Name: Uso della mellonella Invertebrate Galleria come modello di infezione per studiare il complesso di tubercolosi Mycobacterium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Scopri come utilizzare Galleria mellonella come modello alternativo per studiare la tubercolosi, riducendo i modelli mammiferi. Questo metodo permette di analizzare l'efficacia dei farmaci antimicobatterici.

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Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni del Biotechnology and Biological Science Research Council (BBSRC), assegnate a PRL e YL (BB/P001262/1), e del National Center for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3R) assegnato a PRL, SMN, BDR e YL (NC/R001596/1).

NOTA: Tutto il lavoro descritto di seguito deve essere svolto in un laboratorio CL2 all'interno di un mobile di sicurezza microbiologico di classe 2 (MSC) secondo le linee guida locali in materia di salute e sicurezza.
1. Preparazione di M. bovis BCG lux per l'infezione
<ol><li>Scongelare un glicerolo congelato da 1,2 mL (15%) stock di M. bovis BCG lux, il ceppo di vaccino di Montreal trasformato con la navetta plasmid pSMT1 portando i geni luxAB da Vibrio harveyi codifica l'enzima luciferasi19.</li>
	<li>Inolate 15 mL di brodo Middlebrook 7H9 contenente 0,2% glicerolo, 10% albumina, dextrose, catalasi (ADC) arricchimento e 50 g/mL hygromycin con uno scongelato 1,2 mL di BCG lux, in un etichettato 250 mL Erlenmeyer flask.</li>
	<li>Posizionare il pallone in un contenitore di biosicurezza sigillato e incubare a 37 gradi centigradi in un'incubatrice orbitale a 220 giri/min per 72 h (o fino a raggiungere la fase di crescita intermedia del log).</li>
	<li>Controllare la crescita della coltura lux BCG preparando 1:10 diluazioni della coltura nei tubi luminometrici utilizzando la salina tamponata di fosfato (PBS, pH 7.4, 0,01 M buffer fosfato, 0.0027 M di cloruro di potassio e 0,137 M di cloruro di sodio) in duplicato. Vortice, e caricare i tubi del luminometro nel luminometro e misurare la bioluminescenza (unità di luce relativa [RLU]/mL) utilizzando l'aldeide n-decito come substrato (1% v/v in etanolo assoluto)20. NOT:</</c8> Il rapporto tra rLU/colony forming units (CFU) era precedentemente determinato a essere 3:1 quando BCG lux è stato coltivato in vitro nel brodo Middlebrook 7H920.</li>
	<li>Centrifugare la coltura a 2.175 x g per 10 min a temperatura ambiente per pellet le cellule e scartare il solttante in un disinfettante appropriato con attività micobatericidale nota. Smaltire tutti i rifiuti di coltura con disinfettanti appropriati per i micobatteri seguendo le linee guida locali.</li>
	<li>Lavare due volte il pellet cellulare in PBS contenente lo 0,05% di polisasore 80 (PBS-T) per evitare l'agglomerazione batterica.</li>
	<li>Dopo il lavaggio finale, decant waste supernatant, risospendere il pellet micobatterico cellulare in PBS-T e diluire la sospensione micobatterica alla densità cellulare desiderata utilizzando misurazioni RLU.</li>
	<li>Preparare le diluizioni seriali di dieci volte dell'inoculum in piastre da 24 pozzetti utilizzando PBS-T. Piastra fuori 10 .L su Middlebrook 7H11 piastre di agar (0.5% glicerol, 50 g/mL igromycin, 10% acido oleico, albumina, dextrose, catalasi [OADC]) in duplicato per enumerare i conteggi CFU inoculum.</li>
</ol>2. Preparazione di G. mellonella Larve
<ol><li>Acquistare larve a stella ultima da fonti appropriate e mantenere le larve al buio a 18 gradi centigradi all'arrivo e utilizzare entro 1 settimana dall'acquisto. In alternativa, le larve possono essere allevate autonomamente seguendo il protocollo di Jojào et al.21. Per le larve acquistate, scartare eventuali larve morte, scolorite o pupating prima dello stoccaggio. NOT:</</c1> Larve pupa sono morfologicamente distinguibili fino alle ultime larve instar.</li>
	<li>Identificare e selezionare larve sane per la sperimentazione, sulla base di colore crema uniforme con poca o nessuna scolorimento (melanizzazione), dimensioni (2,3 cm di lunghezza), peso (circa 250 mg), mostrando un alto livello di motilità, e in possesso della capacità di destra se stessi quando girato.</li>
	<li>Contate attentamente le larve sane (minimo 20-30 per gruppo) in una piastra Petri (94/15 mm) rivestita con uno strato di carta da filtro (94/15 mm) utilizzando una pinzetta smussata per ridurre al minimo la contaminazione e conservarla a temperatura ambiente al buio fino all'uso.</li>
