. Quindi, spingere le fiale verso il basso fino a quando non sono completamente racchiuse dalla manica intelligente. Nella pagina di configurazione interattiva del touchscreen eVOLVER trascinare un dito sul touchscreen o premere il pulsante Seleziona tutto per selezionare tutte le fiale e impostare le condizioni iniziali di temperatura a 30 gradi Celsius e l'agitazione su 10.

In un computer specificare il dispositivo eVOLVER su cui verrà eseguito l'esperimento. Assicurarsi che siano state selezionate le impostazioni di calibrazione desiderate. Aprire il dashboard eVOLVER e passare alla pagina Gestione esperimenti.

Selezionate l'esperimento base nel pannello Navigatore esperimento o un esperimento esistente come punto di partenza e fate clic su Clone. Passare alla pagina Editor esperimenti. Utilizzare i pannelli Selettore viale e Definizione parametro per regolare la temperatura a 30 gradi Celsius e impostare una soglia superiore e inferiore di OD per ogni flaconcino in base al progetto sperimentale.

Salvare l'esperimento facendo clic su Salva. Quindi fare clic sulla freccia per tornare alla pagina Gestione esperimenti e fare clic sul pulsante Riproduci per eseguire. Una volta avviato l'esperimento, passare al pannello Dati in tempo reale nella dashboard interattiva.

Per ogni flaconcino, verificare che i valori OD siano pari a zero. Sfoglia i grafici di temperatura per verificare che le temperature siano o progrediscano verso i 30 gradi Celsius. Per preparare l'inoculo, misurare prima l'OD delle colture notturne e calcolare la diluizione completa desiderata per le colture notturne assumendo un volume di flaconcino di 25 millilitri e un OD iniziale desiderato di circa 0,05.

Attraverso la porta di campionamento, pipettare il volume calcolato di inoculo o miscela di inoculi. Controlla i grafici sul dashboard per vedere che l'OD sta aumentando a 0,05. La crescita cellulare e le condizioni del flaconcino possono essere monitorate in tempo reale poiché l'esperimento è in corso, consentendo al ricercatore di intervenire in caso di problemi.

eVOLVER è una piattaforma di coltura continua automatizzata che consente il controllo multiparametro delle condizioni di coltura. Differenze qualitative sono state mostrate tra il tipo selvatico, la temperatura sensibile e i gruppi sensibili al sale quando i rapporti di log sono stati tracciati rispetto alle generazioni interpolate dai dati del tasso di crescita eVOLVER. Il colore indica la temperatura di selezione, mentre i trattini distinguono le concentrazioni di sale.

Una pendenza adatta attraverso la porzione lineare di ogni plot utilizzando un minimo di tre punti, produce un valore di forma fisica quantitativa che descrive come lo sforzo variante compete con lo sforzo di riferimento. I valori di forma fisica negativi indicano che lo sforzo variante è fuori competizione dal ceppo di riferimento. Controllare sempre che tutte le pompe siano funzionanti in modo efficiente e che le linee fluide siano a meno di eventuali zoccoli.

Un overflow può rovinare un esperimento e potenzialmente danneggiare le maniche intelligenti. I campioni prelevati da eVOLVER possono essere successivamente sequenziati per verificare la presenza di alterazioni genomiche a seguito dell'esperimento. Queste informazioni possono essere utilizzate per progettare nuovi ceppi o sistemi.

Per i ricercatori che utilizzano l'evoluzione del laboratorio o la selezione della libreria, è facile applicare pressioni di selezione uniche in ogni esperimento eVOLVER. Anche il controllo del feedback e gli ambienti dinamici sono ora molto accessibili. Il carboy di scarto conterrà piccole quantità di candeggina ed etanolo dopo un esperimento.

Consultare il coordinatore della sicurezza del laboratorio per un corretto smaltimento dei rifiuti.