Quantificazione dell'attività chemiotatica monocite in vivo e caratterizzazione dei macrofagi derivati monociti del sangue

Questa metodologia ci consente di quantificare l'attività chemiotattica del monocita di sangue negli animali vivi e di studiare l'effetto di diete povere sulla funzione dei monociti e sui loro meccanismi sottostanti. I macrofagi derivati dai monociti possono essere isolati e analizzati utilizzando vari approcci, tra cui tecniche a singola cellula e omica che forniscono un'istantanea dello stato del sito di monociti nel sangue nei modelli di topo. La procedura di oggi sarà condotta dal dottor Young Joo Ahn, un professore assistente nel mio laboratorio, e dal dottor Luxi Wang, un postdoc nel mio laboratorio.

Prima di iniziare la procedura, pulire il cappuccio di coltura cellulare con disinfettante e scongelare completamente la soluzione derivata dalla membrana basale ridotta dal fattore di crescita sul ghiaccio. Equipaggiare singole siringhe sterili da un millilitro con aghi calibro 26 e posizionare gli aghi sul ghiaccio. Una volta scongelata la soluzione, pulire la parte superiore della fiala di soluzione derivata dalla membrana del seminterrato con un tampone alcolico prima di caricare 500 micro litri di soluzione integrati con o senza attrattore di chemio in ogni siringa millilitro.

Quindi rimuovere eventuali bolle d'aria dalla siringa caricata in soluzione derivata dalla membrana del seminterrato per garantire una formazione uniforme della spina. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedino, iniettare lentamente un intero volume di soluzione derivata dalla membrana basale senza MCP-1 aggiunto a circa 100 micro litri al secondo per via sottocutanea nel fianco destro del mouse anestetizzato. E tutti i 500 micro litri di soluzione derivata dalla membrana basale integrati con MCP-1 nel fianco sinistro dell'animale.

Tenere la siringa in posizione da 20 a 30 secondi dopo l'iniezione per evitare perdite della soluzione e consentire la forma di un'unica spina di gel liscia prima di posizionare il mouse su una pastiglia riscaldante con monitoraggio fino al pieno recupero. Tre giorni dopo l'iniezione, rimuovere i capelli dorsali da un animale iniettato a spina e utilizzare le forcep per afferrare la pelle intorno alla vertebra toracica inferiore e lombare superiore. Fai un'incisione lunga due millimetri nella pelle e taglia lungo la linea mediana della parte posteriore del topo dalle vertebre cervicali fino a un centimetro sopra la giunzione vertebrale della coccola.

Separare la pelle dallo strato muscolare e fissare la pelle su una piattaforma di schiuma di polistirolo. Successivamente, al microscopio sezionato, afferrare attentamente la capsula fibrosa che contiene il tappo di gel derivato dalla membrana basale e utilizzare forcep fini per rimuovere la capsula fibrosa. Quindi utilizzare forbici fini per pulire la spina.

Quindi trasferire il tappo di gel derivato dalla membrana del seminterrato pulito in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri opportunamente etichettato e pesato. Riascolta il tubo per calcolare il peso della spina di gel derivata dalla membrana del seminterrato. Per la digestione del tappo di gel derivato dalla membrana basale, utilizzare forbici fini pulite per tritare il tappo di gel derivato dalla membrana del seminterrato in ogni tubo di micro centrifuga e aggiungere 800 micro litri di sfollati alle spine.

Vortice alla velocità massima per 10 secondi per interrompere le spine e posizionare i tubi di micro centrifuga a 37 gradi Celsius per due ore in un termo miscelatore a 1400 rotazioni al minuto per sciogliere completamente i tappi di gel derivati dalla membrana del seminterrato. Al termine dell'incubazione, sedimentare i frammenti del tappo per centrifugazione due volte e rimospendare i pellet in 300 microlitri di PBS. Trasferire 50 microlitri di ogni sospensione cellulare in nuovi tubi di microfuga ed etichettare le celle nei nuovi tubi con 0,5 microlitri di calcina.

Dopo un'incubazione di 10 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica, contare il numero di fluorescenti verdi vivi positive e cellule non fluorescenti morte su un contatore di celle automatizzato. Per un'analisi western blot a singola cella, aggiungere un millilitro di sospensione diluita a singola cella a un chip western blot a singola cella reidratato nella parte inferiore di una piastra di petri di 10 centimetri. Dopo cinque o 15 minuti, esaminare il chip sotto microscopia a campo brillante.