</ol>3. Infettare G. mellonella con BCG lux
<ol><li>Ridurre al minimo il disordine all'interno della MSC per ridurre il rischio di contaminazione e lesioni del bastone dell'ago.</li>
	<li>Preparare la piattaforma di iniezione toccando una carta da filtro circolare (94 mm) su una superficie rialzata piatta. Le superfici morbide o dure possono essere utilizzate e dipendono interamente dalle preferenze dell'utente, ad esempio i coperchi delle pipette box o una spugna di perlone in nylon.</li>
	<li>Sterilizzare un microsiringe da 25 L (25 G) aspirando 3 volumi del 70% di etanolo e risciacquare ulteriormente con 3 volumi di PBS-T sterile.</li>
	<li>Aspirate 10 L di BCG lux inoculum (preparato nella sezione 1) o PBS-T nella sterilizzata microsiringe 25 -L. Utilizzare una siringa separata per il controllo negativo PBS-T. NOT:</</c1> Risospendere l'inoculum di BCG dopo 10 iniezioni per garantire una sospensione cellulare uniforme.</li>
	<li>Utilizzare una pinzetta per raccogliere una larva e posizionare sulla piattaforma di iniezione.</li>
	<li>Sulla piattaforma, capovolgere la larva sulla sua schiena e immobilizzare fissando la testa e la coda con le pinzette. Individua l'ultimo conto alla rovescia sinistra dalla testa della larva e inserisci con attenzione la punta dell'ago (5-6 mm) con un angolo di 10-20 gradi rispetto al piano orizzontale. NOT:</</c3> Le pinzette corte e strette consentono una facile immobilizzazione con minimo stress larvale. Prestare attenzione a non superpenetrare che può forare l'intestino e causare non-BCG lux melanizzazione specifica o la morte.</li>
	<li>Contare le larve infette in un piatto Petri foderato con uno strato di carta da filtro, un singolo piatto Petri 90 mm può ospitare fino a 30 larve.</li>
	<li>Conservare il piatto Petri contenente le larve in una scatola scura ventilata o non sigillata all'interno di un'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.</li>
</ol>4. Monitoraggio della sopravvivenza di G. mellonella in seguito all'infezione
<ol><li>Nel corso del tempo, monitorare la sopravvivenza delle larve ogni 24 h. Le larve sono considerate morte quando non si muovono in risposta al tatto.</li>
</ol>5. Misurazione del fardello In Vivo di BCG lux in G. mellonella
<ol><li>Ad ogni momento, selezionare casualmente cinque larve infette precedentemente preparate nella sezione 3 e sterilizzare delicatamente le superfici larve utilizzando tamponi di cotone imbevuti di etanolo 70%. NOT:</</c0> Questo passaggio è importante quando placcatura larval omogenate per l'enumerazione CFU micobatterica come larve non sterilizzate può portare alla contaminazione.</li>
	<li>Posizionare le larve singolarmente in tubi a matrice liscida 2 mL contenenti 800 -L di PBS sterile.</li>
	<li>Omogeneizzare le larve utilizzando un omogeneizzatore per 60 s a 6,0 m/s.</li>
	<li>Centrifugare i tubi di lisciviatura a 3.500 x g per 5 s per rimuovere l'omogeneità dai coperchi e decantare con attenzione l'omogenea in tubi luminosi sterili singolarmente. NOT:</</c2> Per l'enumerazione CFU (passaggio 5.7), assicurarsi di riservare 100 L L di omogeneo in un tubo di reazione sterile da 1,5 mL.</li>
	<li>Recuperare l'omopure rimanente lavando i tubi a matrice di lising con 1 mL di PBS-T e pipette nei tubi luminometri corrispondenti.</li>
	<li>Vorticare i tubi del luminometro e misurare la bioluminescenza degli omogenei descritta in precedenza al punto 1.4.</li>
	<li>Preparare diluizioni seriali decuplicate dell'omogeneo in piastre di coltura a 24 pozzi utilizzando PBS-T. Piastra fuori 10 l della diluizione su Middlebrook 7H11 piastre di agar contenenti 0,5% glicerolo, 50 g/mL igromycina, 10% OADC e 20 g/mL piperacillin, per determinare il rapporto RLU/CFU del BCG lux a seguito di infezione in vivo. NOT:</</c4> Piperacillin elimina il nativo G. mellonella microbiota con inibizione della crescita minima di BCG lux16.</li>
</ol>6. Analisi statistiche
<ol><li>Tracciare la curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier utilizzando i dati raccolti ed eseguire il test Mantel-Cox (Log-rank) per determinare il significato del risultato, in cui <a0>p;0,05 </a0>, <a1>p</a1> & < 0.0001 e .p < 0.0001.</li>
</ol>

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<li>Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+validation+of+Galleria+mellonella+as+a+novel+model+organism+to+study+Mycobacterium+abscessus+infection%2C+pathogenesis%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), e02539-17 (2018).</li>
<li>Entwistle, F. M., Coote, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+greater+wax+moth+larvae%2C+Galleria+mellonella%2C+as+a+novel+in+vivo+model+for+non-tuberculosis+mycobacteria+infections+and+antibiotic+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments.</a> Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).</li>
<li>Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li>
<li>Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+whole+blood+assay+to+measure+viability+of+mycobacteria%2C+using+reporter-gene+tagged+BCG+or+M.Tb+%28BCG+lux%2FM.Tb+lux%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux).</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3332-e3332 (2011).</li>
<li>Jorjão, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+moths+to+caterpillars%3A+Ideal+conditions+for+Galleria+mellonella+rearing+for+in+vivo+microbiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies.</a> Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).</li>
<li>Kavanagh, K., Sheehan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Galleria+mellonella+larvae+to+identify+novel+antimicrobial+agents+against+fungal+species+of+medical+interest%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi%22%5BJournal%5D)">The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 113(2018).</li>
<li>Champion, O., Titball, R., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+G.+mellonella+larvae+to+provide+reliable+and+reproducible+results+in+the+study+of+fungal+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi%22%5BJournal%5D)">Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens.</a> Journal of Fungi. 4 (3), 108(2018).</li>
<li>Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cold+shock+on+the+immune+response+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella+after+infection+with+entomopathogenic+bacteria+Bacillus+thuringiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Maria+Curie-Sklodowska+University%22%5BJournal%5D)">The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis.</a> Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).</li>
<li>Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+passaging+in+liquid+media+and+storage+on+Mycobacterium+bovis+-+BCG+growth+capacity+and+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity.</a> FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).</li>
<li>De Groote, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+studies+evaluating+mouse+models+used+for+efficacy+testing+of+experimental+drugs+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'uso di G. mellonella come modello di infezione è stato stabilito per un certo numero di patogeni batterici e fungini per lo studio della virulenza, dell'interazione ospite-patogeno, e come schermo per nuove terapie10,22. La discussione seguente si basa sulla procedura sperimentale per l'utilizzo di G. mellonella come modello di infezione per la MTBC.
La salute delle larve ingenue prima della sperimentazione...