Circa il 15-20% dei micro pozzi dovrebbe essere occupato da una singola cellula e meno del due per cento dei pozzi dovrebbe contenere due o più celle. Se il chip è stato caricato correttamente, inclinare il piatto di 45 gradi e lavare il chip tre volte con tampone di sospensione per rimuovere eventuali celle non capturate. Dopo l'ultimo lavaggio, accuratamente e caricare il chip nella cella di elettroforesi di uno strumento occidentale a singola cella, lato gel verso l'alto, e coprire l'intero chip western blot a singola cella con tampone di funzionamento di lysis.

Avviare lalisi cellulare ed eseguire lo strumento secondo i parametri di esperimento appropriati. Alla fine della corsa, sciacquare il chip con due lavaggi di 10 minuti con tampone di lavaggio fresco per lavaggio a temperatura ambiente. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 80 microlitri della soluzione anticorpale primaria di interesse per la camera di sondaggio anticorpale e abbassare il lato gel del chip verso il basso in modo che la soluzione anticorpale assorba attraverso il chip.

Dopo due ore a temperatura ambiente, lavare il truciolo tre volte nel tampone di lavaggio e una volta in acqua su uno shaker. Incubare il truciolo con un anticorpo secondario appropriato per un'ora a temperatura ambiente protetta dalla luce. Alla fine dell'incubazione, lavare il chip tre volte con il tampone di lavaggio e ruotare il chip su uno spinner di scorrimento per rimuovere l'eventuali tamponi di lavaggio rimanenti.

Per rimuovere il chip western blot a cella singola, posizionare un rack di tubi da 15 millilitri in un bagno d'acqua di 60 gradi Celsius con l'acqua a solo un centimetro sopra il rack. In una cappa aspirante aggiungere 40 millilitri di tampone di stripping e 320 microlitri di etanolo beta morcepta a un contenitore. Posizionare il chip in una piastra di petri di 10 centimetri all'interno del contenitore e sigillare il contenitore con Parafilm.

Quindi posizionare il contenitore all'interno del portatubi nel bagno d'acqua. Dopo 90 minuti, trasferire accuratamente il chip in una nuova piastra di Petri e lavare brevemente il chip una volta con tampone di lavaggio prima di aggiungere 15 millilitri di tampone di lavaggio fresco alla piastra di Petri per un lavaggio di 15 minuti sullo shaker. In questo esperimento rappresentativo, le cellule reclutate in ogni spina sono state conteggiate a uno, tre e cinque giorni dopo l'iniezione.

Sottraendo il numero di celle nelle spine caricate dal veicolo dal numero di celle nelle spine caricate MCP-1, è stato quindi calcolato il numero di celle specificamente reclutate in risposta all'attrattore di chemio. Nel periodo di cinque giorni è stato osservato un reclutamento e un accumulo specifici di cellule MCP-1 accelerati, con tassi che aumentano da 31.000 cellule al giorno dopo un giorno di iniezione fino a 136.000 cellule al giorno, cinque giorni dopo l'iniezione. L'analisi western blot a singola cellula è stata quindi utilizzata per identificare i diversi tipi di cellule reclutate nei tappi derivati dalla membrana basale, in base alla loro espressione di specifici marcatori di cellule immunitarie di interesse.

Ad esempio, la percentuale di monociti all'interno dei tappi di gel derivati dalla membrana basale caricati MCP-1 era bassa al primo giorno e ha raggiunto il picco al terzo giorno prima di scendere di nuovo al quinto giorno, mentre il numero di macrofagi è aumentato costantemente durante il periodo di studio. Per le spine caricate MCP-1, la percentuale di monociti più macrofagi all'interno della popolazione cellulare isolata era più alta al terzo giorno, indicando che dopo tre giorni, la stragrande maggioranza delle cellule reclutate dalla chemiotassi dipendente mcp-1 erano monociti e macrofagi. Anche se il numero totale di monociti più macrofagi è tipicamente più alto al quinto giorno rispetto al terzo giorno, il numero di cellule al terzo giorno riflette più accuratamente il sangue periferico di chemiotassi monocite e reclutamento, e quindi il terzo giorno è raccomandato per le analisi della spina diretta della membrana basale.

Il successo dell'acquisizione di singole celle per l'analisi a valle dipende dall'accuratezza dell'iniezione e dalla rimozione completa delle spine. Citometria a flusso, blotting occidentale a singola cellula, sequenziamento dell'RNA alla rinfusa o a singola cella e altre procedure omiche possono essere utilizzate per valutare le caratteristiche e i fenotipi dei macrofagi reclutati monociti e derivati dai monociti.