La tubercolosi (TB) è una grave minaccia per la salute pubblica globale, con 9 milioni di nuovi casi all'anno e 1,5 milioni di decessi1. Inoltre, si stima che un quarto della popolazione mondiale sia infettato dall'agente causale della malattia, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Tra la popolazione infetta, il 5-10% svilupperà una malattia da TB attiva nel corso della loro vita. Inoltre, l'emergere e la diffusione di Mtb multifarmacoresistenti (MDR) e ampiamente resistenti ai farmaci (XDR) rappresenta una grave minaccia per il controllo delle malattie, con 123 paesi che riportano almeno un caso XDR1. Il trattamento della tBC richiede un cocktail di almeno quattro farmaci anti-micobatterici, di cui isoniazid e rifampicina sono prescritti per una durata minima di sei mesi; trattamento è spesso associato a effetti collaterali complessi e tossicità. La protezione dall'unico vaccino autorizzato contro la TUBErcolosi, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), è variabile2. Una comprensione incompleta della patogenesi della TB ostacola significativamente lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche e di vaccinazione.
Per decenni i modelli di infezione animale sono stati fondamentali per la ricerca sulla TB per comprendere la patogenesi di base e la risposta dell'ospite all'infezione e per valutare nuovi agenti anti-micobatterici, immuno-terapie e nuovi candidati al vaccino3, 4.Tuttavia, la ricerca che utilizza modelli di infezione animale di TB è notoriamente difficile in quanto la patogenesi e la progressione dell'infezione da TB sono complesse, e non esiste un singolo modello animale che imita l'intero spettro e le caratteristiche importanti della malattia5 ,6. Inoltre, gli esperimenti sugli animali sono costosi, richiedono molto tempo per intraprendere e richiedono una giustificazione etica completa. Tuttavia, i modelli di infezione animale di TB sono stati descritti in primati non umani (ad esempio, macachi), porcellini d'India, conigli, bovini, maiali, topi e pesci zebra, ciascuno con i loro limiti3,4. Il modello murino è il modello più comunemente usato a causa del costo, della disponibilità di linee inbred, della riproducibilità dell'infezione e dell'abbondanza di reagenti immunologici. Tuttavia, in genere non formano granulomi associati a aree di ipossia che sono caratteristiche dell'infezione da tubercolosi latente (LTBI)6. I maiali della Guinea sono altamente sensibili all'infezione da Mtb, con patologia e formazione precoce di granuloma simili a quelli nell'uomo, e sono ampiamente utilizzati nei test sui vaccini; tuttavia la mancanza di reagenti immunologici ne ostacola l'uso come modello di infezione7. I pesci zebra sono adatti per lo screening su larga scala in studi preclinici in fase iniziale a causa delle loro piccole dimensioni, della rapida riproduzione e degli strumenti genetici avanzati, ma sono anatomicamente e fisiologicamente diversi dall'uomo e sono suscettibili solo Mycobacterium marinum infezione3. I modelli animali più simili all'infezione umana da Mtb sono primati non umani (ad esempio, il macaco), ma sono costosi e hanno considerazioni etiche e pratiche significative che limitano notevolmente il loro uso8.
La larva di insetti della falena di cera maggiore o facaccia,Galleria mellonella, sono diventati sempre più popolari come modello di infezione per una varietà di patogeni batterici e fungini9, e come schermo per nuovi candidati farmaco antimicrobico 10. G. mellonella è un modello di invertebrato di successo grazie al suo sofisticato sistema immunitario innato (composto da difese cellulari e umorali) che condivide un alto grado di somiglianza strutturale e funzionale con quello dei vertebrati11 . Ciò include meccanismi immunitari come la fagocitosi degli agenti patogeni da parte degli emociti (funzionalmente simili al macrofago mammifero e ai neutrofili)12,13, la produzione e la circolazione di peptidi antimicrobici (AMP) e proteine complementari all'interno dell'emolina (analoga al sangue dei mammiferi) di G. mellonella11. Altri vantaggi9,14,15 di G. mellonella larve come modello includono 1) le loro grandi dimensioni (20-30 mm) che consente una facile manipolazione e infezione, così come la raccolta di tessuto e eterogenea per le analisi, 2) facile manutenzione a 37 gradi centigradi, compatibile per lo studio di agenti patogeni umani, 3) infezione precisa per iniezione senza la necessità di anestesia, 4) l'efficacia degli agenti antimicrobici può essere valutata utilizzando meno farmaco per la valutazione, 5) mancanza di mancanza di sono necessari vincoli etici rispetto all'uso di mammiferi, 6) di grandi dimensioni di gruppo rispetto ai modelli animali che consentono una maggiore riproducibilità e sono necessari 7) tempi più brevi per gli esperimenti di infezione.
In uno studio recente, abbiamo dimostrato che G. mellonella può essere utilizzato come un nuovo modello di infezione per studiare la patogenesi dell'infezione da bioluminescente M. bovis BCG lux, una versione geneticamente modificata del ceppo vaccino e membro del complesso Mtb (MTBC)16. Mentre G. mellonella è stato precedentemente utilizzato come modello di infezione per micobatteri non tubercolari (NTM), principalmente M. marinum e Mycobacterium abscessus17,18, gli studi utilizzando MTBC sono limitati a quella di Li et al.16. I ceppi miobatterici bioluminescenti non patogeni, che possono essere utilizzati a livello di contenimento (CL) 2 come surrogato per Mtb, offrono i vantaggi di sicurezza e praticità rispetto ai micobatteri patogeni. Dopo l'infezione da BCG lux, le larve iniziano a sviluppare strutture antiche simili a granuloma, che potrebbero fornire preziose informazioni sul ruolo dell'immunità innata nella creazione di infezione da TB16. Inoltre, questo semplice modello di infezione da invertebrati ha il potenziale per fornire una valutazione rapida, a basso costo e affidabile della patogenesi della TB che incorpora sfide controllate e repliche multiple per la riproducibilità. Inoltre, il modello ha il potenziale per essere utilizzato per vagliare nuovi farmaci anti-TB e vaccini candidati nello sviluppo precoce, riducendo il numero complessivo di animali in sperimentazione. Anche la capacità di misurare i cambiamenti nella struttura dell'ospite e dell'agente patogeno, il trascrittoma e il proteoma per determinare gli obiettivi dei farmaci e valutare i meccanismi di azione di nuovi farmaci e vaccini terapeutici, sono vantaggiosi.
Qui descriviamo i protocolli sperimentali per la preparazione di una bioluminescente M. bovis BCG lux inoculum e G. mellonella larva per l'infezione micobatterica, così come la determinazione sia della larva che del micobatterico sopravvivenza in risposta all'infezione.

<table><tbody><tr><td>Provetta di reazione da 1,5 mL (Eppendorf)</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>20, 200 e 1.000 &micro; L pipetta e puntali filtrati</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura a 24 pozzetti</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Pipette da 25 mL e pipetta ragazzo</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri a 3 scomparti (94/15 mm)</td><td>Greiner</td><td>637102</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Armadio di sicurezza di classe II</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td>n/ un</td><td></td></tr><tr><td>pallone di Erlenmeyer con tappo ventilato (250 mL)</td><td>Corning</td><td>CLS40183</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (>99,7%)</td><td>VWR</td><td>208221.321</td><td></td></tr><tr><td>Galleria mellonella (250 per confezione)</td><td>Livefood Direct UK</td><td>W250</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5150</td><td></td></tr><tr><td>Homogeniser (FastPrep-24 5G)</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>Igromicina B</td><td>Corning</td><td>30-240CR</td><td></td></tr><tr><td>Luminometro (Autolumat LB 953)</td><td>Berthold</td><td>34622</td><td></td></tr><tr><td>Tubi luminometrici</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Matrice di lisi (S, 2,0 mL)</td><td>MP Biomedicals</td><td>116925500</td><td></td></tr><tr><td>Micro siringa (25 &; micro; L, 25 G)</td><td>SGE</td><td>3000</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H11 agar</td><td>BD Bioscience</td><td>283810</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 brodo</td><td>BD Bioscience</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook ADC arricchimento</td><td>BD Bioscience</td><td>212352</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook OADC arricchimento</td><td>BD Bioscience</td><td>212240</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium bovis BCG lux</td><td>Various</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>n-decil aldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7384-100G</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore orbitale ad agitazione</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbato 80 (Tween-80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8074-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Scatola piccola</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td>n/a</td><td>scatola scura ventilata o non sigillata consigliata</td></tr><tr><td>Pinzetta</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td>n/a</td><td>Pinzetta lunga a punta corta e stretta/smussata Winterm</td></tr><tr><td>(V1.08)</td><td>Berthold</td><td>n/a</td><td>Programma LB953. TTB</td></tr><tr><td>Petri dish (94/15 mm)</td><td>Greiner</td><td>633181</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro (94 mm)</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td>n/a</td><td>Taglio su misura</td></tr></tbody></table>

uso della mellonella invertebrate galleria come modello di infezione per studiare il complesso di tubercolosi mycobacterium

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

La tubercolosi è la principale causa globale di mortalità per malattie infettive e si ritiene che circa un quarto della popolazione mondiale sia infettata da Mycobacterium tuberculosis. Nonostante decenni di ricerca, molti dei meccanismi alla base del successo di M. tuberculosis come organismo patogeno rimangono da studiare, e lo sviluppo di farmaci antimicobatterici più sicuri e più efficaci sono urgentemente necessari per affrontare l'ascesa e diffusione della tubercolosi farmacoresistente. Tuttavia, la progressione della ricerca sulla tubercolosi è collodiata dai modelli di infezione tradizionale dei mammiferi che sono costosi, dispendiosi in termini di tempo e eticamente impegnativi. In precedenza abbiamo stabilito le larve dell'insetto Galleria mellonella (maggiore falena di cera) come un nuovo modello di infezione riproducibile, a basso costo, ad alto consumo e eticamente accettabile per i membri del complesso M. tuberculosis. Qui descriviamo la manutenzione, la preparazione e l'infezione di G. mellonella con Mycobacterium bovis BCG lux bioluminescente. Utilizzando questo modello di infezione, si può osservare la virulenza dipendente dalla dose micobatterica e una rapida lettura del carico micobatterico in vivo utilizzando le misurazioni della bioluminescenza è facilmente realizzabile e riproducibile. Sebbene esistano limitazioni, come la mancanza di un genoma completamente annotato per l'analisi trascrittomica, è possibile effettuare analisi ontologiche contro gli insetti geneticamente simili. Come modello a basso costo, rapido ed eticamente accettabile per la tubercolosi, G. mellonella può essere utilizzato come pre-schermo per determinare l'efficacia e la tossicità del farmaco e per determinare la virulenza micobatterica comparativa prima dell'uso di mammiferi convenzionali Modelli. L'uso del modello G. mellonella-mycobacteria porterà a una riduzione del numero sostanziale di animali attualmente utilizzati nella ricerca sulla tubercolosi.

Qui presentiamo dati rappresentativi che possono essere ottenuti utilizzando il modello di infezione G. mellonella - BCG lux ed evidenziano i benefici di G. mellonella come modello di infezione per i membri della MTBC (Figura 1). Le procedure sperimentali con punti tecnici chiave sono descritte nella Figura 2.
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Galleria mellonella è stata recentemente fondata come un modello di infezione riproducibile, economico ed eticamente accettabile per il complesso della tubercolosi Mycobacterium. Qui descriviamo e dimostriamo i passi compiuti per stabilire l'infezione di successo di G. mellonella con Mycobacterium bovis BCG lux bioluminescente.

Uso della mellonella Invertebrate Galleria come modello di infezione per studiare il complesso di tubercolosi Mycobacterium

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Questo protocollo descrive l'uso della Galleria mellonella come modello di infezione alternativo per studiare la tubercolosi, riducendo il numero di modelli di mammiferi utilizzati nella ricerca. Rispetto ai modelli tradizionali di mammiferi come i topi, Galleria mellonella è un modello più economico, eticamente accettabile e più accessibile per studiare la tubercolosi. Un'ulteriore ottimizzazione di questo modello consentirà lo screening dell'efficacia e della tossicità dei farmaci antimicobatterici candidati e contribuirà allo sviluppo di nuove terapie urgenti per la tubercolosi.Galleria mellonella possiede un complesso sistema immunitario innato paragonabile a quello dei mammiferi. Lo studio dell'interazione ospite-patogeno può rivelare ulteriormente il ruolo dell'immunità innata nella tubercolosi. L'uso della Galleria mellonella come modello di infezione non si limita alla tubercolosi ed è stato ampiamente utilizzato per altri agenti patogeni batterici e fungini nell'ultimo decennio.Per iniziare, scongelare uno stock congelato di glicerolo da 1,2 millilitro di Mycobacterium bovis BCG lux, il ceppo vaccinale di Montreal trasformato con il pSMT1 plasmide shuttle che trasporta i g

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Orale e infezioni intra haemocolic di larve della tarma della cera...

L&#39;insetto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Come un modello di infezione potente per Indagare Patogenesi batterica

Questo video mostra un metodo per stabilire un modello di infezione da Mycobacterium bovis nelle larve della falena della cera maggiore, Galleria mellonella. Un ceppo bioluminescente di Mycobacterium bovis BCG viene iniettato nell'emolinfa della larva per stabilire l'infezione e la bioluminescenza viene misurata a intervalli predefiniti per studiare il progresso dell'infezione.

Una tecnica per stabilire un modello di infezione batterica nelle larve di insetti

Questo video mostra la misurazione della carica batterica in vivo utilizzando Bacillus Calmette-Guérin, BCG, larve di insetti infetti da lux. Il processo prevede l'omogeneizzazione larvale, il trattamento con un substrato di luciferasi e la misurazione della bioluminescenza per determinare le unità di luce relative correlate alla carica batterica.

Misurazione del carico in vivo di batteri che esprimono la luciferasi in una larva di insetto

La larva di tarma della cera Galleria mellonella è stato recentemente stabilito come un modello in vivo per studiare l'infezione da Legionella pneumophila. Qui, dimostriamo tecniche fondamentali per caratterizzare la patogenesi della Legionella nelle larve, tra cui l'inoculazione, la misurazione della virulenza batterica e la replica così come l'estrazione e l'analisi delle hemocytes infetti.

Uso di<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Come organismo modello per studiare<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infezione

Descriviamo l'imaging ottico dei topi infettati con la tubercolosi del micobatterio (M. tuberculosis) usando la fluorescenza di enzima reporter (REF). Questo protocollo facilita la rilevazione sensibile e specifica di M. tuberculosis in modelli animali preclinici per la ricerca di patogenesi, terapeutica e vaccino.

Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging

Galleria mellonella serve come un modello di invertebrati marini per candidosi diffusa. Qui, abbiamo dettaglio l'infezione protocollo e fornire dati di supporto per l'efficacia del modello.

Il modello di infezione del Waxworm di Galleria mellonella per candidosi disseminata

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per un modello di somministrazione orale utilizzando larve di Galleria mellonella e come caratterizzare indotto risposte immunitarie innate. Usando questo protocollo, i ricercatori senza esperienza pratica sarà in grado di utilizzare la mellonella g. alimentazione forzata di metodo.

Un modello di amministrazione orale Galleria mellonella a risposte immunitarie Innate Study Commensal-Induced

Questo studio presenta un quadro standardizzato per l'ottimizzazione dei modelli di infezione da G. mellonella da utilizzare nella valutazione antimicrobica preclinica. L'applicazione di un modello di G. mellonella come parte di una pipeline di sviluppo antimicrobico preclinico potrebbe ridurre il numero di composti inefficaci che progrediscono verso gli studi clinici.

Galleria mellonella come modello di screening antimicrobico

Qui presentiamo un protocollo per l'esecuzione di un'inoculazione intradermica a basse dosi di Mycobacterium avium in un orecchio di topo per riflettere le condizioni di esposizione.

Inoculazione intradermica di Mycobacterium avium nell'orecchio del topo

Qui presentiamo un protocollo per l'imaging intravitale di Mycobacterium tuberculosis approvato BSL-2 attenuato. Ceppo nel polmone murino utilizzando una finestra polmonare permanente. Questo approccio consente un'analisi longitudinale a risoluzione monocellulare delle prime interazioni ospite-patogeno, inclusa localizzazione bacillare, dinamica vascolare e assorbimento di macrofagi nello stesso microambiente polmonare.

Imaging intravitale dell'attenuazione dell'Auxotrophic Mycobacterium tuberculosis nel polmone murino durante l'infezione intravascolare precoce

Scopri come utilizzare Galleria mellonella come modello alternativo per studiare la tubercolosi, riducendo i modelli mammiferi. Questo metodo permette di analizzare l'efficacia dei farmaci antimicobatterici.

Uso della mellonella Invertebrate Galleria come modello di infezione per studiare il complesso di tubercolosi Mycobacterium

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